القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع الفطري وجسم الخلية

Quigly Dragotakes; Arturo Casadevall

doi:10.3791/56957

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ويصف هذا الأسلوب معالج صورة دفعي الآلي المصممة لقياس إنصاف أقطار الجسم وكبسولة السكاريد. بينما في البداية مصممة لقياسات المرسلة بين كبسولة يمكن أيضا تطبيق معالج الصور الآلي الأخرى الكشف عن التباين على أساس من الكائنات دائرية.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب لتوفير عملية متسقة ودقيقة، ويمكن التحكم فيها لعدد كبير من القياسات كبسولة السكاريد.

أولاً، يتم إنشاء صورة عتبة استناداً إلى قيم الكثافة حساب فريد لكل صورة. ثم، يتم الكشف عن الدوائر استناداً إلى التباين بين الكائن والخلفية باستخدام خوارزمية التحويل هوغ دائرة (CHT) الراسخة. وأخيراً، تتم مطابقة كبسولات الخلية المكتشفة والهيئات وفقا لإحداثيات مركز وحجم دائرة نصف قطرها، ويتم تصدير البيانات إلى المستخدم في جدول بيانات يمكن التحكم فيها.

مزايا هذه التقنية بسيطة ولكنها هامة. أولاً، لأنه يتم تنفيذ هذه العمليات الحسابية خوارزمية بدلاً من إنسان زيادة الدقة والموثوقية. لم يكن هناك أي انخفاض في دقة أو موثوقية بغض النظر عن كم عدد العينات ويتم تحليل. ثانيا، هذا النهج يضع إجراءات تشغيل موحدة محتملة للحقل بين بدلاً من الوضع الراهن حيث يختلف القياس كبسولة من مختبر. ثالثا، نظراً لأن قياسات كبسولة اليدوية بطيئة ورتيبة، يسمح أتمتة القياسات السريعة على عدد كبير من خلايا الخميرة الذي بدوره يسهل تحليل البيانات عالية الإنتاجية وإحصاءات قوية على نحو متزايد.

تأتي القيود الرئيسية لهذا الأسلوب من كيفية وظائف الخوارزمية. أولاً، سوف تولد الخوارزمية الدوائر. بينما بين الخلايا وعلى كبسولات تأخذ على مورفولوجيا دائرية، سيكون من صعوبة في تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن كائن غير دائرية. ثانيا، بسبب كيفية الكشف عن الدوائر يمكن الكشف عن الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج هائلة الدوائر الزائفة استناداً إلى الحواف الخارجية لعدة دوائر متفاوت المسافات. ومع ذلك، أي الهيئات الخلية محرفة اشتعلت داخل دائرة الزائفة يمكن بسهولة الكشف عن وإزالتها من مجموعات البيانات الناتجة.

المقصود من هذا الأسلوب لقياس كبسولات السكاريد دائرية بين الأنواع استناداً إلى الحبر الهند ميدان مشرق المجهري؛ على الرغم من أنه يمكن أن تطبق على أساس التباين الأخرى قياسات كائن دائري.

Introduction

هو المرسلة بين خميرة المسببة للأمراض العثور على أوبيكويتوسلي من جميع أنحاء العالم التي ترتبط مع الأمراض البشرية أساسا في إيمونوسوبريسيد السكان. وتستأثر المرسلة جيم- أبرزها سببا هاما من مجموع الوفيات السنوية في أفريقيا جنوب الصحراء بسبب الأمراض المعدية¹. المظاهر السريرية الرئيسية الإصابة الفطري هو التهاب السحايا والدماغ، الذي يتبع غزو للجهاز العصبي المركزي بالنقل في الضامة المصابة (طريقة حصان طروادة) أو مباشرة من عبور حاجز الدم في الدماغ. جيم-المرسلة وتعرب عن عدة عوامل الفوعة بما في ذلك القدرة على إجراء نسخ متماثل في درجة حرارة جسم الإنسان والنشاط آريس، شكل الميلانين وتشكيل السكاريد كبسولة². كبسولة السكاريد يتكون من تكرار جلوكورونوكسيلومانان والبوليمرات جلوكورونوكسيلومانانجالاكتان والمهام كحاجز وقائي ضد عوامل الإجهاد البيئي و الاستجابات المناعية المضيف².

على الرغم من أن حجم الحجم الكبسولة السكاريد الفطري لم يكن دائماً مقترنة بضراوة، هناك أدلة على أنها عامل في نشوء المرض²^،³^،^،من⁴⁵^، ⁶^،⁷. الحجم الكبسولة يرتبط ب أمراض التهاب السحايا⁶ويمكن أن تؤثر على بلعم القدرة على التحكم في العدوى بين ⁵، ويمكن أن يؤدي فقدان الفوعة إذا تغيب⁸. ومن ثم، قياسات الحجم الكبسولة المشتركة في البحوث الفطري، لكن هناك لا فيلدويدي القياسية لطريقة قياس الكبسولة.

