التقنيات الجراحية لموضع القسطرة واستئصال 5/6 في نماذج مورين للغسيل الكلوي البريتوني

Summary

يوضح هذا المقال طريقة للموضع الجراحية في الفئران القسطرة داخل تعلق على منفذ وصول التي يتم وضعها في الجزء الخلفي من الحيوان. وعلاوة على ذلك، وهذا ما يفسر الإجراء المتعلق استئصال 5/6 ليشابه الدولة يوريمي المرضى PD.

Abstract

الديلزه الصفاقيه (PD) هو علاج الاستبدال كلوي متسقة على الإدارة والانتعاش اللاحق للسائل الملين في التجويف الصفاقى لاستنزاف المياه والسامة من الأيض وظيفيا كفاية الكلي غير قادرة على القضاء عليها. ولسوء الحظ، أن هذا الإجراء تتدهور الصفاق. يؤدي تلف الأنسجة بداية التهاب للشفاء من الإصابة. إذا استمرت الإصابة ويصبح التهاب مزمن، فإنه قد يؤدي إلى التليف، وأمر شائع في العديد من الأمراض. PD والتهاب مزمن وتليف، جنبا إلى جنب مع عمليات محددة أخرى تتصل بهذه البلدان، تؤدي إلى تدهور القدرات ultrafiltration، مما يعني الفشل ووقف اللاحقة لهذا الأسلوب. العمل مع العينات البشرية يوفر معلومات حول هذا التدهور ولكنه يعرض القيود التقنية والأخلاقية للحصول على خزعات. نماذج حيوانية ضرورية لدراسة هذا التدهور نظراً إلى أنها في التغلب على أوجه القصور هذه.

وضع نموذج ضخ ماوس مزمنة في عام 2008، الذي يستفيد من مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا، فتح إمكانية دراسة الآليات التي ينطوي عليها. ويستخدم هذا النموذج مخصص جهاز مصمم للفئران، تتألف من قسطرة المرفقة إلى منفذ وصول التي تم وضعها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الحيوان. ويتجنب هذا الإجراء المستمر ثقب الصفاق خلال التجارب الطويلة الأجل والحد من العدوى والتهاب بسبب حقن. وبفضل هذا النموذج، وقد تتميز البريتوني الأضرار الناجمة عن التعرض المزمن للسوائل PD والتضمين. هذا الأسلوب يسمح ضخ كميات كبيرة من السوائل ويمكن استخدامها لدراسة الأمراض الأخرى ضروري فيها التطعيم من عقاقير أو مواد أخرى على مدى فترات طويلة من الزمن.

يوضح هذا المقال طريقة لوضع القسطرة الجراحية في الفئران. وعلاوة على ذلك، وهذا ما يفسر الإجراء المتعلق استئصال 5/6 لتقليد دولة موجودة في المرضى PD الكلوي.

Introduction

وظائف الكلي وأمراض الكلي

الكلي هي الأجهزة الأساسية المعنية بالتوازن وتنقية الدم وإنتاج الهرمونات. وهناك مختلف الظروف التي تؤدي إلى الفشل الكلوي وإلى بداية اللاحقة من أورميا، التي قد تم تعريفها بأنها مجموعة الأعراض الجهازية بسبب تراكم الفضلات في الدم الاحتفاظ بسبب اضطرابات وظيفة الكلي¹. وعلاوة على ذلك، نظراً لإمكانية التماثل الساكن يتأثر أيضا عندما يكون هناك فشل كلوي، ارتفاع ضغط الدم بسبب الحمل الزائد لوحدة التخزين قد تحدث، هو أمر خطير كما أنه يمكن أن يؤدي إلى فشل القلب¹. عندما تكون القدرة الوظيفية للكلى أقل من 10% إلى 15%، المريض يجب أن يخضع لأحد الخيارات العلاجية التالية: غسيل الكلي والغسيل الكلوي البريتوني (PD) أو زرع الكلي.

PD هو خيار مثيرة لاهتمام الذي يسمح للمرضى مواصلة العلاج من الراحة من منازلهم أو عمليا في أي مكان، وبالتالي تجنب الحاجة إلى مستشفى كثرة الزيارات والإقامة. تقنية PD يزيل جزيئات سامة صغيرة والمياه الزائدة الناتجة عن الجسم² عن طريق تقطير السوائل ناضح (الغسيل الكلوي البريتوني السوائل، قوات الدفاع الشعبي) في التجويف الصفاقى. ينشئ هذا تقطير ناضح التدرج اللازمة لتبادل الذوائب والمياه بين الشعرية البريتوني وقوات الدفاع الشعبي، عملية تعرف باسم أولترافيلتريشن (الجبهة المتحدة).

البريتوني الضرر الناجم عن الغسيل الكلوي البريتوني

التجويف الصفاقى مغطى بغشاء (م) تتألف من أحادي الطبقة الخلايا mesothelial يستريح في مصفوفة، الذي يضم أيضا بعض الأوعية الدموية والليفية والضامة والسكان خلية أخرى. ولسوء الحظ، الغشاء البريتوني دائماً يعاني بعض التعديلات أثناء العلاج PD، مثل المبرمج وفقدان الخلايا mesothelial، وانتقال mesenchymal mesothelial (MMT) والخلايا البطانية (نهاية-MT)، تجنيد الخلايا التحريضية و فيبروسيتيس، التعديلات والأوعية الدموية، والأوعية، ليمفانجيوجينيسيس و/أو التليف^3،4،5،،من^67،،من⁸⁹. هذه التعديلات المسؤولة عن تطوير الجبهة المتحدة القدرة فشل¹⁰، الذي يحول دون استمرار العلاج، التي تتطلب أن المريض يجب أن يحصل علاج بديل البقاء على قيد الحياة (غسيل الكلي أو زرع الكلي) . ولذلك، من الضروري لهؤلاء المرضى، إلى تأخير أو التحكم في تنمية هذه التعديلات البريتوني.

كان قد تردد أن أورميا وحدها قد يسبب التهاب¹¹، ولكن أهم العوامل المحلية بيوينكومباتيبيليتي PDF. معظم ملفات Pdf استخدام الجلوكوز كعامل ناضح، مما يسبب التهاباً. سبب PDF مرات التخزين والتعقيم، يعاني الجلوكوز عملية تدهور، وظهور منتجات جديدة من رد الفعل هذا، توليد المزيد من التهاب،^12،MMT والمبرمج¹³. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا إمكانية للأضرار الميكانيكية بسبب طريقة تقطير. كل هذه العوامل، يتصرفون بشكل مستمر، يمكن أن تولد دولة تحريضية المستمرة والمتكررة، مما يؤدي إلى التهاب مزمن، مما يقود إلى تدهور الأغشية، وقاطع، فشل الجبهة المتحدة. كيف يمكن تخفيض أو تجنب هذا الضرر لا يزال مدعاة للدراسة.

تحليل وضع الآفات: من العينات البشرية لنماذج حيوانية

العمل مع خزعات البشرية عاملاً مقيداً بسبب صعوبة الحصول على عينات الأنسجة. يمكن الحصول على هذه العينات فقط من الجراحات إجراؤها بسبب عطل القسطرة أو الزرع، عادة بعد سنوات من العلاج PD. هذا النهج مفيداً لتحليل التغيرات المرضية التي عانت من غشاء البريتوني مكشوف لقوات الدفاع الشعبي، ولكن لا يكفي لدراسة تطور العملية. إمكانية أخرى لتحليل الخلايا التي استنزفت من مياه الغسيل الكلوي، ولكن هذا لا يزال فشل في تقديم سيناريو كاملة. دمج كلا التقنيات الممكن فقط مع نماذج حيوانية. هيكل البريتوني مماثلة بين الثدييات، وذلك هناك نماذج مع مختلف أنواع الحيوانات. وهناك عدد قليل من الدراسات التي تقوم على الأغنام (روديلا et al. ¹⁴ وباريل et al. ¹⁵) وارنب نماذج^{17 16،}؛ ومع ذلك، أصغر الحيوانات الأفضل كما أنها أسهل للبيت والحفاظ على، وأيضا أكثر اقتصادا. ويتيح استخدام الفئران^18،19،،من^2021،22،،من²³²⁴ أقصر وقت معاملة اللازمة لمراقبة التعديلات morpho الوظيفية. قد مثلت نموذجا مفيداً للغاية لاستكشاف قضايا مختلفة مثل تأثير الأدوية المضادة تليفية مثلاً BMP-7 (العظام morphogenic البروتين-7)²⁵ و RAS (نظام إنزيم الرينين-انجيوتنسين) استهداف^{26،27 , 28}.

ومع ذلك، برز نموذج مورين كنموذج مثالي مع العديد من الفوائد على الآخرين. الميزة الأكثر إثارة للاهتمام تعديل إمكانية استخدام جينياً الفئران لدراسة أساس الضرر البريتوني الجزيئية والخلوية. وفي الواقع، كثيرا ما تستخدم الفئران للتحليل للعديد من الأمراض، كما أن هناك العديد من سلالات مختلفة مع مختلف الخلفيات الوراثية المعروفة. وتشمل المزايا الأخرى انخفاض المساحة المطلوبة للإسكان، وانخفاض تكلفة التجارب (بسبب حجم أصغر الحيوانات) وتوافر المواد الكاشفة وسهولة التعامل مع كمية متزايدة من المعلومات المتاحة في سلالات مختلفة من الفئران نظراً لأنها كانت الحيوانات الأكثر استخداماً في البحوث.

نموذج يستند إلى الفئران تستخدم جهاز مزروع النموذج الأكثر المنشأة حديثا ل PD^29،30، وقد ثبت أن تحاكي البريتوني تدهور لحقت بالمرضى PD بسبب التعرض لملفات Pdf. وقد تعاونت هذا النموذج لفهم العمليات المرضية المتورطين^31،،من³²³³. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت للتحقق من صحة مختلف العلاجات الممكنة للتخفيف من حدة هذا التدهور استخدام المغيرون محصنة والعقاقير المضادة للالتهابات وأخرى مضادة تليفية والعوامل المضادة-الأوعية، مثل مثبطات كوكس-2 (السيكلواوكسيجيناز-2) ³⁴، يضع فهمته-γ (بيروكسيسومي ادعاءا المنشط مستقبلات-γ)³⁵، تاموكسيفين³⁶، باريكالسيتول (فيتامين (د) مستقبلات منشط الذي ينظم رد فعل المناعة)³⁷و³⁸ من ربمسن ونيبيفولول ³⁹.

تطوير النموذج الماوس مع قسطرة مزروع

الهدف من هذا النموذج يشابه، قدر الإمكان، هذه التقنية المستخدمة في البشرية PD المرضى، مما يسمح بإجراء العلاجات الموسعة لشعبة المشتريات في الحيوانات الصغيرة. وحتى الآن، تم اختبار ثلاث تقنيات لتقطير السوائل غسيل الكلي في الصفاق في الفئران. أول واحد، ثقب المكفوفين من الجبهة جدار البطن، مثير للجدل بسبب مخاطر متعددة قد تتعرض لها، مثل الأضرار البريتوني، والنزيف، وثقب المنجز عمياء، الحشوي. الأسلوب الثاني هو ما يسمى "الدائمة النظام المفتوح"، الذي تم وضع جهاز لحقن السوائل خارج الجسم. هذا الإجراء الأكثر مماثلة للتي يؤديها في البشر. ومع ذلك، لا تسمح بتطوير التجارب الطويلة الأجل، كما أنها قد تزيد من فرص الإصابة ب، وعموما يتطلب استخدام التخدير لغرس قوات الدفاع الشعبي، التي قد تتداخل مع النتائج. الأسلوب الثالث هو "نظام مغلق". مع هذا النهج، يقع كامل الجهاز المستخدم لتقطير السوائل داخل جسم الحيوان. يتم حقن السائل بإبرة عن طريق منفذ وصول، التي توضع تحت الجلد. هذا الإجراء يقلل من خطر العدوى البريتوني والنزيف، فضلا عن الحاجة للتخدير.

لدراسة تأثير تبولن في شعبة البرامج، كان أيضا نموذجا مورين الأخيرة المقرر⁴⁰ استناداً إلى نموذج PDF التسريب بالقسطرة. يجمع هذا النموذج في تقنية رواية القيام استئصال في الفئران، مما يقلل من وظيفة الكلي. وقد وضعت في هذه المادة، تعديل البروتوكول تستخدمهم فيرانتيلي et al. في عام 2015⁴⁰ . يسمح هذا البروتوكول الجديد يقلل من طول الجرح أثناء جراحة زرع القسطرة أثناء استئصال، وتيسير الوصول إلى الكلي.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة البيولوجيا الجزيئية مركز سيفيرو أوتشوا (مدريد، إسبانيا).

ملاحظة: استخدمت C57BL/6J الفئران الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 12 و 14 أسبوعا ووزنها حوالي 20 غ في بداية الدراسة. جميع الحيوانات تم إيواء تحت الظروف القياسية والغذاء والمياه libitum الإعلانية. تم فحص الظروف الصحية يوميا. ينبغي أن تكون المواد المطلوبة، مثل القفازات، ثني، القسطرة، خياطة، والإبر، وعقيمة.

1-وضع القسطرة

ملاحظة: إذا لم يتم إزالة الكليتين، تظل الوظيفية تماما، حيث أنها لا تعتبر أثر أورميا، مما يسمح بدراسة التعرض لقوات الدفاع الشعبي في عزلة. ويتكون الجراحة على إدخال فقط المتطرفة البعيدة من القسطرة في التجويف الصفاقى ووضع المنفذ الحصول على الجزء الخلفي الحيوان، وتوفير إمكانية الوصول إليها. الإجراء لوضع القسطرة كما يلي:

1. ضع الماوس في دائرة للاستقراء وتوفير التخدير باستخدام إيسوفلوراني 4% والأكسجين بمعدل تدفق 0.4 لتر في الدقيقة حتى فقدان الاستقامة العاكسة.
   1. الحفاظ على الحيوان مع إيسوفلوراني 2% في الأكسجين 100% مع تدفق 0.3 لتر في الدقيقة عن طريق أنبوب نوسيكوني متصل بجهاز التخدير. تأكيد أنيسثيتيزيشن السليم بتقييم لهجة العضلات واستجابة للتحفيز.
   2. تحقق من معدل وعمق التنفس أثناء كل عملية. استخدام مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. فمن الأفضل إذا كانت الإجراءات التي تتم في تدفق مجلس الوزراء لضمان الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العمليات الجراحية.
2. يحلق في الجناح الأيسر والجزء الخلفي من الحيوانات من أجل إجراء عملية جراحية، وبعد حقن السوائل في ميناء الوصول بمنطقة نظيفة. ضع الحيوان في وضع أفقي يستريح في الجناح الأيسر في الجدول الجراحية، مع نظام حرارية التأكد من أن درجة الحرارة لا تنخفض.
3. تطهير المنطقة بمحلول غلوكونات الكلورهيكسيدين 1%. جعل قطع صغيرة (0.5 سم) مع مقص حادة في الجلد على الجناح الأيمن من الجسم، وفصل بعناية بمساعدة المقص من طبقة العضلات المجاورة، حيث أنه يتم فصل منطقة بأكملها من الجزء الخلفي الحيوان جيدا لوقت لاحق تكون قادرة على إدخال ميناء الوصول بسهولة. يرجى الرجوع إلى الرقم 1 لمعرفة المواد المطلوبة لمتابعة الإجراء.
4. إجراء شق صغير حوالي 1 مم في القطر من خلال طبقة العضلات وإدراج غيض من القسطرة والبلاستيك الدائري الأول. البريتوني الضرر الحد الأدنى.
5. خياطة الجدار البريتوني محكم حول القسطرة، مع خياطة الجروح غير امتصاص 5.0 أو 6.0. حلقة بلاستيكية واحدة ثم يقع داخل التجويف الصفاقى، والآخر بين العضلات والجلد. مما هو ثابت القسطرة لمنع السائل من التسرب إلى الفضاء تحت الجلد.
6. إدراج ميناء الوصول إلى الفضاء تحت الجلد نحو الذيل الماوس، دون تأمين تكنولوجيا المعلومات لوضع إصلاح للجلد، كما أنه يمكن حكة والحيوانات قد الصفر وبت بشرتهم.
7. إغلاق الجرح للجلد بخياطة الجروح غير امتصاص 5.0 أو 6.0. إزالة التخدير استنشاق وتسمح للحيوان أن يسترد وعيه. لا تترك الماوس غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. عندما تسترد بالكامل، يمكن إرجاع الماوس لشركة الحيوانات الأخرى.
   ملاحظة: يمكن أن تبدأ التجارب بعد 4 إلى 7 أيام للتعافي بعد العملية الجراحية.
8. توفير التسكين بتذويب 3 مل آيبوبروفين (20 ملغ/مل) في 250 مل مياه الشرب لليوم لعملية جراحية.
9. وخلال فترة ما بعد العمليات الجراحية، التحقق من الحالة الصحية للحيوان يوميا، التحقق من أن هناك لا توجد مناطق محمر على الجلد أو الشعر خشن أو الجروح.
10. حقن السوائل بالضغط الحيوان (بدون أنيسثيتيزينج أنه) من ذيله والاستيلاء على ميناء الوصول مع يد واحدة، والإبرة مع الآخر. تطهير المنطقة بمحلول غلوكونات الكلورهيكسيدين 1% قبل الحقن. أنها مثيرة للاهتمام لاستخدام الإبر الخاصة (الإبر هوبر)، التي هي مشطوب من أجل الجزء بدلاً من بيرس حاجز سيليكون ميناء الوصول (الشكل 1A). حقن اثنين في اليوم الواحد خلال 40 يوما ما يكفي لمراعاة التعديلات البريتوني (الشكل 3).
11. عند الانتهاء من هذه التجربة، euthanize الماوس بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون أو التفكك عنق الرحم.

2-القيام استئصال 5/6 ووضع القسطرة

ملاحظة: أفضل تشبه الحالة في المرضى PD من الممكن القيام استئصال 5/6، يسمح فقط وظيفة الكلي متبقية. وفي هذه الحالة، ينبغي أخذ عينات المصل لتحليل اليوريا المستويات عن طريق استخراج 250 ميكروليتر من الدم عن طريق الوريد الوجه ثقب، يوم واحد على الأقل قبل بدء العمليات الجراحية، في منتصف الطريق للعلاج وعند التضحية بالحيوانات. فمن الأفضل إذا كانت الإجراءات التي تتم في تدفق مجلس الوزراء لضمان الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العمليات الجراحية.

1. تخدير الفئران باستخدام إيسوفلوراني كما هو الحال في "الخطوة 1، 1".
2. تزويد التسكين 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين، حقن تحت الجلد في الرقبة من الحيوان وتذويب 3 مل آيبوبروفين (20 ملغ/مل) في 250 مل مياه الشرب في اليوم السابق واليوم لعملية جراحية.
3. يحلق الخطوط الفرعية والجزء الخلفي من الحيوانات لإجراء العمليات الجراحية وبعد حقن السوائل في ميناء الوصول بمنطقة نظيفة.
4. تنفيذ شق حوالي 0.5 سم في الجلد، وفي الجانب الأيسر، قريبة من أضلاعه، الوصول المباشر لاستئصال كليته اليسرى.
5. فتح شق صغير في عضلة اتخاذ الكلي اليسرى خارج الصفاق، إزالة الكبسولة والغدة الكظرية. لإزالة الكبسولة من الضروري عقد الكلي أفضل خارج التجويف الصفاقى.
6. حرق وقطع من النقيض إلى النقيض الكلي مع كوتيريزير (انظر الشكل 1 للمواد اللازمة).
7. يعيد الكلي في التجويف الصفاقى وخياطة الجروح في العضلات والجلد بخياطة 5.0 أو 6.0 غير قابلة للذوبان.
8. في اليوم التالي، تماما إزالة الكلي اليمنى وإدخال القسطرة باستخدام شق نفسه فيما يتعلق بإزالة الكلي. ومرة أخرى، تخدير الماوس مع isoflurane وتحت الجلد حقن 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين قبل إجراء العمليات الجراحية. كما تذوب 3 مل آيبوبروفين (20 ملغ/مل) في 250 مل مياه الشرب في اليوم السابق واليوم لعملية جراحية.
9. إجراء شق في الجلد من حوالي 0.5 سم، ومع مساعدة المقص، فصل الجلد في الجزء الخلفي من الحيوان من العضلات لفتح الفضاء حيث سيقام ميناء الوصول.
10. إجراء خفض في العضلات (عن 0.3-0.4 سم) بإخراج الكلي اليمنى من التجويف الصفاقى.
11. إزالة الكبسولة والغدة الكظرية الوصول بشكل أفضل إلى الكلي. سد الوريد الكلوي والشريان والحالب مع خياطة 5.0 أو 6.0 غير الامتصاص وإزالة الكلي تماما.
12. خياطة الجرح في العضلات البريتوني، إدخال نهاية القسطرة حيث يجب أن تظل العضلات بين اثنين من حلقات بلاستيكية، وكما هو موضح من قبل (الخطوة 1، 5).
13. إدخال منفذ الوصول إلى الفضاء تحت الجلد وخياطة الجلد كما هو موضح في الخطوات 1.6 و 1.7.
    ملاحظة: ينبغي أن بقية الفئران لمدة 10 أيام على الأقل من هذه العمليات الجراحية لضمان أن تلتئم الجراح في العضلات البريتوني تماما، ولن يكون هناك لا تسرب في الفضاء تحت الجلد أثناء الحقن السائل. حقن السوائل كما في الخطوة 1، 10.
14. عند الانتهاء من هذه التجربة، euthanize الحيوانات بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون أو التفكك عنق الرحم.

النتائج

ويبين الشكل 1 جميع المواد المطلوبة لاتباع الإجراءات الموضحة في قسم البروتوكول. على سبيل المثال، الفئران المقدمة أو عدم استئصال (8 الحيوانات في كل مجموعة) (الشكل 2) تعرضت خلال 40 يوما (اثنين الحقن يوميا، الانتظار ساعتين على الأقل بين على حد سو?...

Discussion

البيانات المنشورة أول تحليل التعديلات PD باستخدام تقنية "إغلاق نظام" أجريت في 2009²⁹ . نظام إغلاق هذا يعني أن الجهاز أكمله يقع داخل الجسم ويتم حقن السائل بإبرة عن طريق منفذ وصول. المشكلة التقنية الأكثر أهمية في المدى الطويل نماذج حيوانية لضخ السوائل عن طريق قسطرة هو حدوث إعاقة. الخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 ga. X 1/2´´	Access technologies	PG25-500
High Temperature Cautery Kit	Bovie	18010-00
Forane	abbVie	880393.4 HO
non absorbable suture 6/0	Laboratorio Agaró	6121
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
forceps	Fine Science Tools	11002-12
clamp	Fine Science Tools	13002-10
Buprenorphine 0,3 mg/ml			pharmaceutical product
cotton swabs			pharmaceutical product
Dalsy (Ibuprofen) 20mg/mL oral suspension	AbbVie S.R.L.		pharmaceutical product