Chirurgische Techniken zur Platzierung des Katheters und 5/6 Nephrektomie in murinen Modellen der Peritonealdialyse

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Methode für die chirurgische Platzierung bei Mäusen eine intraperitoneale Katheter befestigt an einem Zugang-Anschluss, der an der Rückseite des Tieres positioniert ist. Darüber hinaus erklärt, das Verfahren für eine 5/6 Nephrektomie urämischen Bundesstaat PD-Patienten ähneln.

Zusammenfassung

Peritonealdialyse (PD) ist eine Nierenersatztherapie konsistent auf die Verwaltung und posterior Wiederherstellung einer Hyperosmotic Flüssigkeit in der Bauchhöhle, Wasser und toxischen Metaboliten abzulassen, die funktional-unzureichende Nieren nicht in der Lage zu beseitigen. Leider verschlechtert sich dieses Verfahren das Bauchfell. Gewebeschäden löst das Auftreten von Entzündungen, die Verletzung zu heilen. Wenn die Verletzung anhält und Entzündung chronisch wird, kann es zu Fibrose, führen die ist ein gemeinsames Auftreten bei vielen Krankheiten. Bei Morbus Parkinson führen chronische Entzündung und Fibrose, zusammen mit anderen spezifischen Prozesse rund um diese hier zu Ultrafiltration Kapazität Verschlechterung, das heißt Scheitern und anschließende Einstellung der Technik. Arbeiten mit humanen Proben informiert über diese Verschlechterung aber präsentiert technische und ethische Grenzen um Biopsien zu erhalten. Tiermodelle sind unerlässlich, um diese Verschlechterung zu studieren, da sie diese Mängel beheben.

In 2008, welche Vorteile aus der breiten Palette von genetisch veränderten Mäusen, eröffnet die Möglichkeit des Studiums der Mechanismen, die eine chronische Mausmodell Infusion entstand. Dieses Modell setzt eine angepasste Gerät für Mäuse, bestehend aus einen Katheter befestigt an einem Zugang-Anschluss, der subkutan an der Rückseite des Tieres platziert wird. Dieses Verfahren vermeidet kontinuierliche Punktion des Bauchfells während Langzeitexperimente, Infektionen und Entzündungen durch Injektionen reduzieren. Dank dieses Modells hat peritonealen Schäden, die durch chronische PD Fluid Exposition induzierte gekennzeichnet und moduliert. Diese Technik ermöglicht die Infusion großer Mengen an Flüssigkeiten und könnte verwendet werden, für die Untersuchung von anderen Krankheiten, bei denen Inokulation von Drogen oder anderen Substanzen über längere Zeit notwendig ist.

Dieser Artikel beschreibt die Methode für die chirurgische Platzierung des Katheters in den Mäusen. Darüber hinaus erklärt, das Verfahren für eine 5/6 Nephrektomie, den Zustand der Niereninsuffizienz bei PD-Patienten zu imitieren.

Einleitung

Nierenfunktion und Nierenerkrankungen

Nieren sind wichtige Organe Homöostase, Blut Filtration und Hormon-Produktion beteiligt. Es gibt verschiedene Ursachen, die führen zu Nierenversagen und zum späteren Ausbruch der Urämie, definiert als die Gruppe der systemischen Symptomen aufgrund der Ansammlung von Abfallprodukte im Blut wegen Niere Funktion Störungen¹beibehalten. Darüber hinaus da homöostatische Funktion auch betroffen ist, wenn eine Niereninsuffizienz vorliegt, kann Bluthochdruck durch Volumen-Überladung auftreten, das ist auch gefährlich, da es zu Herzinsuffizienz¹führen kann. Wenn die Funktionsfähigkeit der Nieren ist weniger als 10 % - 15 %, der Patient muss eines der folgenden therapeutischen Optionen zu unterziehen: Hämodialyse, Peritonealdialyse (PD) oder Nierentransplantation.