في الوقت الراهن، المرسلة C. السكاريد كبسولة قياس يستند إلى دليل قياسات الصور مجهرية، وتختلف أساليب الشراء الصورة والقياس الدقيق عبر المختبرات⁹^،¹⁰^، ¹¹. مصدر قلق فوري لهذا الأسلوب هو أن بعض الدراسات تتطلب الحصول على آلاف قياسات الفردية، مما يجعل من الصعب الحفاظ على الدقة والموثوقية. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم نشر النتائج، هناك غالباً عدم كفاية وصف طريقة القياس. العديد من المنشورات لا تفسر كيف تم الحصول على هذه القياسات، واستخدمت ما هو المستوى البؤري، وكيفية تحديد الحد الأدنى لتحديد الكبسولة، سواء كانوا نصف القطر أو القطر، وما إذا كانت تستخدم في قياس واحد أو بلغ عدة، أو غيرها التفاصيل. بعض المنشورات الدولة الوحيدة على الأسلوب كالبرنامج الذي المستخدم، مثلاً، "أدوبي فوتوشوب CS3 استخدمت لقياس الخلايا"¹¹. وهذا الافتقار إلى التوحيد القياسي، والإبلاغ عن تفاصيل يمكن جعل إمكانية تكرار نتائج صعبة إذا لم يكن من المستحيل. شريحة الاختلافات في البصر البشري، وسطوع الكمبيوتر، إعدادات المجهر، الإضاءة، وعوامل أخرى يمكن أن تختلف ليس فقط بين الأفراد ولكن بين العينات، بينما العمليات الحسابية المستندة إلى نسب لقيم الكثافة بكسل سوف تظل ثابتة و المعمول بها بين العينات. تم إنشاء هذا الأسلوب في سياق توفير تقنية موحدة ودقيقة وسريعة وبسيطة لقياس الأحجام كبسولات لحقل الذي كان هناك لا شيء قبل.

كما ذكر آنفا، الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج منذ أمد طويل، وقد كتب بالكشف تلقائياً عن دوائر البرامج النصية قبل. ويحسن هذا الأسلوب في هذين المجالين حيث سيقع مخطوطات أخرى قصيرة. أولاً، مجرد الكشف عن الدوائر لا يكفي، لأنه يجب الكشف عن دائرتين متميزة مع خلايا الفطري بالنسبة لبعضها البعض. هذا الأسلوب يكتشف الهيئات الخلية داخل كبسولات على وجه التحديد، يميز بين الاثنين، ويتولى إجراء العمليات الحسابية فقط على أزواج كبسولة الهيئة ذات الصلة. ثانيا، حتى عند اتباع نفس البروتوكول، والمحققين مختلفة سوف ينتهي مع مختلف الحصول على الصور. السماح بمراقبة كل معلمة خوارزمية المحقق، يمكن تعديل هذه الأداة لتتناسب مع مجموعة واسعة من طرق اكتساب. ليس هناك حاجة لنطاق موحدة، والهدف، والتصفية، وهكذا.

يمكن تطبيق هذا الأسلوب يسهل على أي الحالة التي يحتاج المحقق إلى الكشف عن الدوائر داخل صورة هذا التباين مع خلفيتهم. كل الدوائر أخف وزنا وأكثر قتامة مما يمكن الكشف عن خلفيتهم، عد، وتقاس باستخدام هذا الأسلوب.

Protocol

1-إعداد الشرائح الحبر الهند

"الماصة؛" 10 ميكروليتر من عينة الفطري إلى شريحة. سيعمل أي سلالة الخميرة التعميم ولكن لهذه التجربة كان H99 السلالة الوحيدة المستخدمة.
ملاحظة: إذا كانت العينة مباشرة من وسائط الثقافة، تمييع 1:2 مع برنامج تلفزيوني أو المياه يمكن أن تساعد على منع الحبر الهند من التثاقل.
"الماصة؛" 2 ميليلتر من وصمة الحبر الهند على العينة ومزيج ماديا دفع طرف الماصة للعينة وتتحرك في حركة دائرية حتى يظهر الحبر الهند موزعة بالتساوي.
ضع ساترة على العينة بالضغط باستمرار على الحافة اليسرى من ساترة ضد سطح الشريحة، ثم بلطف وبشكل متساو خفض الجانب المعاكس ساترة على العينة.
تسمح الشريحة للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
بلطف تطبيق طبقة خفيفة من طلاء الأظافر على الحدود ساترة لتشكيل ختم والحفاظ على وصمة الحبر الهند.

