クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

要約

この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

要約

このテクニックの目的は、多数多糖類カプセル測定の一貫性のある、正確、かつ管理可能なプロセスを提供することです。

まず、一意に各イメージの計算された強度値に基づくしきい値のイメージが生成されます。その後、円は、オブジェクトと老舗サークル Hough 変換 (CHT) アルゴリズムを使用して背景のコントラストに基づいて検出されます。最後に、検出された細胞カプセルとボディ中心座標と半径のサイズと一致し、データが管理可能なスプレッドシートのユーザーにエクスポートします。

この手法の利点は、シンプルだが重要なです。最初に、これらの計算は人間ではなく、アルゴリズムによって実行されるので精度と信頼性を向上します。 正確性や信頼性に関係なく、どのように多くのサンプルは、分析の減少はありません。第 2 に、このアプローチは、クリプトコッカスフィールド カプセル測定がラボによって現在の状況ではなく潜在的な標準操作手順を確立します。第三に、手動カプセル測定されますがゆっくりと単調なため、オートメーションは高スループット データ解析およびますます強力な統計を円滑に多数の酵母細胞の迅速な測定ができます。

この技術の主要な制限方法から来るアルゴリズム関数。まず、アルゴリズムだけ円が生成されます。クリプトコッカス細胞と彼らのカプセルで円形の形態にかかる、非円形オブジェクトを検出するこの手法を適用することは困難でしょう。第二に、円を検出する方法のため、CHT アルゴリズムはクラスター化されたいくつかの円の外側のエッジに基づく巨大な擬似円を検出できます。ただし、擬似サークル内でキャッチすべての誤って細胞体簡単に検出できその結果のデータ セットから削除されます。

この手法は、インドのインク明視野顕微鏡に基づくクリプトコッカス属円形多糖類のカプセルを測定用適用される可能性が他のコントラストは円形オブジェクトの測定を用いた。

概要

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス免疫抑制の人口に主にひと疾患に関連付けられている世界中で普遍的見つける病原性酵母です。クリプトコッカスは、特に感染症¹のためのサハラ以南アフリカで合計年間死亡の重要な原因を占めています。クリプトコッカス感染症の主な臨床症状は髄膜脳炎は、感染させた大食細胞 (トロイの木馬方法) の輸送によって中枢神経系の侵略に続くまたは血液-脳関門の直接交差。クリプトコッカスは、人間の体温、ウレアーゼ活性、メラニン化、多糖類カプセル²の形成で複製する機能を含むいくつかの病原因子を表しています。多糖類のカプセルは、環境ストレス、ホスト免疫反応²等に対する防護壁として glucuronoxylomannan と glucoronoxylomannangalactan ポリマーおよび関数を繰り返しので構成されます。

クリプトコッカス多糖類カプセルのサイズが一貫して関連付けられていない病原性、病態^{2,3,4、5の要因であることの証拠があります。 6,7}。カプセル サイズ髄膜炎病理学⁶に関連付けられて、クリプトコッカス感染症⁵を制御するマクロファージの機能に影響を与えることができます、⁸不在の場合の病原性の低下を招きます。したがって、クリプトコッカスの研究では、一般的なカプセルのサイズ測定がカプセル測定方法の標準的な fieldwide はありません。

現在、クリプトコッカス多糖類のカプセル測定、顕微鏡画像の手動測定に基づいており、画像と計測の両方の買収の正確なメソッドは、研究所^{9,10、間で異なります 11}。このメソッドの当面の関心事は、いくつかの研究では、精度と信頼性の維持を困難にする個々 の測定の何千もの取得を必要とします。さらに、結果を公開するときにもしばしばある測定法の不十分な説明。多くの出版物は彼らの測定値が得られた方法を説明しないかどうか、彼らは 1 つの測定を使用またはいくつか、または他の平均、半径または直径が使用されるかどうか、彼らはカプセルの識別のためのしきい値を決定する方法は、どのような焦点平面が使用されました。詳細。いくつかの出版物だけの状態プログラムとしての法を用い, 例えば、「Adobe Photoshop CS3 使用されたセルを測定する「¹¹。標準化およびレポートの詳細のこの欠乏、再現困難不可能ではない場合。人間の視力、コンピューターの明るさ、顕微鏡設定の違いは、照明、スライドおよび他の要因は、ピクセルの明度の値の比率に基づいて計算は一定になりますが、個人間だけでなく、サンプル、間変わることができるとサンプルとの間に適用されます。この手法は、カプセルの前にどれもなかったフィールドのサイズを測定する標準化された、正確、迅速、簡単な手法を提供することのコンテキストで生成されました。

前述したように、CHT アルゴリズムは, 老舗し、サークルを自動的に検出するスクリプトは、前に書かれています。このメソッドは、他のスクリプトの短い秋、2 つの分野で向上します。まず、円を検出するだけ十分ではない、クリプトコッカス細胞 2 つの明瞭な円は互いに関連して検出する必要がありますので。このメソッドは具体的にカプセル内の細胞体を検出し、両者の差別、関連体カプセル ペアでのみ計算を実行します。第二に、でもときに続いて同じプロトコル、別の捜査官で終る異なる画像を取得しました。捜査官すべてアルゴリズム パラメーター制御を許可すると、このツールは、取得方法の広い範囲を一致するように調整できます。標準化されたスコープ、目的、フィルターの必要はありません。

この手法は、調査官がその背景とは対照的イメージ内の円の検出する必要がありますどのような状況に容易に適用できます。両方円軽量化とその背景を検出できるより暗くカウント、およびこの手法を用いて測定します。

プロトコル

1. インドのインク スライドの準備

1. スライドにクリプトコッカス サンプルの 10 μ L をピペットします。すべての円形の酵母が動作しますが、この実験のため H99 は使用される唯一のひずみ。
   注: 文化メディアから直接サンプルの場合は、1:2 PBS または水で希釈すること防ぐことができますインドのインク群生します。
2. 2 μ L のサンプル上にインドのインク汚れをピペットし、ミックスを物理的にピペット チップをサンプルにプッシュおよびインドのインクが均等に配置された表示されるまで円を描くように移動します。
3. サンプルに、やさしく均等にサンプル上、coverslip の反対側を下げる、スライドの表面に対して coverslip の左端を押しながら観察を置きます。
4. 5 分間乾燥空気にスライドを許可します。
5. 軽くシールを形成およびインドのインク汚れを保持する coverslip 罫線にマニキュアの発光層を適用します。

2. 画像スライド

1. カメラの付属品および知られているピクセル-ミクロン変換明視野顕微鏡でスライドを配置します。細胞カプセルが明確と細胞体は焦点を当て、暗いバンド フィルター、目標、およびコントラストを調整します。
   注: さまざまなフィルターがあり、目的、およびコントラストの設定は、動作しますが、目的、Ph1 のフィルター、および 2 × 2 ビン × 20 が推奨されます。
2. ビューのフィールドは密がクリプトコッカス細胞、細胞カプセルと背景のコントラストがはっきりとない過密、暗いバンドとして視覚化細胞体で正しく焦点を確認します。
   注: サンプルや使用目的に応じて最適な画像のための細胞の正確な数が異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。
3. 単一ディレクトリ内の画像の計測アルゴリズムが実行され、出力データをイメージ ファイルの名前によると整理すると明確なタイトルを持つ単一のディレクトリに画像を保存します。

3. アルゴリズム設定

1. Python のバージョン 2.7 をインストールします。
2. 「Pip インストール枕」コマンドを実行して追加 python ライブラリをインストールし、"pip は、openpyxl をインストール"します。
3. 次の手順に従って、MATLAB をインストールします。
4. ビルド https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html で提供される指示に従い、MATLAB の python ライブラリ。
5. この原稿の補足資料 ("QCA.py"、"Analysis2.m"、"TestRun.m") に含まれている 3 つの必要なファイルをダウンロードします。
   メモ: これらのファイルは任意の場所に解凍することができますが、すべての 3 つは、同じディレクトリにある必要があります。

4. アルゴリズムの使用

1. QCA.py をダブルクリックして、アプリケーションを実行します。
   注: アプリケーションを起動するのに数分をかかる場合があります。"QCA.py"ファイルには、実際のアルゴリズムを実行する".m"ファイルを呼び出すプログラムの構造が含まれています。
2. プログラムに記載されている手順に従います。
   1. 入力画像ファイルの拡張子の前にピリオドをセミコロンで区切る (ex.」。TIF;。"jpeg) し、 Enterボタンをクリック。
   2. 画像ファイルがあるディレクトリの選択]ボタンをクリックすると画像が含まれているフォルダーを選択するディレクトリを選択します。
   3. イメージ リストの生成ボタンをクリックしてディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成します。画像は、右側のテキスト ボックスに表示されます。確認し、リストが正確で完全なことを確認します。
   4. ランダム イメージの選択] ボタンをクリックしてプレビューとして使用するリストからランダムな画像を選択します。
      注: イメージは「誤ったイメージ モード エラー」のために開くことができる、アルゴリズムがまだ正しく動作にもかかわらず画像が表示されません。4.2.7 のステップの後、テスト画像が表示されます。
   5. 対物レンズとビニング設定を入力します。既定の設定で使用される顕微鏡が一致しない場合「カスタム ピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセル-に-um 変換を入力します。一度選択すると、変換の計算ボタンをクリックし、変換が右側のテキスト ボックスによると正しいを確認します。
      注: x 倍率と 2 × 2 ビン選択 40 と図 1に示すように代表的な画像を求めた。
   6. 円検出のアルゴリズム パラメーターを入力します。
      1. Min と Max カプセル半径エントリとして外側のカプセル検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。小さい範囲はより正確な結果になります。
      2. Min と Max の細胞体半径のエントリとして細胞体検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。
         注: これらのエントリのすべての 4 つは、ソース画像によるとそれぞれの値 (ピクセル単位) を表す番号をする必要があります。
      3. アルゴリズムの感度閾値を調整するカプセルと細胞体感度のスライダーを移動します。低感度に厳格される偽の肯定的な円検出の削減、少ない真円の検出可能性がありますも。逆に、感度の高い検出率は増えますが、偽肯定的なサークルもあります。
         注: 代表的な結果は、7 の最小カプセル半径、最大 45 カプセル半径、最小体半径 4、30 の本文の最大半径、87、カプセルの感度と 87 の体感度が得られました。
   7. テストの実行ボタンをクリックして、ランダムに選択したイメージのパラメーターをテストします。結果は、元のイメージの交換プログラムの上部中央に表示されます。正確な検索の結果場合は、同様に選択したパラメーターはすべて選択した画像に収まることを確認しようとする追加のランダムなイメージを選択することをお勧めします。
      1. ボディの数を最大化し、カプセルが検出され、正しく収まるように円が表示されるかどうかを目視で確認します。検出されたカプセル内に遺体を数は、右側にテキスト ボックスに表示されます。それ以外の場合、結果が正確になるまでは、アルゴリズム パラメーターを操作します。
         注: 濃い色のついた丸は、可視化を支援するだけです。測定用に生成された実際のサークルは、HCT アルゴリズムによって計算される数学的な曲線です。
   8. 画像ファイルのディレクトリ全体に検出アルゴリズムを実行するには、 [分析の開始] ボタンをクリックします。各イメージ分析を行い、プログラムが表示されます「終了」、右側のテキスト ボックスにすべての画像の分析が完了したとき。
   9. 一致およびクリーンアップ] ボタンをクリックします。彼らは内に存在する検出されたカプセルに検出された細胞体に一致、カプセルから身を引いて真のカプセルの半径を計算します。
      注: 蛍光を検出するアルゴリズムが使用されている場合のみ 1 つの円がある別の状況はこの手順を検出必要はありません。代わりに引いて体のみまたはプル カプセルのみボタンそれぞれのみ、青または緑の円のみのデータを収集するをクリックします。カプセルのデータが取得される場合にのみ、半径が参照するセルの合計半径細胞体の半径を引かれませんよう注意することが重要です。
   10. 画像ディレクトリの"CleanedOuput.csv"ファイルに完成品のデータを検索できます。1 つのデータを選択した場合にのみ、ファイルは"CleanedBodies.csv"または"CleanedCapsules.csv"ラベルがされます。

結果

画像は、カメラ (図 1A) と相まって明るいフィールド顕微鏡を使用してインドのインク スライドの顕微鏡観察によって得られる最初。細胞分離とセルと背景のコントラストを作成する十分な汚れを使用して、ビューのフィールドを同様負荷をかけないように十分に低密度を持つことが重要です。プロトコルで述べたように、最適な画...

ディスカッション

この手法の重要なステップはインドのインク スライドを準備、顕微鏡画像を取得します。さまざまなスライドと画像技術が正常にテストされてアルゴリズム間の推奨プロトコルはこの原稿で説明されます。これらの粒子が大きすぎて多糖類の線維ネットワークに侵入すると、カプセルのドメインからインドのインク粒子の排除に基づく多糖類カプセルが検出されました。インドのインク除外...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813