Morbus Parkinson ist eine interessante Option, die kann die Patienten weiterhin die Behandlung aus dem Komfort ihres Hauses oder praktisch überall, wodurch die Notwendigkeit für häufige Krankenhaus besucht und bleibt. Die PD-Technik beseitigt kleine giftige Moleküle und überschüssiges Wasser durch den Körper² durch die Instillation von einem osmotischen Flüssigkeit (Peritonealdialyse flüssig, PDF) erzeugt in der Bauchhöhle. Diese Instillation erzeugt der osmotische Gradient für den Austausch von gelösten Stoffen und Wasser zwischen der peritonealen Kapillare und PDF, ein Prozeß bekannt als Ultrafiltration (UF) notwendig.

Peritonealen Verletzung induziert durch Peritonealdialyse

Die Bauchhöhle wird durch eine Membran (PM), bestehend aus einer Monoschicht Mesothelzellen ruht auf einer Matrix, die beherbergt auch einige Blutgefäße, Fibroblasten, Makrophagen und anderen Zellpopulationen abgedeckt. Leider leidet die peritoneale Membrane immer einige Änderungen während der PD-Behandlung, z. B. Apoptose und Verlust von Mesothelzellen, Mesenchymale Übergang von mesothelial (MMT) und Endothelzellen (Ende-MT) Zellen, Rekrutierung von Entzündungszellen und Fibrocytes, vaskuläre Veränderungen, Angiogenese, Basisdefekt und/oder Fibrose^{3,4,5,6,7,8,9}. Diese Veränderungen sind verantwortlich für die Entwicklung einer UF Kapazität Scheitern¹⁰, schließt die Fortsetzung der Therapie, zu verlangen, dass der Patient eine alternative Behandlung um zu überleben (Hämodialyse oder Nierentransplantation) erhalten müssen . Daher ist es für diese Patienten wesentlich zu verzögern oder zu steuern die Entwicklung dieser peritonealen Veränderungen.

Es wurde spekuliert, dass Urämie allein Entzündung^{11 verursachen}, aber das wichtigste lokale PDF-Bioincompatibility. Die meisten PDFs verwenden Glukose als der osmotische Agent, der Entzündung verursacht. Durch PDF Lagerzeiten und Sterilisation Glukose leidet einen Prozess des Abbaus, und neue Produkte aus dieser Reaktion erscheinen, generieren mehr Entzündung, MMT und Apoptose^12,13. Darüber hinaus gibt es auch die Möglichkeit, mechanische Beschädigung durch die Instillation-Methode. All diese Faktoren kontinuierlich handeln können einen anhaltende und wiederkehrenden entzündlichen Zustand, führt zu einer chronischen Entzündung, die zur Verschlechterung der Membran und schlüssig, UF Scheitern treibt generieren. Wie dieser Schaden verringert oder vermieden werden kann ist immer noch eine Frage der Studie.

Analyse der Entwicklung von Läsionen: aus humanen Proben an Tiermodellen

Arbeiten mit menschlichen Biopsien ist ein limitierender Faktor aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Gewebeproben. Diese Proben können Operationen durchgeführt durch Katheter Fehlfunktion oder Transplantation, in der Regel nach Jahren der PD-Behandlung nur entnommen werden. Dieser Ansatz eignet sich für die Analyse von pathologischen Veränderungen erlitten durch eine peritoneale Membrane ausgesetzt als PDF-Datei, aber ist nicht ausreichend, um die Entwicklung des Prozesses zu studieren. Eine andere Möglichkeit ist es, Zellen aus Dialyse Abwasser abgelassen zu analysieren, sondern dies immer noch keine komplette Szenario bieten. Verschmelzung beider Techniken ist nur möglich mit Tiermodellen. Die peritoneale Struktur ist ähnlich wie bei Säugetieren, und daher gibt es Modelle mit verschiedenen Tierarten. Es gibt ein paar Studien basierend auf Schafe (Rodela Et al. ¹⁴ und Barrell Et al. ¹⁵) und Kaninchen^16,17 Modelle; kleinere Tiere sind jedoch vorzuziehen, da sie einfacher zu Haus sind und pflegen, und sind auch günstiger. Der Einsatz von Ratten^{18,19,20,21,22,23,24} bietet eine kürzere Behandlungszeit benötigt, um zu beobachten Morpho-funktionellen Veränderungen. Es ist ein sehr nützliches Modell zu verschiedenen Themen wie z. B. die Wirkung der Anti-fibrotische Drogen wie zum Beispiel BMP-7 (Knochen morphogenetische Protein-7)²⁵ und RAS (Renin-Angiotensin-System) auf^26,27 erkunden vertreten. ^{, 28}.

