Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

요약

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

초록

이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.

첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.

이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.

이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.

이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.

서문

Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병¹인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐²의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응²등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.

Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인^{2,3,,45에 있는 요인 다는 것 6,7}. 캡슐 크기 염 병 리⁶와 연결, 제어 Cryptococcus 감염⁵, 하 대 식 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다 이며 독성의 손실⁸결 석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 캡슐 크기 측정은 일반적인 cryptococcal 연구, 하지만 아무 fieldwide 캡슐 측정 하는 방법에 대 한 표준.

현재, C. neoformans 다 당 류 캡슐 측정 현미경 이미지, 수동 측정에 기반 하 고 실험실^{9,10, 마다 이미지 및 측정 취득의 정확한 방법 11}. 이 방법에는 즉시 관심사는 일부 연구 요구 정확도 신뢰성 유지를 어렵게 만드는 개별 측정의 수천의 수집 이다. 또한, 결과 게시 하는 경우에 종종 있다 측정 방법의 부적당 한 설명. 많은 출판물 어떻게 그들의 측정 가져온, 설명 하지 어떤 초점 비행기 사용 되었다, 그들은 한 측정을 사용 하거나 몇 가지, 또는 다른 평균 반지름 또는 지름, 사용 여부를 어떻게 그들은 캡슐 식별에 대 한 임계값을 결정 세부 사항입니다. 일부 출판물만 상태는 프로그램으로 그들의 방법 사용 되었다, 예를 들어, "어도비 포토샵 c s 3의 사용 된 셀 측정 하"¹¹. 재현성 어려울 수 있습니다 표준화 및 정보 보고의이 부족이 불가능 한 경우. 인간의 시력, 컴퓨터 밝기, 현미경 설정 차이 슬라이드 조명, 및 다른 요인 뿐만 아니라 개인 간의 하지만 샘플, 사이 계산 픽셀 강도 값의 비율에 따라 일정 하 게 유지 됩니다 반면 변화할 수 있다 고 샘플 사이의 적용 가능 합니다. 이 기술은 없는 없음 전에 필드에 대 한 캡슐 크기를 측정 하는 표준화, 신속, 정확 하 고 간단한 기술 제공의 맥락에서 생성 되었습니다.

앞에서 설명한 대로 CHT 알고리즘은 오래 된, 그리고 스크립트를 자동으로 검색 하는 원 전에 작성 되었습니다. 이 메서드는 어디 다른 스크립트 짧은을 것 이라고 하는 두 가지 영역에서 향상 됩니다. 첫째, 단순히 서클 감지 충분 하지 않습니다, cryptococcal 세포와 두 가지 동그라미 서로 관하여 감지 해야 하기 때문에. 이 방법은 특히 감지 캡슐 내에서 셀 시체, 둘 사이 차별 하 고 관련 몸 캡슐 쌍에 대해서만 계산을 수행. 둘째, 심지어 때 동일한 프로토콜, 다른 수 사관 다음으로 끝날 것 이다 다른 이미지 획득. 탐정 제어할 모든 알고리즘 매개 변수를 함으로써,이 도구는 수집 방법의 광범위 한 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. 표준화 범위, 목표, 필터, 그리고에 대 한 필요가 있다.

이 기술은 이미지 내 원 그들의 배경과 그 명암을 감지 하는 탐정 필요 어떤 상황 든 지에 쉽게 적용할 수 있습니다. 두 원 가볍고 어두운 그들의 백그라운드 검출 될 수 있다, 보다,이 기술을 사용 하 여 측정.

프로토콜

1입니다. 인도 잉크 슬라이드의 준비

1. 슬라이드에 cryptococcal 샘플의 10 µ L 플라스틱 모든 원형 효 모 스트레인 작동 하지만이 실험에 대 한 H99 사용 유일한 스트레인.
   참고: 샘플 문화 미디어에서 직접 경우 PBS 또는 물과 1:2 희석 방지할 수 있습니다 인도 잉크 clumping에서.
2. 샘플에 인도 잉크 얼룩의 2 µ L 플라스틱 하 고 물리적으로 샘플을 피 펫 팁을 밀고 하 인도 잉크 균등 하 게 분산 때까지 원운동에서 이동 하 여 혼합.
3. 배치 하는 coverslip 샘플 다음 부드럽게 그리고 균일 하 게 낮추는 coverslip의 반대편 샘플 슬라이드의 표면에 대해 coverslip의 왼쪽된 가장자리를 눌러.
4. 5 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.
5. 부드럽게 하는 물개를 형성 하 고 인도 잉크 얼룩 보존 coverslip 국경 매니큐어의 가벼운 레이어를 적용.

