מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

Summary

טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.

Abstract

מטרת טכניקה זו היא לספק תהליך עקבי, מדויק, הניתנים לניהול והגמישים עבור מספרים גדולים של מדידות קפסולה רב-סוכר.

ראשית, תמונת הסף נוצר בהתבסס על ערכי העוצמה מחושב באופן ייחודי עבור כל תמונה. לאחר מכן, עיגולים מזוהים בהתבסס על הניגוד בין אובייקט לבין רקע בעזרת האלגוריתם מעגל האף טרנספורמציה (CHT) ומבוססת. לבסוף, תא שזוהו קפסולות של גופים מתאימים על פי קואורדינטות מרכז ואת גודל הרדיוס, הנתונים מיוצאים אל המשתמש בגיליון לניהול.

היתרונות של שיטה זו הם פשוטים אך משמעותי. הראשון, כי חישובים אלה מבוצעים על ידי אלגוריתם מאשר אדם דיוק ואמינות הוגדלה. אין שום ירידה הדיוק או המהימנות בין כמה דוגמאות מנותחות. שנית, גישה זו מבססת על סטנדרטי פוטנציאליים עבור השדה קריפטוקוקוס במקום המצב הנוכחי שבו מדידה קפסולה משתנה על ידי המעבדה. שלישית, מכיוון שטווח המידות קפסולה ידני הם איטי ומונוטוני, אוטומציה מאפשר מדידות מהירה על מספר גדול של תאי שמרים בתורו המקל על תפוקה גבוהה ניתוח נתונים וסטטיסטיקות חזק יותר ויותר.

המגבלות הגדולות של טכניקה זו בא איך הפונקציות אלגוריתם. ראשית, האלגוריתם יפיק רק מעגלים. בעוד קריפטוקוקוס תאים וכמוסות שלהם לקחת על מורפולוגיה מעגלית של, זה יהיה קשה ליישם טכניקה זו לאיתור אובייקט שאינו עגול. שנית, בשל כמה עיגולים מזוהים האלגוריתם CHT יכול לזהות עצום עיגולים המדומה המבוססת על הקצוות החיצוניים של מעגלים באשכולות. עם זאת, גופות תא מטעים המוצגים נתפס בתוך המעגל מדומה בקלות ועוזרת להסיר ערכות הנתונים הנוצרת.

טכניקה זו מיועד למדידת הקפסולות רב-סוכר מעגלית של מינים קריפטוקוקוס בהתבסס על מיקרוסקופיית שדה בהיר דיו הודו; אבל זה יכול להיות מיושם על חדות אחרות מבוסס אובייקט עגול מדידות.

Introduction

קריפטוקוקוס neoformans היא פטרייה פתוגניים נמצאו ubiquitously ברחבי העולם המשויך מחלות אנושיות בעיקר באוכלוסיות immunosuppressed. Neoformans ג שהבולט מהווה גורם משמעותי סך מקרי המוות השנתי ב אפריקה שמדרום לסהרה עקב מחלה זיהומית¹. הביטוי הקליני העיקריים של זיהום cryptococcal הוא meningoencephalitis, אשר עוקב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תחבורה נגוע מקרופאגים (הסוס הטרויאני באופן) או מעבר ישיר של מחסום הדם - מוח. Neoformans ג מבטא מספר גורמים התקפה אלימה, כולל היכולת לשכפל את טמפרטורת גוף נורמלית, פעילות אוראז, melanization, ואת היווצרות קפסולה רב-סוכר². הקפסולה רב-סוכר מורכב חוזרות glucuronoxylomannan glucoronoxylomannangalactan פולימרים והפונקציות כמחסום מגן נגד גורמי עקה ו מארח תגובות חיסוניות².