2-تصوير الشريحة

وضع الشرائح في مجهر حقل مشرق مع مرفق الكاميرا والمعروفة بكسل إلى ميكرون التحويل. ضبط عوامل التصفية، وأهداف، والتباين حيث أن الكبسولات الخلية واضحة والهيئات الخلية عصابات الظلام، مركزة.
ملاحظة: مختلف المرشحات، والأهداف، وإعدادات التباين ستعمل ولكن ينصح 20 × الهدف وتصفية Ph1 binning 2 × 2.
ضمان مجال الرؤية كثيفة ولكن لا المكتظة بالسكان مع خلايا الفطري، مع تباين واضح بين كبسولة الخلية والخلفية، ومركزة بشكل صحيح مع خلايا الجسم تصور كعصابة الظلام.
ملاحظة: العدد الدقيق للخلايا لصورة مثلى ستختلف بعينه والهدف قيد الاستخدام. الجوانب الهامة لضمان الخلايا غير متفاوت المسافات أو متداخلة، وأن الطائرتين تنسيق الخلية لا تختلف اختلافاً كبيرا، وأنه لا يوجد كبير الهند الحبر وصمة عار مرئية بوضوح في الخلفية (25 في المائة على الأقل من الحقل).
حفظ الصور بدليل واحد مع عناوين واضحة، كما سيتم تشغيل خوارزمية القياس على الصور في دليل واحد، وسيتم تنظيم بيانات الإخراج حسب أسماء ملفات الصور.

3-خوارزمية برنامج الإعداد

تثبيت بيثون الإصدار 2.7 من
تثبيت مكتبات بايثون إضافية عن طريق تشغيل الأوامر "نقطة تثبيت وسادة" و "تثبيت برنامج تطبيق السلام أوبينبيكسل".
تثبيت MATLAB باتباع الإرشادات التي تظهر في
بناء مكتبة بيثون MATLAB باتباع الإرشادات المتوفرة في https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
تنزيل الملفات المطلوبة الثلاث المدرجة في "المواد التكميلية" هذه المخطوطة ("QCA.py" و "Analysis2.m" و "TestRun.m").
ملاحظة: يمكن استخراج هذه الملفات إلى أي مكان، ولكن يجب أن يكون الثلاثة في نفس الدليل.