2. 이미지 슬라이드

1. 카메라 부착 및 알려진된 픽셀 미크론 변환 밝은 분야 현미경에 슬라이드를 배치 합니다. 셀 캡슐은 명확 하 고 셀 몸은 초점, 어두운 밴드 필터, 목표, 및 대비를 조정 합니다.
   참고: 다양 한 필터, 목표, 및 대비 설정을 작동 하지만 목표, Ph1 필터, 2 x 2 비 닝 x 20는 것이 좋습니다.
2. 보기의 필드는 하지만 하지 cryptococcal 세포로, 세포 캡슐과 배경, 사이 명확한 대조와 overpopulated 조밀 하 고 어두운 밴드 시각 셀 시체와 함께 제대로 초점을 확인 합니다.
   참고: 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수는 샘플 및 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다.
3. 으로 측정 알고리즘 단일 디렉토리에 이미지에서 실행 되 고 출력 데이터는 이미지 파일의 이름에 따라 구성 됩니다 분명 제목, 단일 디렉터리에 이미지를 저장 합니다.

3. 알고리즘 설정

1. Python 버전 2.7을 설치
2. "핍 설치 베개" 명령을 실행 하 여 추가 파이썬 라이브러리를 설치 하 고 "핍 설치 openpyxl".
3. MATLAB에서 지침에 따라 설치
4. 빌드 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html에서 제공 하는 지침에 따라 MATLAB 파이썬 라이브러리.
5. 이 원고 보충 자료 ("QCA.py", "Analysis2.m", 및 "TestRun.m")에 포함 된 세 가지 필요한 파일을 다운로드 합니다.
   참고:이 파일은 어떤 위치에 추출 될 수 있다 하지만 모든 3 동일한 디렉터리에 있어야 합니다.

4입니다. 알고리즘의 사용

1. QCA.py를 두 번 클릭 하 여 응용 프로그램을 실행 합니다.
   참고: 응용 프로그램 시작 하려면 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. "QCA.py" 파일 ".m" 파일 실제 알고리즘 실행을 호출 하는 프로그램 구조를 포함 되어 있습니다.
2. 프로그램에 설명 된 단계를 따릅니다.
   1. 이미지 파일의 확장 형식 앞에 마침표와 세미콜론으로 구분 된 입력 (예. ". TIF;입니다. jpeg") 다음 클릭 버튼을 입력 합니다.
   2. 디렉터리 선택 단추를 클릭 하 고 이미지를 포함 하는 폴더를 선택 하 여 이미지 파일이 있는 디렉터리를 선택 하십시오.
   3. 이미지 목록 생성 버튼을 클릭 하 여 디렉터리에서 이미지 파일의 목록을 생성 합니다. 이미지는 오른쪽에 텍스트 상자에 나열 됩니다. 검토 하 고 목록을 정확 하 고 완전 한 확인 하십시오.
   4. 무작위 이미지 선택 버튼을 클릭 하 여 미리 보기를 사용 하 고 목록에서 임의의 이미지를 선택 합니다.
      참고: 이미지를 "잘못 된 이미지 모드 오류" 열 수 없는 경우 알고리즘은 여전히 제대로 작동 하지 이미지를 표시 하는도 불구 하. 4.2.7 단계 후 테스트 이미지는 여전히 표시 됩니다.
   5. 현미경 목적과 binning 설정을 입력 합니다. 기본 설정이 일치 하지 않는 경우 사용 하는 현미경 "사용자 정의 픽셀 변환"을 선택 하 고 이미지 파일에 대 한 픽셀을 음 변환 입력. 일단 선택, 계산 변환 버튼을 클릭 하 고 오른쪽에 텍스트 상자에 올바른 변환을 확인 하십시오.
      참고: 그림 1 에 표시 된 대표 이미지 확대와 2 x 2 비 닝 선택 x 40로 계산 했다.
   6. 서클 검색 알고리즘 매개 변수를 입력 합니다.
      1. Min과 Max 캡슐 반경 항목으로 외부 캡슐 탐지에 대 한 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 작은 범위에는 더 정확한 결과 얻을 수 있게 됩니다.
      2. 최소 및 최대 셀 바디 반경 항목으로 세포 체 감지 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다.
         참고: 이러한 항목의 모든 4 소스 이미지에 따라 그들의 각각 값을 픽셀 단위로 표현 하는 숫자 이어야 합니다.
      3. 알고리즘의 감도 임계값 조정 캡슐 및 셀 바디 감도 슬라이더를 이동 합니다. 낮은 감도 엄격한 될 것입니다 고 거짓 긍정적인 원 탐지 줄어들지만 적은 진짜 서클을 검색할 수 있습니다. 반대로, 높은 감도 검색 속도 증가 하지만 거짓 긍정적인 원형에서 또한 발생할 수 있습니다.
         참고: 대표적인 결과 최소 캡슐 반경 7, 45의 최대 캡슐 반지름, 최소 몸 반경 4, 30의 최대 몸 반지름, 87, 캡슐 감도 및 87의 바디 감도 얻은 했다.
   7. 테스트 실행 버튼을 클릭 하 여 무작위로 선택 된 이미지에 매개 변수를 테스트 합니다. 결과 원본 이미지를 대체 하는 프로그램의 위 중심에 표시 됩니다. 결과 정확한 경우에, 또한 선택 된 파라미터 모든 선택 된 이미지에 맞는 보장 하려고 추가 임의 이미지를 선택 하는 것이 좋습니다.
      1. 기관 및 감지 하는 캡슐의 수를 최대화 하 고 시각적으로 동그라미 제대로 맞게 표시 여부 검사. 감지 하는 캡슐 내에서 시체의 수 오른쪽에 텍스트 상자에 표시 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 정확한 될 때까지 알고리즘 매개 변수를 조작 합니다.
         참고: 두꺼운 색된 동그라미는 시각화 도움에. 측정에 대 한 생성 하는 실제 원 HCT 알고리즘에 의해 계산 하는 수학 곡선입니다.
   8. 분석 시작 단추를 클릭 하 여 이미지 파일의 전체 디렉터리에 감지 알고리즘을 실행 합니다. 각 이미지 분석 될 것 이다 고 프로그램 표시 됩니다 "완료" 오른쪽 텍스트 상자에 모든 이미지를 분석 하는 경우.
   9. 일치 및 정리 단추를 클릭 합니다. 일치 하는 검색 된 캡슐에, 감지 셀 시체와 진정한 캡슐 반경 캡슐에서 몸을 빼서 계산 됩니다.
      참고: 경우 형광을 검출 하는 알고리즘 사용 되 고 또는 다른 상황이 하나의 원형은 감지이 단계 필요 하지 않습니다. 대신 당겨 시체 또는 당겨 캡슐 버튼 각각만 파란색 이나 녹색 원만에 대 한 데이터를 수집 하려면 클릭 합니다. 그것은 그 캡슐 데이터를 검색 하는 경우에 반지름 됩니다 참조 셀의 총 반경 세포 체의 반경 수 없습니다 뺄 때 주의 하는 것이 중요.
   10. 이미지 디렉토리에 "CleanedOuput.csv" 파일에 완성 된 데이터를 찾습니다. 데이터의 원피스를 선택 하는 경우에 "CleanedBodies.csv" 또는 "CleanedCapsules.csv" 파일이 표시 됩니다.

결과

카메라(그림 1)과 함께 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 인도 잉크 슬라이드의 현미경 사용 이미지를 먼저 얻을 수 있습니다. 세포 분리 및 세포와 배경 사이 대조를 만들 충분 한 얼룩을 사용 또한 보기의 필드를 압도 하지 충분히 낮은 밀도를 중요 하다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수 샘플, 현미경, 사...

토론

이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813