Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

Riepilogo

Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

Abstract

Lo scopo di questa tecnica è quello di fornire un processo coerenza, preciso e maneggevole per un gran numero di misure di capsula del polisaccaride.

In primo luogo, un'immagine di soglia viene generata in base ai valori di intensità in modo univoco calcolato per ogni immagine. Quindi, cerchi vengono rilevati basato sul contrasto tra oggetto e sfondo utilizzando l'algoritmo di trasformazione di Hough cerchio (CHT) ben consolidata. Infine, rilevato cellulare capsule e corpi sono abbinati secondo le coordinate del centro e la dimensione del raggio, e i dati vengono esportati per l'utente in un foglio di calcolo gestibile.

I vantaggi di questa tecnica sono semplici ma significativi. Primo, perché questi calcoli vengono eseguiti da un algoritmo piuttosto che un essere umano sia di precisione e di affidabilità sono aumentati. Non c'è nessun declino nella precisione o affidabilità indipendentemente da quanti campioni vengono analizzati. In secondo luogo, questo approccio costituisce una potenziale procedura operativa standard per il campo di Cryptococcus invece la situazione attuale, dove la capsula misura varia da laboratorio. In terzo luogo, dato che misure capsule manuali sono lento e monotono, l'automazione consente misure rapide su grandi numeri di cellule di lievito che a sua volta facilita l'elevato throughput dati analisi e statistiche sempre più potenti.

Le limitazioni principali di questa tecnica provengono da come le funzioni di algoritmo. In primo luogo, l'algoritmo genererà solo cerchi. Mentre le cellule Cryptococcus e loro capsule assumono una morfologia circolare, sarebbe difficile applicare questa tecnica al rilevamento di oggetti non circolare. In secondo luogo, a causa di come vengono rilevati cerchi l'algoritmo CHT può rilevare enormi pseudo-cerchi basati sui bordi esterni di parecchi cerchi in cluster. Tuttavia, eventuali corpi cellulari travisati catturati all'interno del pseudo-cerchio di possono essere facilmente rilevati e rimossi dal set di dati risultante.

Questa tecnica è destinata a misurare le capsule di polisaccaride circolare di Cryptococcus specie basato su microscopia del campo luminoso dell'inchiostro di India; anche se potrebbe essere applicato ad altri contrasto base misure oggetto circolare.

Introduzione

Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno trovato ubiquistmente intorno al globo che è associato con la malattia umana soprattutto in popolazioni immunosuppressed. C. neoformans in particolare rappresenta una causa significativa del totale dei decessi annuali nell'Africa subsahariana, a causa di malattie infettive¹. La manifestazione clinica principale dell'infezione criptococcica è meningoencefalite, che segue l'invasione del sistema nervoso centrale con i mezzi in macrofagi infetti (Trojan horse maniera) o traversate dirette della barriera sangue - cervello. C. neoformans esprime numerosi fattori di virulenza, compresa la possibilità di replicare a temperatura del corpo umano, attività ureasica, melanizzazione e la formazione di una capsula del polisaccaride². Capsula del polisaccaride è composto di ripetizione glucuronoxylomannan e polimeri glucoronoxylomannangalactan e funzioni come una barriera protettiva contro fattori come lo stress ambientale e host le risposte immunitarie².

Sebbene la dimensione della dimensione della capsula del polisaccaride criptococcica non è sempre stata associata con virulenza, c'è prova che è un fattore nella patogenesi^{2,3,4,5, 6,7}. Taglia capsula è associato con la meningite patologia⁶, possa influenzare la capacità dei macrofagi di controllare Cryptococcus infezione⁵e può provocare la perdita di virulenza se assenti⁸. Quindi, capsula dimensione misurazioni sono comuni nella ricerca criptococcica, ma non c'è nessun fieldwide standard per un metodo di misurazione capsula.