4-استخدام خوارزمية

قم بتشغيل التطبيق بالنقر المزدوج على QCA.py.
ملاحظة: التطبيق قد يستغرق عدة دقائق لبدء. يحتوي الملف "QCA.py" على هيكل البرنامج الذي يستدعي الملفات ".m" لتشغيل خوارزمية الفعلية.
اتبع الخطوات الموضحة في البرنامج.
1. إدخال نوع ملحق ملفات الصور التي تسبقه فترة ومفصولة بفواصل منقوطة (ex. ". معرض طرابلس؛. jpeg ") ثم اضغط على الزر Enter .
2. اختر الدليل الذي توجد ملفات الصور بالنقر فوق الزر تحديد دليل تحديد المجلد الذي يحتوي على الصور.
3. إنشاء قائمة ملفات الصور في الدليل عن طريق النقر فوق الزر إنشاء قائمة الصور . سيتم سرد الصور في مربع النص إلى اليمين. مراجعة والتأكد من القائمة دقيقة وكاملة.
4. حدد صورة عشوائية من القائمة لاستخدامها كمعاينة قبل النقر فوق الزر تحديد صورة عشوائية .
  ملاحظة: إذا كانت الصورة غير قادر على فتح بسبب "خطأ وضع صورة غير صحيحة"، الخوارزمية سوف لا تزال تعمل بشكل صحيح على الرغم من عدم عرض الصورة. بعد خطوة 4.2.7، لا يزال سيتم عرض صورة الاختبار.
5. مجهر الإدخال الهدف و binning الإعدادات. إذا لم تتطابق المجهر يستخدم الإعدادات الافتراضية، حدد "مخصص بكسل تحويل '' والمدخلات بكسل-إلى-أم التحويل لملفات الصور. وبمجرد اختيار، انقر فوق الزر حساب التحويل وضمان التحويل بشكل صحيح وفقا لمربع النص على الحق.
  ملاحظة: الصور التمثيلية هو مبين في الشكل 1 حسبت مع 40 x التكبير و 2 × 2 binning المحددة.
6. إدخال معلمات خوارزمية للكشف عن الدائرة.
  1. إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن كبسولة الخارجي كإدخالات Min و Max كبسولة Radius. مجموعة أصغر تسمح نتائج أكثر دقة.
  2. إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن خلايا الجسم كإدخالات دقيقة ونصف قطر جسم الخلية ماكس.
    ملاحظة: كل أربعة من هذه الإدخالات يجب أن تكون الأرقام تمثل قيمها كل بكسل، وفقا لمصدر الصور.
  3. حرك مربعات التمرير الكبسولة وحساسية خلايا الجسم لضبط عتبة حساسية الخوارزمية. حساسية منخفضة ستكون صارمة والحد من الكشف عن دائرة إيجابية كاذبة، ولكن يمكن أيضا الكشف عن الدوائر الحقيقية أقل. على العكس من ذلك، ستزيد من معدل اكتشاف حساسية عالية لكن قد ينتج أيضا عن دوائر إيجابية كاذبة.
    ملاحظة: تم الحصول على النتائج الممثلة مع الحد الأدنى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 7، الحد الأقصى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 45، نصف قطر الجسم الحد الأدنى من 4، الجسم أقصى دائرة نصف قطرها 30، حساسية كبسولة من 87، وحساسية الجسم من 87.
7. اختبار المعلمات على الصورة تم اختيارها عشوائياً بواسطة النقر فوق الزر تشغيل الاختبار . سيتم عرض النتائج في مركز العليا للبرنامج، استبدال الصورة الأصلية. إذا كانت النتائج تبدو دقيقة، من المستحسن لتحديد صورة عشوائية إضافية لمحاولة كذلك لكفالة المعلمات المحددة تناسب كافة الصور المحددة.
  1. زيادة عدد الهيئات والكشف عن كبسولات وبصريا فحص ما إذا كانت الدوائر التي تظهر لتناسب بشكل صحيح. سيتم عرض العدد الهيئات داخل كبسولات كشف في مربع النص إلى اليمين. وبخلاف ذلك، معالجة معلمات خوارزمية حتى تكون النتائج دقيقة.
    ملاحظة: دوائر ملونة سميكة فقط للمساعدة في التصور. الدوائر الفعلية التي تم إنشاؤها لقياس منحنى رياضية حسابها بواسطة خوارزمية كليات التقنية العليا.
8. تشغيل خوارزمية الكشف على الدليل بأكمله لملفات الصور بالنقر فوق زر البدء في التحليل . وسيتم تحليل كل صورة، وسيعرض البرنامج "انتهت" في مربع النص إلى اليمين عند كل الصور قد تم تحليلها.
9. انقر فوق الزر المباراة وتنظيف . وهذا تتطابق مع الهيئات الخلية المكتشفة على كبسولات المكتشفة يقيمون في، وحساب نصف قطر كبسولة الحقيقية عن طريق طرح مجموعة من كبسولة.
  ملاحظة: إذا كان يتم استخدام الخوارزمية للكشف عن الأسفار أو حالة أخرى فيها دائرة واحد فقط الكشف عن هذه الخطوة غير ضرورية. بدلاً من ذلك انقر فوق سحب الهيئات فقط أو الزر سحب كبسولات فقط لجمع البيانات للأزرق فقط أو فقط دوائر خضراء، على التوالي. من المهم ملاحظة أن إلا إذا كان يتم استرداد البيانات كبسولة دائرة نصف قطرها سوف تشير إلى مجموع نصف قطر الخلية كما لا يمكن طرح نصف قطر جسم الخلية.
10. تحديد موقع البيانات المنجزة في الملف "CleanedOuput.csv" في الدليل الصورة. إلا إذا تم اختيار قطعة واحدة من البيانات، سيتم تسمية الملف "CleanedBodies.csv" أو "CleanedCapsules.csv".

النتائج

يتم أولاً الحصول على الصور بالفحص المجهري للحبر الهند الشرائح باستخدام مجهر حقل مشرق مقترنة بكاميرا (الشكل 1أ). من المهم أن تكون الخلايا المنفصلة وفي كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لا باكتساح ميدان عرض، كذلك فيما يتعلق باستخدام وصمة عار ما يكفي لخل...

Discussion

الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب هي إعداد الشريحة الحبر الهند وحيازة صور المجهر. حين تم بنجاح اختبار الخوارزمية مع مجموعة متنوعة من تقنيات الشريحة والصورة هو وصف البروتوكول الموصى بها في هذه المخطوطة. تم الكشف عن الكبسولة السكاريد استناداً إلى استبعاد جزيئات الحبر الهند من المجال الكبسولة ك...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن نعترف بوين أنتوني الشرائح التي استخدمت كمقارنة جنبا بجنب بشرية ثانية فضلا عن نولان سابرينا الشرائح التي استخدمت كثالث البشرية-جنب والثانية مجهر المقارنة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813

References

Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: