Técnicas quirúrgicas para la colocación del catéter y nefrectomía 5/6 en modelos murinos de Diálisis Peritoneal

Resumen

Este artículo muestra el método para la colocación quirúrgica en ratones de un catéter intraperitoneal conectados a un puerto de acceso que se encuentra en la parte posterior del animal. Por otra parte, explica el procedimiento para una nefrectomía 5/6 para asemejarse al estado urémico de pacientes con EP.

Resumen

La diálisis peritoneal (DP) es una terapia de reemplazo renal consistente en la administración y posterior recuperación de un fluido hiperosmolares en la cavidad peritoneal para drenar el agua y tóxicos metabolitos que funcionalmente suficientes riñones no son capaces de eliminar. Desafortunadamente, este procedimiento deteriora el peritoneo. Daño tisular provoca la aparición de la inflamación para curar la lesión. Si la lesión persiste y la inflamación se vuelve crónica, puede conducir a la fibrosis, que es una ocurrencia común en muchas enfermedades. En PD, inflamación crónica y fibrosis, junto con otros procesos específicos relacionados con las mismas, conducen al deterioro de la capacidad de ultrafiltración, que significa el fracaso y posterior abandono de la técnica. Trabajar con muestras humanas proporciona información acerca de este deterioro pero presenta limitaciones técnicas y éticas para obtener biopsias. Modelos animales son esenciales para el estudio de este deterioro desde que superan estas deficiencias.

Un modelo de infusión crónica de ratón fue desarrollado en 2008, que se beneficia de la amplia gama de ratones modificados genéticamente, abriendo la posibilidad de estudiar los mecanismos implicados. Este modelo emplea un dispositivo personalizado diseñado para los ratones, que consta de un catéter conectado a un puerto de acceso que se coloca por vía subcutánea en la parte posterior del animal. Este procedimiento evita la continua punción del peritoneo durante experimentos a largo plazo, reducir las infecciones y la inflamación debido a las inyecciones. Gracias a este modelo, daño peritoneal inducido por la exposición fluida PD crónica ha sido caracterizada y modulada. Esta técnica permite la infusión de grandes volúmenes de líquidos y puede ser utilizada para el estudio de otras enfermedades en las que la inoculación de drogas u otras sustancias durante largos períodos de tiempo es necesaria.

Este artículo muestra el método para la colocación quirúrgica del catéter en ratones. Por otra parte, explica el procedimiento para una nefrectomía 5/6 imitar el estado de insuficiencia renal en pacientes con EP.

Introducción

Función renal y enfermedad Renal

Los riñones son órganos esenciales implicados en homeostasis, la filtración de sangre y la producción de la hormona. Hay varias condiciones que conducen a insuficiencia renal y a la posterior aparición de uremia, que ha sido definida como el conjunto de síntomas sistémicos debido a la acumulación de productos de desecho en la sangre retenida debido a trastornos de función renal¹. Por otra parte, puesto que la capacidad homeostática de los mismos también se ve afectado cuando hay una falla renal, hipertensión por sobrecarga de volumen puede ocurrir, que también es peligroso ya que puede conducir a insuficiencia cardíaca¹. Cuando la capacidad funcional de los riñones es menos de 10-15%, el paciente debe someterse a una de las siguientes opciones terapéuticas: hemodiálisis, diálisis peritoneal (DP) o trasplante renal.

PD es una opción interesante que permite a los pacientes a seguir el tratamiento desde la comodidad de su hogar o prácticamente en cualquier lugar, evitando así la necesidad de hospital frecuentes visitas y estancias. La técnica de PD elimina pequeñas moléculas tóxicas y exceso de agua generado por el cuerpo² a través de la instilación de un líquido osmótico (líquido de diálisis peritoneal, PDF) en la cavidad peritoneal. Esta instilación genera el gradiente osmótico necesario para el intercambio de solutos y agua entre los capilares peritoneales y PDF, un proceso conocido como ultrafiltración (UF).

Lesiones peritoneales inducida por Diálisis Peritoneal

La cavidad peritoneal está cubierta por una membrana (PM) compuesto por una monocapa de células mesoteliales sobre una matriz, que también alberga algunos de los vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos y otras poblaciones de la célula. Por desgracia, la membrana peritoneal siempre sufre algunas alteraciones durante el tratamiento de la PD, como apoptosis y pérdida de células mesoteliales, transición mesenquimal de mesothelial (MMT) y células endoteliales (final-MT), reclutamiento de células inflamatorias y fibrocitos, alteraciones vasculares, angiogénesis, linfangiogénesis o fibrosis^{3,4,5,6,7,8,9}. Estas alteraciones son responsables para el desarrollo de una UF capacidad falta¹⁰, que impide la continuación de la terapia, que requieren que el paciente debe recibir un tratamiento alternativo para sobrevivir (hemodiálisis o trasplante renal) . Por lo tanto, para estos pacientes, es fundamental para retrasar o controlar el desarrollo de estas alteraciones peritoneales.

Se ha especulado que uremia solo puede causar inflamación¹¹, pero el factor local más importante es bioincompatibility PDF. PDF la mayoría utiliza glucosa como agente osmótico, que causa inflamación. Debido a tiempos de almacenamiento PDF y esterilización, la glucosa sufre un proceso de degradación, y aparecen nuevos productos de esta reacción, genera más inflamación, MMT y apoptosis^12,13. Por otra parte, también hay la posibilidad de daños mecánicos por el método de la instilación. Todos estos factores, actuando continuamente, pueden generar un estado inflamatorio persistente y recurrente, conduce a la inflamación crónica, que conduce al deterioro de la membrana y, concluyentemente, el fracaso de la UF. Cómo podría reducir o evitar este daño es todavía una materia de estudio.

Analizar el desarrollo de lesiones: de muestras humanas en modelos animales

Trabajar con biopsias humanas es un factor limitante debido a la dificultad de obtener muestras de tejido. Estas muestras pueden obtenerse sólo de cirugías realizadas debido a mal funcionamiento del catéter o el trasplante, generalmente después de años de tratamiento de la PD. Este enfoque es útil para el análisis de los cambios patológicos sufridos por una membrana peritoneal expuesta a PDF, pero no es suficiente para el desarrollo del proceso. Otra posibilidad es analizar las células del efluente de diálisis drenadas, pero esto todavía no proporciona un escenario completo. Combinar ambas técnicas sólo es posible con modelos animales. La estructura peritoneal es similar entre los mamíferos, y por lo tanto hay modelos con diferentes especies de animales. Hay pocos estudios basados en ovejas (Rodela et al. ¹⁴ y Barrell et al. ¹⁵) y conejo^16,17 modelos; sin embargo, animales más pequeños son preferibles ya que son más fáciles de casa y mantengan y también son más económicos. El uso de ratas^{18,19,20,21,22,23,24} ofrece un menor tiempo de tratamiento necesario para observar alteraciones morfo-funcionales. Ha representado un modelo muy útil para explorar diferentes cuestiones como el efecto de fármacos anti-fibróticos como por ejemplo BMP-7 (hueso morfogénico proteína-7)²⁵ y RAS (sistema renina-angiotensina) dirigido a^{26,27 , 28}.

Sin embargo, el modelo murino ha emergido como un modelo ideal con muchas ventajas sobre los demás. La ventaja más interesante es la posibilidad de utilizar genéticamente modificados ratones para estudiar las bases moleculares y celulares del daño peritoneal. De hecho, ratones a menudo se emplean para el análisis de numerosas enfermedades, ya que hay muchas variedades con diferentes fondos genéticos bien conocidos. Otras ventajas son el reducido espacio necesario para vivienda, reducido costo de experimentos (debido al tamaño más pequeño de los animales), facilidad de manejo, la disponibilidad de reactivos y la creciente cantidad de información disponible sobre las diferentes cepas de ratones desde entonces han sido los animales más utilizados en la investigación.

Un modelo de ratones empleando un dispositivo implantado ha sido el modelo más recientemente establecido para PD^29,30y se ha demostrado para imitar peritoneal deterioro sufrido por los pacientes debido a la exposición a PDF. Este modelo ha colaborado para entender que los procesos patológicos implicados^31,32,33. Por otra parte, se ha utilizado para validar varios tratamientos posibles para paliar este deterioro utilizando moduladores inmunes y drogas antiinflamatorias y otros anti-fibrótico y agentes anti-angiogénicos, tales como inhibidores de COX-2 (ciclooxigenasa-2) ³⁴, agonistas de PPAR-γ (peroxisome proliferator-activado del receptor-γ)³⁵, tamoxifeno³⁶, Paricalcitol (un vitamina D receptor activador que modula la reacción inmune)³⁷,³⁸ de la rapamicina y Nebivolol ³⁹.

Desarrollando el modelo de ratón con un catéter implantado

El objetivo de este modelo es se asemejan, en la medida de lo posible, la técnica utilizada en pacientes humanos con PD, permitiendo realizar tratamientos prolongados de EP en pequeños animales. Hasta ahora, tres técnicas de instilación de líquido de diálisis en el peritoneo se han probado en ratones. El primero de ellos, pinche ciego del frente de la pared abdominal, es polémico debido a los múltiples riesgos que conllevan, como el daño peritoneal, hemorragia y, como es la punción realizada a ciegas, visceral. La segunda técnica es el supuesto "permanente sistema abierto", en la que el dispositivo para inyectar el líquido se coloca fuera del cuerpo. Este procedimiento es más similar a la realizada en los seres humanos. Sin embargo, no permite el desarrollo de experimentos a largo plazo, ya que puede aumentar las posibilidades de infección y requiere generalmente el uso de anestesia para PDF, que puede interferir con los resultados. La tercera técnica es el "sistema cerrado". Con este planteamiento, todo el dispositivo utilizado para la instilación del líquido se encuentra dentro del cuerpo del animal. Líquido se inyecta con una aguja a través de un puerto de acceso, que se coloca por vía subcutánea. Este procedimiento reduce el riesgo de infección peritoneal y sangrado, así como la necesidad de anestesia.

Para estudiar el efecto de la uremia en la EP, un modelo murino reciente también ha sido establecido⁴⁰ basado en el modelo de infusión PDF con catéter. Este modelo trae una novedosa técnica para realizar una nefrectomía en ratones, lo que reduce la función renal. En el presente artículo, se ha desarrollado una modificación del protocolo empleado por Ferrantelli et al. en 2015⁴⁰ . Este nuevo protocolo permite la implantación del catéter durante la nefrectomía, reduce la longitud de la herida infligida durante la cirugía y facilita el acceso a los riñones.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso del centro de Biología Molecular Severo Ochoa (Madrid, España).

Nota: Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de 12 a 14 semanas de edad y aproximadamente 20 g de peso al inicio del estudio. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones estándar y se les dio comida y agua ad libitum. Las condiciones de salud se revisaron diariamente. El material requerido, como guantes, paño, catéter, sutura y agujas, debe ser estéril.

1. colocar el catéter

Nota: Si los riñones no se eliminan, siguen siendo totalmente funcionales, por lo que no considera el efecto de la uremia, permitiendo así el estudio de la exposición PDF en aislamiento. La cirugía consiste en introducir solamente el extremo distal del catéter en la cavidad peritoneal y colocar el puerto de acceso en la parte posterior del animal, proporcionando acceso a ella. El procedimiento para colocar el catéter es el siguiente:

1. Coloque el ratón en una cámara de inducción y proporcionar anestesia con isoflurano 4% y el oxígeno con un caudal de 0,4 L/min hasta pérdida del reflejo de enderezamiento.
   1. Mantener al animal con 2% de isoflurano en oxígeno al 100% con un caudal de 0,3 L/min por medio de un tubo de espiga conectado al aparato de anestesia. Confirmar la anestesia apropiada mediante la evaluación del tono muscular y respuesta a la estimulación.
   2. Comprobar la velocidad y profundidad de la respiración durante todo el proceso. Usar ungüento veterinario en los ojos para evitar sequedad mientras esté bajo anestesia. Es preferible si los procedimientos se realizan en un flujo para asegurar el mantenimiento de condiciones estériles durante cirugías.
2. Afeitarse el flanco derecho y la parte posterior de los animales con el fin de realizar la cirugía y después inyectar el líquido en el puerto de acceso en un área limpia. Coloque el animal en posición lateral descansando sobre su flanco izquierdo en la mesa quirúrgica, con un sistema térmico para asegurar que la temperatura no bajará.
3. Desinfectar la zona con solución de gluconato de clorhexidina 1%. Hacer un pequeño corte (0,5 cm) con tijeras embotadas de la piel en el flanco derecho del cuerpo y separar cuidadosamente con la ayuda de las tijeras de la capa del músculo adyacente, para que toda la zona de la espalda del animal es bien separada para luego poder introducir el puerto de acceso con facilidad. Consulte figura 1 para ver los materiales necesarios para seguir el procedimiento.
4. Hacer una pequeña incisión de aproximadamente 1 mm de diámetro a través de la capa muscular e inserte la punta del catéter y el primer anillo de plástico. El daño peritoneal es mínimo.
5. Sutura de la pared peritoneal firmemente alrededor del catéter, con una sutura no absorbible 5.0 o 6.0. Luego se encuentra un anillo de plástico dentro de la cavidad peritoneal y el otro entre el músculo y la piel. Tal modo se fija el catéter para evitar que el líquido se filtre en el espacio subcutáneo.
6. Introduzca el puerto de acceso en el espacio subcutáneo hacia la cola del ratón, sin sujeción a una posición de solución a la piel, como puede picar y los animales pueden rayar y pedacito de su piel.
7. Cerrar la herida de la piel con una sutura no absorbible 5.0 o 6.0. Eliminar la anestesia de inhalación y permitir que el animal a recuperar la conciencia. No descuide el ratón hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Cuando se recuperó completamente, ratón puede devolverse a la compañía de otros animales.
   Nota: Los experimentos pueden comenzar después de 4 a 7 días de recuperación postoperatoria.
8. Proporcionar analgesia disolviendo 3 mL de ibuprofeno (20 mg/mL) en 250 mL de agua potable para el día de la cirugía.
9. Durante el período post quirúrgico, verificar el estado de salud del animal todos los días, comprobar que no hay áreas enrojecidas en la piel, el pelo erizado o heridas.
10. Inyectar el líquido manteniendo el animal (sin anestesiarlo) por la cola y agarrar el puerto de acceso con una mano y la aguja con la otra. Desinfectar la zona con solución de gluconato de clorhexidina 1% antes de la inyección. Es interesante utilizar agujas especiales (agujas de Huber), que están biseladas para parte en lugar de perfora el tabique de silicona del puerto de acceso (figura 1A). Dos inyecciones por día durante 40 días son suficientes para observar alteraciones peritoneales (figura 3).
11. Al terminar el experimento, eutanasia ratón por asfixia dióxido de carbono o la dislocación cervical.

2. realizar una nefrectomía 5/6 y la colocación del catéter

Nota: Para mejor, se asemejan a la situación en pacientes con EP es posible realizar una nefrectomía 5/6, que permite sólo una función renal residual. En este caso, deben tomarse muestras de suero para analizar urea punción de niveles mediante la extracción de 250 μL de sangre a través de la vena facial, por lo menos un día antes de comenzar las cirugías, en el centro del tratamiento y al sacrificar los animales. Es preferible si los procedimientos se realizan en un flujo para asegurar el mantenimiento de condiciones estériles durante cirugías.

1. Anestesiar los ratones mediante el uso de isoflurano en el paso 1.1.
2. Proporcionar analgesia con 0.1 mg/kg de buprenorfina, inyectada por vía subcutánea en el cuello del animal y disolviendo 3 ml de ibuprofeno (20mg/ml) en 250 ml de agua potable para el día antes y el día de la cirugía.
3. Afeitarse los laterales y la parte posterior de los animales con el fin de realizar las cirugías y posteriormente inyectar el líquido en el puerto de acceso en un área limpia.
4. Realizar una incisión de aproximadamente 0,5 cm en la piel, en el lado izquierdo, cerca de las costillas, para tener acceso directo al riñón izquierdo.
5. Abrir una pequeña incisión en el músculo a tomar el riñón izquierdo fuera del peritoneo, retirar la cápsula y la glándula suprarrenal. Para quitar la cápsula es necesario sujetar mejor el riñón fuera de la cavidad peritoneal.
6. Quemar y cortar los extremos del riñón con un cauterizador (ver figura 1 para materiales necesarios).
7. Reintroducir el riñón en la cavidad peritoneal y la sutura de las heridas en la piel y el músculo con sutura 5.0 o 6.0 insoluble.
8. Al día siguiente, completamente quitar el riñón derecho e Inserte el catéter usando la misma incisión para quitar el riñón. Otra vez, anestesiar el ratón con isoflurano e inyectar por vía subcutánea 0,1 mg/kg de buprenorfina justo antes del procedimiento quirúrgico. También se disuelven 3 ml de ibuprofeno (20mg/ml) en 250 ml de agua potable el día antes y el día de la cirugía.
9. Hacer una incisión en la piel de alrededor de 0,5 cm y con la ayuda de las tijeras, separar la piel en la parte posterior del animal el músculo para abrir el espacio donde se ubicará el puerto de acceso.
10. Realizar un corte en el músculo (sobre 0.3-0.4 cm) sacar el riñón derecho de la cavidad peritoneal.
11. Retire la cápsula y la glándula suprarrenal para tener mejor acceso al riñón. Ligar la vena renal, la arteria y el uréter con sutura no-absorbible 5.0 o 6.0 y retire completamente el riñón.
12. Sutura de la herida en el músculo peritoneal, introduciendo el extremo del catéter para que el músculo debe permanecer entre los dos anillos de plástico, como se ha explicado antes (criterio 1.5).
13. Introducir el puerto de acceso en el espacio subcutáneo y sutura de la piel como se explica en los pasos 1.6 y 1.7.
    Nota: Ratones deben reposar al menos 10 días de estas cirugías para asegurar que las heridas en el músculo peritoneal están completamente curadas y no habrá ninguna salida en el espacio subcutáneo mientras se inyecta el líquido. Inyectar el líquido como en el paso 1.10.
14. Al terminar el experimento, eutanasia a los animales por asfixia dióxido de carbono o la dislocación cervical.

Resultados

La figura 1 muestra todos los materiales necesarios para seguir los procedimientos descritos en la sección de protocolo. Para este ejemplo, ratones sometidos o no a nefrectomía (8 animales por grupo) (figura 2) fueron expuestos durante 40 días (dos inyecciones al día, espera al menos 2 horas entre ambos) a una mezcla de dos diferentes PDFs, comúnmente utilizado en la práctica clínica: Extraneal (icodextrina basado en PDF) ...

Discusión

Los primeros datos publicados analizando alteraciones PD usando una técnica de "cerrar sistema" fue realizados en el 2009²⁹ . Este sistema de cierre significa que todo el dispositivo se encuentra dentro del cuerpo y fluido se inyecta con una aguja a través de un puerto de acceso. El problema técnico más importante en los modelos animales a largo plazo de la infusión de líquido a través de un catéter es la ocurrencia de la obstrucción. Posibles opciones son realizar omentectomy o añadir h...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 ga. X 1/2´´	Access technologies	PG25-500
High Temperature Cautery Kit	Bovie	18010-00
Forane	abbVie	880393.4 HO
non absorbable suture 6/0	Laboratorio Agaró	6121
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
forceps	Fine Science Tools	11002-12
clamp	Fine Science Tools	13002-10
Buprenorphine 0,3 mg/ml			pharmaceutical product
cotton swabs			pharmaceutical product
Dalsy (Ibuprofen) 20mg/mL oral suspension	AbbVie S.R.L.		pharmaceutical product