Attualmente, c. neoformans polisaccaride capsula misurazione si basa su misurazioni manuali di immagini di microscopia, e i metodi esatti delle acquisizioni di misura e di immagine variano attraverso laboratori^{9,10, 11}. Un immediato interesse per questo metodo è che alcuni studi richiedono l'acquisizione di migliaia di misurazioni individuali, che rende difficile il mantenimento di accuratezza e affidabilità. Inoltre, anche quando i risultati sono pubblicati, c'è spesso insufficiente descrizione del metodo di misurazione. Molte pubblicazioni non spiegano come le loro misure sono state ottenute, che piano focale è stato utilizzato, come hanno determinato la soglia per l'identificazione di capsula, se hanno usato il raggio o il diametro, se hanno utilizzato una misurazione o una media diversi, o altri dettagli. Alcune pubblicazioni solo stato loro metodo come programma che è stato utilizzato, ad esempio, "Adobe Photoshop CS3 è stato usato per misurare le cellule"¹¹. Questa mancanza di standardizzazione e reportistica di dettaglio può fare la riproducibilità difficile se non impossibile. Differenze di vista umana, luminosità computer, impostazioni di microscopio, far scorrere l'illuminazione e altri fattori possono variare non solo tra gli individui, ma anche tra i campioni, considerando che i calcoli basati su rapporti di valori di intensità di pixel rimarrà costanti e applicabile tra i campioni. Questa tecnica è stata generata nel contesto di fornire una tecnica standardizzata, precisa, rapida e semplice per misurare le dimensioni di capsule per un campo in cui non c'era nessuno prima.

Come accennato in precedenza, l'algoritmo CHT è consolidata e gli script per rilevare automaticamente i cerchi sono stati scritti prima. Questo metodo migliora nelle due aree dove altri script sarebbe caduta breve. In primo luogo, rilevare semplicemente cerchi non è sufficiente, perché con le cellule criptococciche due distinti cerchi devono essere rilevate in relazione reciproca. Questo metodo specificamente rileva corpi cellulari all'interno di capsule, discrimina tra i due ed esegue calcoli solo sulle coppie di corpo-capsula pertinenti. In secondo luogo, anche quando seguendo il protocollo stesso, diversi investigatori finirà con diversi acquisito immagini. Consentendo il controllo di investigatore sopra ogni parametro algorithm, questo strumento può essere regolato per soddisfare una vasta gamma di metodi di acquisizione. Non c'è nessuna necessità di un ambito standardizzato, obiettivo, filtro e così via.

Questa tecnica può essere applicata facilmente a qualsiasi situazione in cui lo sperimentatore deve rilevare cerchi all'interno di un'immagine che contrastano con il loro background. Entrambi i cerchi più leggeri e più scuri che può essere rilevato il loro background, contati e misurato utilizzando questa tecnica.

Protocollo

1. preparazione dell'inchiostro di India Slide

1. Pipettare 10 µ l di campione criptococcico in una diapositiva. Qualsiasi ceppo di lievito circolare funzionerà, ma per questo esperimento H99 era l'unico sforzo utilizzato.
   Nota: Se il campione è direttamente da terreni di coltura, diluizione 1:2 con PBS o acqua può aiutare a prevenire l'inchiostro di India da aggregazione.
2. Pipettare 2 µ l di macchia di inchiostro di India sul campione e miscelare fisicamente spingendo la punta della pipetta per il campione e lo spostamento in un movimento circolare fino a quando l'inchiostro di India appare uniformemente distribuita.
3. Porre un coprivetrino sopra il campione tenendo premuto il bordo sinistro del coprivetrino contro la superficie della diapositiva, quindi delicatamente e uniformemente abbassando il lato opposto del coprivetrino sopra il campione.
4. Asciugare all'aria per 5 min.
5. Applicare delicatamente un leggero strato di smalto a bordo del vetrino coprioggetti per formare un sigillo e preservare la macchia di inchiostro di India.

2. imaging diapositiva

1. Mettere i vetrini in un microscopio a campo luminoso con un accessorio della fotocamera e conversione pixel-per-micron noti. Regolare contrasto, obiettivi e filtri in modo che capsule di cella sono chiari e corpi cellulari sono concentrati, scuri bande.
   Nota: Vari filtri, gli obiettivi e le impostazioni di contrasto funzionerà ma un 20x obiettivo, Ph1 filtro e 2 x 2 binning è raccomandato.
2. Assicurarsi che il campo visivo è denso ma non sovrappopolata con cellule criptococciche, con netto contrasto tra cella capsula e sfondo e correttamente focalizzato con il corpo della cella visualizzato come una banda scura.
   Nota: Il numero esatto delle cellule per un'immagine ottimale variano a seconda dell'obiettivo utilizzato e campione. Gli aspetti importanti sono affinché le cellule non sono in cluster o sovrapposti, che i piani focali delle cellule non variano significativamente, e che non vi è significativa dell'inchiostro di India macchia chiaramente visibile sullo sfondo (almeno il 25% del campo).
3. Salvare le immagini in una singola directory con titoli chiari, come l'algoritmo di misurazione verrà eseguito su immagini in un'unica directory e i dati di output saranno organizzati in base ai nomi dei file immagine.

3. algoritmo Setup

1. Installare la versione di Python 2.7 da
2. Installare le librerie python aggiuntive eseguendo i comandi "pip installare cuscino" e "pip install openpyxl".
3. Installare MATLAB seguendo le istruzioni riportate in
4. Costruire la libreria python MATLAB seguendo le istruzioni fornite alle https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
5. Scaricare i tre file necessari inclusi in materiali di questo manoscritto supplementari ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m").
   Nota: Questi file possono essere estratti in qualsiasi posizione, ma tutti e tre devono essere nella stessa directory.

4. utilizzo dell'algoritmo

1. Eseguire l'applicazione facendo doppio clic su QCA.py.
   Nota: L'applicazione potrebbe richiedere alcuni minuti per iniziare. Il file "QCA.py" contiene la struttura del programma che chiama i file di "m" per eseguire l'algoritmo effettivo.
2. Attenersi alla procedura descritta nel programma.
   1. Input del tipo di estensione dei file di immagine preceduta da un periodo e separati da punti e virgola (ex. ". TIF;. JPEG") quindi fare clic sul pulsante di invio .
   2. Scegliere la directory in cui si trovano i file di immagine facendo clic sul pulsante Seleziona cartella e selezionando la cartella che contiene le immagini.
   3. Generare l'elenco di file di immagine nella directory facendo clic sul pulsante Generate Image List . Le immagini saranno elencate nella casella di testo a destra. Esaminare e verificare che l'elenco è accurato e completo.
   4. Selezionare un'immagine casuale dall'elenco per utilizzare come anteprima facendo clic sul pulsante Seleziona immagine casuale .
      Nota: Se l'immagine è in grado di aprire a causa di un "errore di modalità immagine non corretta", l'algoritmo continuerà a funzionare correttamente nonostante non visualizzazione dell'immagine. Dopo passo 4.2.7, continuerà a visualizzare l'immagine di prova.
   5. Obiettivo del microscopio e binning impostazioni di input. Se le impostazioni predefinite non corrispondono il microscopio utilizzato, selezionare "Custom Pixel conversione" e la conversione pixel-per-um per i file di immagine di input. Una volta selezionato, fare clic sul pulsante di Conversione di calcolare e verificare che la conversione viene corretta secondo la casella di testo sulla destra.
      Nota: Immagini rappresentative, illustrate nella Figura 1 sono state calcolate con 40 x ingrandimento e 2 x 2 binning selezionato.
   6. Inserire i parametri dell'algoritmo per il rilevamento di cerchio.
      1. Il raggio minimo e massimo rilevabile per la rilevazione di capsula esterna come voci di Min e Max capsula Radius in ingresso. Una gamma più ridotta vi permetterà di ottenere risultati più accurati.
      2. Il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento del corpo cellulare come voci di Min e Max corpo cellulare Radius in ingresso.
         Nota: Tutti e quattro di queste voci deve essere numeri che rappresentano i rispettivi valori in pixel, secondo le immagini sorgente.
      3. Spostare i cursori di capsula e la sensibilità del corpo cellulare per regolare la soglia di sensibilità dell'algoritmo. Una bassa sensibilità sarà rigorosa e ridurre il rilevamento di falsi positivi cerchio, ma potrebbe anche rilevare meno reale cerchi. Al contrario, un'alta sensibilità aumenterà il tasso di rilevazione, ma può anche provocare falsi positivi cerchi.
         Nota: I risultati rappresentativi sono stati ottenuti con un raggio minimo capsula di 7, raggio massimo capsula di 45, raggio minimo corpo di 4, raggio massimo del corpo di 30, capsula sensibilità di 87 e sensibilità del corpo dell'87.
   7. Verificare i parametri dell'immagine selezionato casualmente facendo clic sul pulsante Esegui Test . I risultati verranno visualizzati in alto al centro del programma, sostituendo l'immagine originale. Se i risultati sono accurati, si consiglia di selezionare un'immagine casuale aggiuntiva per cercare anche di garantire che i parametri selezionati si adattano a tutte le immagini selezionate.
      1. Massimizzare il numero di corpi e capsule rilevati e controllare visivamente se i cerchi sembrano adattarsi correttamente. Il numero di corpi all'interno di capsule rilevati verrà visualizzato nella casella di testo a destra. In caso contrario, modificare i parametri dell'algoritmo fino a quando i risultati sono accurati.
         Nota: La spessa cerchi colorati sono solo per aiutare con visualizzazione. I cerchi effettivi generati per la misura è una curva matematica calcolata dall'algoritmo HCT.
   8. Eseguire l'algoritmo di rilevamento per l'intera directory dei file di immagine facendo clic sul pulsante Analisi di iniziare . Ogni immagine sarà analizzata e il programma visualizzerà "finito" nella casella di testo a destra quando tutte le immagini sono state analizzate.
   9. Fare clic sul pulsante corrispondenza e pulitura . Questo abbinare corpi cellulari rilevati alle capsule rilevati in che risiedono e calcolare il vero raggio capsula sottraendo corpo dalla capsula.
      Nota: Se l'algoritmo viene utilizzato per rilevare la fluorescenza o un'altra situazione in cui un solo cerchio è rilevato questo passaggio è inutile. Invece di scegliere i Corpi solo tirare o il pulsante Solo tirare capsule per raccogliere i dati per solo il blu o solo i cerchi verdi, rispettivamente. È importante notare che se solo il capsula dati viene recuperati il raggio farà riferimento al raggio totale della cella come il raggio del corpo cellulare non potrebbe essere sottratta.
   10. Individuare i dati completati nel file "CleanedOuput.csv" nella directory delle immagini. Se solo un pezzo di dati è stato selezionato, il file sarà marcato "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".

Risultati

Immagini in primo luogo sono ottenute mediante microscopia di inchiostro di India diapositive utilizzando un microscopio a campo chiaro accoppiato con una macchina fotografica (Figura 1A). È importante avere cellule separate e nella densità sufficientemente bassa non per sopraffare il campo di vista, anche quanto a utilizzare abbastanza macchia per creare contrasto tra cellule e sfondo. Come indicato nel protocollo, il numero esatto delle c...

Discussione

I punti critici di questa tecnica sono preparando la diapositiva di inchiostro di India e acquisendo le immagini del microscopio. Mentre l'algoritmo è stato testato con successo con una varietà di tecniche di diapositiva e immagine il protocollo raccomandato è descritto in questo manoscritto. Capsula del polisaccaride viene rilevata basato sull'esclusione delle particelle di inchiostro di India dal dominio della capsula come queste particelle sono troppo grandi per penetrare la rete di fibrille di polisaccaride. L'esc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813