Allerdings hat das Mausmodell als ideales Modell mit vielen Vorteilen gegenüber anderen entstanden. Der interessanteste Vorteil ist, dass die Möglichkeit der Verwendung genetisch Mäuse um die molekularen und zellulären Grundlagen der peritonealen Schaden geändert. Mäuse sind in der Tat oft für die Analyse von zahlreichen Krankheiten beschäftigt, da gibt es viele verschiedene Stämme mit verschiedenen bekannten genetischen Hintergründen. Weitere Vorteile sind den geringere Platzbedarf für Gehäuse, reduzierte Kosten für Experimente (aufgrund der geringeren Größe der Tiere), einfache Handhabung, die Verfügbarkeit von Reagenzien und die zunehmende Menge an verfügbaren Informationen über die verschiedenen Stämme von Mäusen Da sie am häufigsten verwendeten Tieren in der Forschung gewesen.

Ein Mäuse basierendes Modell mit einem implantierten Gerät wurde vor kurzem etabliertesten Modell für PD^29,30und hat gezeigt, dass Peritonealdialyse PD-Patienten aufgrund der Exposition gegenüber PDFs entstandenen Verschlechterung zu imitieren. Dieses Modell hat zusammengearbeitet, um zu verstehen, dass die pathologischen Prozesse verwickelt^31,32,33. Darüber hinaus wurde es verwendet, um verschiedene mögliche Behandlungsmethoden für bessernde dieser Verschlechterung mit Immunmodulatoren und Anti-inflammatory Drogen und andere Anti-fibrotische und Anti-angiogenen Mittel, wie COX-2-Hemmer (Cyclooxygenase-2) ^{überprüfen 34}, PPAR-γ (Peroxisom davon-aktivierte Rezeptoren-γ) Agonisten³⁵, Tamoxifen³⁶, Paricalcitol (ein Vitamin-D-Rezeptor Aktivator, der die Immunreaktion moduliert)³⁷, Rapamycin³⁸ und Nebivolol ³⁹.

Entwicklung der Maus-Modell mit einem implantierten Katheter

Das Ziel dieses Modells ist ähnlich so weit wie möglich, die Technik in menschlichen PD-Patienten, ermöglicht längere Behandlungen von Morbus Parkinson bei Kleintieren ausführen verwendet. Bisher wurden drei Techniken zur Instillation von Dialyseflüssigkeit in das Peritoneum an Mäusen getestet. Ersteres, blinde Punktion der vorderen Bauchwand, ist umstritten wegen der mehrere Risiken, die es z. B. peritonealen Schäden entstehen Blutungen und als Blind durchgeführt, viszerale Punktion. Die zweite Technik ist die so genannte "offene permanente System", in dem das Gerät zum Einspritzen der Flüssigkeit außerhalb des Körpers befindet. Dieses Verfahren ist sehr ähnlich wie beim Menschen durchgeführt. Jedoch erlaubt nicht die Entwicklung von langfristigen Experimenten, wie es die Chancen einer Infektion erhöhen kann, und in der Regel erfordert die Verwendung von Anästhesie, PDF, zu vermitteln, die das Ergebnis beeinträchtigen können. Die dritte Technik ist die "geschlossenes System". Mit diesem Ansatz befindet sich die gesamte Vorrichtung verwendet für flüssige Instillation im Körper des Tieres. Flüssigkeit wird mit einer Nadel durch einen Zugang Port injiziert, die subkutan gelegt wird. Dieses Verfahren reduziert das Risiko von peritoneale Infektionen und Blutungen, sowie die Notwendigkeit einer Narkose.

Um die Wirkung der Urämie bei Morbus Parkinson zu untersuchen, wurde auch die jüngsten Mausmodell Marketingplan⁴⁰ basiert auf dem PDF-Infusion-Modell mit Katheter. Dieses Modell bringt eine neuartige Technik eine Nephrektomie bei Mäusen, wodurch die Nierenfunktion durchführen. In diesem Artikel wurde eine Änderung des Protokolls von Ferrantelli Et Al. in 2015⁴⁰ Beschäftigten entwickelt. Dieses neue Protokoll ermöglicht Katheter Implantation während Nephrektomie, reduziert die Länge der Wunde zugefügt während der Operation und erleichtert den Zugang zu den Nieren.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee of Molecular Biology Center Severo Ochoa (Madrid, Spanien) genehmigt.

Hinweis: C57BL/6J weibliche Mäusen im Alter von 12 bis 14 Wochen und einem Gewicht von ca. 20 g zu Beginn der Studie wurden verwendet. Alle Tiere wurden unter normalen Bedingungen untergebracht und erhielten Nahrung und Wasser Ad Libitum. Gesundheitlichen Bedingungen wurden täglich überprüft. Das Material benötigt, wie Handschuhe, drapieren, Katheter, Naht und Nadeln, sollte steril sein.

1. Platzierung des Katheters

Hinweis: Wenn die Nieren nicht entfernt werden, bleiben sie voll funktionsfähig, so dass es nicht die Wirkung der Urämie, erlaubt die Untersuchung der PDF-Exposition isoliert betrachtet. Die Operation besteht darin, nur die distalen Spitze des Katheters in die Bauchhöhle einzuführen und Platzierung des Zugangs-Ports auf der Rückseite des Tieres, den Zugang zu ihm. Das Verfahren um den Katheter zu platzieren ist wie folgt:

1. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine Induktion Kammer und bieten Sie Anästhesie mit 4 % Isofluran und Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 0,4 L/min bis zum Verlust der aufrichtenden Reflex.
   1. Halten Sie das Tier mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einem Fluss von 0,3 L/min mittels eines Nosecone-Rohres an das Anästhesie-Gerät angeschlossen. Bestätigen Sie richtige Anesthetization durch Beurteilung von Muskeltonus und Reaktion auf die Stimulation.
   2. Überprüfen Sie die Rate und Tiefe der Atmung während des Prozesses. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Es ist vorzuziehen, wenn die Verfahren in einem Schrank erfolgen um die Aufrechterhaltung der Sterilität während Operationen zu gewährleisten.
2. Die rechte Flanke und Rücken der Tiere zu rasieren, um die Operation durchzuführen und später die Flüssigkeit am Hafen in einem sauberen Bereich Zugang zu injizieren. Legen Sie das Tier in Seitenlage ruht auf seiner linken Flanke in den OP-Tisch, mit einer Anlage zu gewährleisten, dass die Temperatur nicht fallen wird.
3. Desinfizieren Sie den Bereich mit 1 % Chlorhexidin Gluconat Lösung. Machen Sie einen kleinen Schnitt (0,5 cm) mit einer stumpfen Schere in die Haut auf der rechten Flanke des Körpers, und trennen Sie ihn sorgfältig mit Hilfe der Schere aus den angrenzenden Muskelschicht, so dass der gesamte Bereich der Rückseite des Tieres gut getrennt ist, um später einführen können der Port des Zugangs mit Leichtigkeit. Bitte verweisen Sie auf Abbildung 1 um zu sehen, die Materialien erforderlich, um das Verfahren zu folgen.
4. Machen Sie einen kleinen Schnitt von ca. 1 mm im Durchmesser durch die Muskelschicht und stecken Sie die Spitze des Katheters und der ersten Kunststoffring. Die Peritonealdialyse verursachte Schaden ist minimal.
5. Naht der peritonealen Wand eng um den Katheter mit einer 5.0 oder 6.0 nicht resorbierbaren Naht. Ein Kunststoffring liegt dann innerhalb der Bauchhöhle, und andererseits zwischen den Muskeln und der Haut. Der Katheter ist dadurch zu verhindern, dass Flüssigkeit austritt in den subkutanen Raum fixiert.
6. Einfügen Sie Zugang Port in den subkutanen Raum nach hinten von der Maus, ohne es an eine Fix-Position auf der Haut zu sichern, wie es Jucken kann und die Tiere können kratzen und ihrer Haut etwas
7. Schließen Sie die Wunde der Haut mit einer 5.0 oder 6.0 nicht resorbierbaren Naht. Entfernen der Inhalation Narkose und das Tier, um Bewusstsein zu erholen. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Wenn vollständig erholt, kann Maus, die Gesellschaft anderer Tiere zurückgegeben werden.
   Hinweis: Die Experimente können nach 4 bis 7 Tage der postoperativen Erholung beginnen.
8. Bieten Sie Analgesie durch Auflösen von Ibuprofen (20 mg/mL) 3 mL in 250 mL Wasser für den Tag der Operation.
9. Während der postoperativen Periode überprüfen Sie den Gesundheitszustand des Tieres täglich überprüfen, ob es keine geröteten Bereiche auf der Haut, struppige Haare oder Wunden gibt.
10. Injizieren Sie die Flüssigkeit durch die halten des Tiers (ohne es zu betäuben) am Schwanz und packte den Zugang Port mit einer Hand und die Nadel mit dem anderen. Desinfizieren Sie den Bereich mit 1 % Chlorhexidin Gluconat Lösung vor der Injektion. Es ist interessant, spezialnadeln (Huber-Nadeln), zu verwenden, die abgeschrägt sind, um anstelle von Pierce das Silikon Septum des Access Ports (Abbildung 1A) Teil. Zwei Injektionen pro Tag während der 40 Tage sind genug, um peritonealen Veränderungen (Abbildung 3) zu beobachten.
11. Nach Beendigung des Experiments einschläfern Sie Maus durch Kohlendioxid Erstickung oder Zervikale Dislokation.

2. Durchführung einer 5/6 Nephrektomie und Platzierung des Katheters

Hinweis: Um die Situation in PD-Patienten besser ähneln ist es möglich, ein 5/6 Nephrektomie, so dass nur eine residuale Nierenfunktion durchzuführen. In diesem Fall sollte Serumproben entnommen werden, um Harnstoff zu analysieren, die Ebenen durch die Gewinnung von 250 μL Blut über Vena facialis Punktion, mindestens einen Tag vor Beginn der Operationen in der Mitte der Behandlung und wenn die Tiere zu opfern. Es ist vorzuziehen, wenn die Verfahren in einem Schrank erfolgen um die Aufrechterhaltung der Sterilität während Operationen zu gewährleisten.

1. Die Mäuse mit Isofluran wie in Schritt 1.1 zu betäuben.
2. Geben Sie Analgesie mit 0,1 mg/kg von Buprenorphin, subkutan injiziert am Hals des Tieres und durch das Auflösen von Ibuprofen (20mg/ml) 3 ml in 250 ml Wasser für den Tag vor und am Tag der Operation.
3. Rasieren Sie die Seitenteile und der Rückseite der Tiere, um die Operationen durchführen und später die Flüssigkeit am Hafen in einem sauberen Bereich Zugang zu injizieren.
4. Führen Sie einen Schnitt von ca. 0,5 cm in der Haut, auf der linken Seite, in der Nähe der Rippen, um direkten Zugriff auf die linke Niere.
5. Öffnen Sie einen kleinen Schnitt in der Muskulatur, die linke Niere aus dem Bauchfell, Entfernen der Kapsel und der Nebenniere zu nehmen. Um die Kapsel zu entfernen ist notwendig, die Niere besser außerhalb der Bauchhöhle zu halten.
6. Brennen und schneiden Sie die Extreme der Niere mit einem linken (siehe Abbildung 1 für Materialien benötigt).
7. Wiedereinführung der Niere in die Bauchhöhle und die Wunden an den Muskel und die Haut mit unlöslichen 5.0 oder 6.0 Naht Naht.
8. Am nächsten Tag, komplett entfernen der rechten Niere und des Katheters mit den gleichen Schnitt, die Niere zu entfernen. Auch betäuben Sie die Maus mit Isofluran zu und subkutan injizieren Sie 0,1 mg/kg von Buprenorphin kurz vor dem chirurgischen Eingriff. 3 ml von Ibuprofen (20mg/ml) in 250 ml Wasser am Tag vor und am Tag der Operation auch auflösen.
9. Machen Sie einen Schnitt in der Haut von ca. 0,5 cm und mit Hilfe der Schere trennen Sie die Haut auf der Rückseite des Tieres aus dem Muskel, den Raum zu öffnen, in der Access-Port angesiedelt sein wird.
10. Führen Sie einen Schnitt in der Muskulatur (über 0,3-0,4 cm), die rechte Niere aus der Bauchhöhle zu nehmen.
11. Die Kapsel und der Nebenniere besseren Zugriff auf die Niere zu entfernen. Verbinden Sie Niere Vene, Arterie und Harnleiter mit nicht resorbierbaren 5.0 oder 6.0 Naht und entfernen Sie die Niere vollständig.
12. Naht der Wunde an die peritoneale Muskel, Einführung Ende des Katheters, so dass der Muskel zwischen die zwei Kunststoffringe bleiben muss, wie vorher (Schritt 1.5) erklärt.
13. Die Zugangs-Port in den subkutanen Raum einführen und Naht der Haut, wie in den Schritten 1.6 und 1.7 erläutert.
    Hinweis: Mäuse sollte für mindestens 10 Tage von diesen Operationen um sicherzustellen, dass die Wunden an den peritonealen Muskel sind vollständig geheilt, und es wird kein Durchsickern in den subkutanen Raum beim Einspritzen der Flüssigkeit liegen. Die Flüssigkeit wie in Schritt 1.10 zu injizieren.
14. Nach Beendigung des Experiments einschläfern Sie die Tiere durch Kohlendioxid Erstickung oder Zervikale Dislokation.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt alle benötigten Materialien für den im Protokoll Abschnitt beschriebenen Verfahren. In diesem Beispiel Mäusen vorgelegt oder nicht Nephrektomie (8 Tiere pro Gruppe) (Abbildung 2) waren eine Mischung aus zwei verschiedenen PDFs, allgemein verwendet in der klinischen Praxis in 40 Tagen (zwei Injektionen pro Tag, warten mindestens 2 Stunden zwischen den beiden) ausgesetzt: Extraneal (Icodextrin-basierte PDF) und...

Diskussion

Die ersten veröffentlichten Daten Analyse PD Veränderungen mit einer "schließen System" Technik wurde in 2009²⁹ durchgeführt. Dieses enge System bedeutet, dass das gesamte Gerät sich im Inneren des Körpers befindet und die Flüssigkeit wird mit einer Nadel durch einen Zugang Port injiziert. Die wichtigste technische Problem in langfristige Tiermodellen der Flüssigkeit Infusion über einen Katheter ist das Auftreten von Verstopfung. Mögliche Optionen sind omentektomie durchführen oder Hepa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 ga. X 1/2´´	Access technologies	PG25-500
High Temperature Cautery Kit	Bovie	18010-00
Forane	abbVie	880393.4 HO
non absorbable suture 6/0	Laboratorio Agaró	6121
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
forceps	Fine Science Tools	11002-12
clamp	Fine Science Tools	13002-10
Buprenorphine 0,3 mg/ml			pharmaceutical product
cotton swabs			pharmaceutical product
Dalsy (Ibuprofen) 20mg/mL oral suspension	AbbVie S.R.L.		pharmaceutical product