למרות הגודל לגודל הקפסולה cryptococcal רב-סוכר לא עקבי שויכה התקפה אלימה, יש ראיות כי זה גורם פתוגנזה^{2,3,4,5, 6,7}. גודל קפסולה מזוהה עם דלקת קרום המוח פתולוגיה⁶, יכול להשפיע על מקרופאג היכולת לשלוט קריפטוקוקוס זיהום⁵, יכול לגרום לאובדן של התקפה אלימה אם נעדר⁸. לפיכך, מדידות גודל קפסולה נפוצים במחקר cryptococcal, אבל יש fieldwide אין תקן שיטת מדידה קפסולה.

כיום, neoformans ג רב-סוכר קפסולה המדידה מבוססת על מדידות ידניות של תמונות מיקרוסקופ, השיטות המדויק של רכישות התמונה והן מידה משתנים על פני מעבדות^{9,10, 11}. הדאגה המיידית לשיטה זו היא כי מספר מחקרים דורשים הרכישה של אלפי מדידות, מה שהופך ולשמירה על רמת דיוק ואמינות קשה. יתר על כן, גם כאשר מתפרסמות התוצאות, יש לעיתים קרובות תיאור לקוי של שיטת מדידה. פרסומים רבים לא מסבירים איך המדידות שלהם התקבלו, איזה מטוס מוקד שימש, איך הם קבעו את הסף עבור זיהוי קפסולה, בין אם הם השתמשו רדיוס או קוטר, בין אם הם השתמשו מדידה אחת או בממוצע מספר, או אחרים פרטים. כמה פרסומים היחידה המדינה שלהם לשיטה כמו איזו תוכנית ששימשה, למשל, "Adobe Photoshop CS3 שימש כדי למדוד את התאים"¹¹. חוסר פירוט תקנון ודיווח באפשרותך להפוך הפארמצבטית קשה אם לא בלתי אפשרי. הבדלים הראייה האנושי, בהירות המחשב, ההגדרות מיקרוסקופ, שקופיות תאורה, גורמים אחרים יכולים להשתנות לא רק בין יחידים אלא בין דגימות, ואילו חישובים בהתבסס על יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה יישאר קבוע, החלים בין הדגימות. טכניקה זו נוצר בהקשר של מתן טכניקה סטנדרטית, מדויק, מהיר ופשוט למדוד גדלים קפסולות של שדה שבו היה קודם.

כאמור, האלגוריתם CHT ותיקה, קבצי script כדי לזהות באופן אוטומטי את העיגולים נכתבו לפני. שיטה זו משפרת בשני תחומים איפה סקריפטים אחרים יפול קצר. ראשית, גילוי פשוט עיגולים אינה מספיקה, כי עם תאים cryptococcal שני מעגלים נפרדים חייב להתגלות אחד ביחס לשני. שיטה זו במיוחד מזהה תא גופות בתוך קפסולות מפלה בין השניים, מבצעת את החישובים רק על זוגות הגוף-קפסולת הרלוונטיים. שנית, אפילו כאשר בעקבות באותו פרוטוקול, חוקרים שונים יגיעו עם שונה רכשה תמונות. בכך שהוא מאפשר את השליטה חוקר כל פרמטר אלגוריתם, כלי זה יכול להיות מותאם כדי להתאים למגוון רחב של שיטות רכישה. יש צורך היקף מתוקננת, המטרה, סינון וכן הלאה.

טכניקה זו ניתן בקלות ליישם בכל מצב שבו החוקר צריך לזהות החוגים בתוך תמונה בניגוד עם הרקע שלהם. שניהם עיגולים בהיר יותר וכהה יותר הרקע שלהם יכול להתגלות, ספרתי, נמדד בעזרת טכניקה זו.

Protocol

1. הכנת שקופית אינדיה אינק

1. פיפטה 10 µL מדגם cryptococcal לשקופית. כל זן שמרים מעגלית תפעל אך עבור ניסוי זה H99 היה המתח היחידים בשימוש.
   הערה: אם המדגם הוא ישירות מתוך תרבות המדיה, דילול 1:2 עם PBS או מים יכול לסייע למנוע את הדיו הודו הצליעה.
2. פיפטה 2 µL של כתם דיו הודו על המדגם ומערבבים על ידי דוחף את הטיפ פיפטה לדגימת ופיזית נע בתנועה סיבובית להופעת הדיו הודו המתפלג.
3. הצב של coverslip על המדגם על-ידי החזקת הקצה השמאלי של coverslip מפני השטח של השקופית, ואז בעדינות ובצורה שווה להורדת הנגדי של coverslip על המדגם.
4. לאפשר את השקופית מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות.
5. בעדינות להחיל שכבה של לק coverslip הגבול טופס גושפנקה ולשמר את הכתם אינדיה אינק.

2. הדמיה שקופיות

1. מקום שקופיות מיקרוסקופ שדה בהיר עם המצלמה המצורף, המרת פיקסלים-כדי-מיקרו-ידוע. התאם מסננים, מטרות וחדות כך תא קפסולות ברורים ולא תא הגופות להקות ממוקד, כהה.
   הערה: שונים מסננים, מטרות והגדרות ניגודיות יעבוד אבל 20 x אובייקטיבי, Ph1 מסנן ו- 2 x 2 binning מומלץ.
2. ודא שדה הראיה צפוף אבל לא כבדה ומזיהום עם התאים cryptococcal, עם ניגודיות ברורה בין כמוסה תא ורקע, וממוקד כראוי עם גוף התא דמיינו כלהקה כהה.
   הערה: המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישתנו באופן משמעותי, וזה משמעותי דיו הודו כתם בבירור ברקע (לפחות 25% של השדה).
3. לשמור תמונות ספריה בודדת עם כותרות ברורות, האלגוריתם מדידה יופעלו על תמונות ספריה בודדת, נתוני הפלט ימוינו לפי השמות של קבצי התמונות.

3. אלגוריתם ההתקנה

1. התקנת פייתון גירסה 2.7 מ
2. התקן ספריות פיתון נוספים על ידי הפעלת הפקודות "פיפ להתקין את הכרית", "פיפ להתקין את openpyxl".
3. התקנת MATLAB בהתאם להוראות המפורטות ב
4. מבנה הספרייה פיתון MATLAB על-ידי ביצוע ההוראות המפורטות ב- https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
5. להוריד את הקבצים הדרושים שלוש הכלולות בחומרים של כתב יד זה משלים ("QCA.py", "Analysis2.m" ו- "TestRun.m").
   הערה: קבצים אלה ניתן לחילוץ לכל מקום, אבל שלושתן חייב להיות באותה ספריה.

4. שימוש באלגוריתם

1. הפעל את היישום על-ידי לחיצה כפולה על QCA.py.
   הערה: היישום עשוי להימשך מספר דקות כדי להתחיל. קובץ ה-"QCA.py" מכיל את מבנה תוכנית שקוראת את הקבצים "דדי כהן" כדי להפעיל את האלגוריתם בפועל.
2. בצע את השלבים המפורטים בתכנית.
   1. הקלט סוג הסיומת של קבצי התמונות ולפניהם תקופה, כשהם מופרדים באמצעות תווי נקודה-פסיק (ex. ". TIF;. jpeg") ואז לחץ לחצן Enter .
   2. בחר את הספריה שבה ממוקמים את קובצי התמונה על-ידי לחיצה על לחצן בחר מדריך ובחירת התיקיה המכילה את התמונות.
   3. צור הרשימה של קבצי תמונה בספריה על-ידי לחיצה על לחצן צור רשימת התמונה . התמונות יפורטו בתיבת הטקסט לימין. לסקור, ודא שהרשימה מדויקים ומלאים.
   4. בחר תמונה אקראית מתוך הרשימה שתשמש תצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על לחצן בחר תמונה אקראית .
      הערה: אם התמונה היא אפשרות לפתוח עקב "שגוי תמונת מצב שגיאה", האלגוריתם ימשיכו לפעול כראוי למרות לא מציג את התמונה. לאחר שלב 4.2.7, עדיין להציג תמונת הבדיקה.
   5. קלט מיקרוסקופ אובייקטיבית, binning הגדרות. אם הגדרות ברירת המחדל אינם תואמים המיקרוסקופ משמש, בחר מותאמת אישית פיקסל המרה"ולהזין פיקסל-כדי-אום ההמרה עבור קבצי תמונה. לאחר הבחירה, לחץ על כפתור חישוב המרה ולהבטיח שההמרה היא הנכונה לפי תיבת הטקסט בצד הימין.
      הערה: להחליפן בתמונות המוצגות באיור 1 חושבו עם 40 x הגדלה ו 2 x 2 binning שנבחר.
   6. קלט פרמטרי האלגוריתם לזיהוי עיגול.
      1. קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי איתור קפסולה החיצוני כערכים Min ו- Max כמוסה רדיוס. מגוון קטן יותר יאפשר תוצאות מדויקות יותר.
      2. קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי לגילוי גוף התא כערכים Min ו- Max גוף התא Radius.
         הערה: כל ארבעת ערכים אלה צריכים להיות מספרים המייצגים את הערכים המתאימים שלהם בפיקסלים, על פי תמונות המקור.
      3. הזז את המחוונים כמוסה ורגישות לגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה יהיה נוקשה, להפחית את זיהוי מעגל חיובי כוזב, אך עלולה גם לאתר פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה יגדל שיעור גילוי, אך עלולה גם במעגלים חיובי כוזב.
         הערה: נציג התוצאות התקבלו עם מינימום רדיוס קפסולה של 7, רדיוס קפסולה מקסימלית של 45, הגוף מינימום רדיוס של 4, הגוף המרבי ברדיוס של 30, רגישות קפסולה של 87, ורגישות הגוף של 87.
   7. בדוק את הפרמטרים בתמונה שנבחרו באקראי על ידי לחיצה על לחצן הפעל בדיקת . התוצאות יוצגו במרכז העליון של התוכנית, החלפת התמונה המקורית. אם התוצאות נראות מדויק, מומלץ לבחור תמונה אקראית נוספים כדי לנסות כמו גם להבטיח שערכי הפרמטרים יתאימו לכל התמונות שנבחרו.
      1. להגדיל את מספר הגופות, קפסולות זוהה באופן חזותי לבחון החוגים יופיעו כדי להתאים כראוי. מספר הגופות בתוך קפסולות זוהה יוצג בתיבת הטקסט לימין. אחרת, לשנות את הפרמטרים אלגוריתם עד התוצאות מדויקות.
         הערה: עיגולים צבעוניים עבים הם רק. כדי לעזור עם פריט חזותי. החוגים בפועל שנוצר למדידה הוא עקומה מתמטית מחושב על ידי האלגוריתם של HCT.
   8. להפעיל את אלגוריתם זיהוי על הספריה כולה של קבצי תמונה על-ידי לחיצה על לחצן להתחיל בניתוח . כל תמונה ינותחו ויציג התוכנית "סיים" בתיבת הטקסט ימינה כאשר יש כבר ניתחו את כל התמונות.
   9. לחץ על הלחצן התאמה וניקוי . זה תואם הגופות שזוהו תא הקפסולות שזוהו שהם מתגוררים, לחשב את רדיוס קפסולה נכון על-ידי חיסור מהגוף כמוסה.
      הערה: אם האלגוריתם נמצא בשימוש כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית או מצב אחר שבו מעגל היחידה היא מזוהה שלב זה הוא מיותר. במקום לחץ על הגופים למשוך רק או לחצן קפסולות למשוך רק כדי לאסוף את הנתונים רק את הכחול או רק את עיגולים ירוקים, בהתאמה. חשוב לציין כי אם רק אחזור הנתונים קפסולה הרדיוס יפנה מהרדיוס הכולל של התא כפי הרדיוס של גוף התא לא יכול להיות מופחתים.
   10. לאתר את הנתונים הושלמה בקובץ "CleanedOuput.csv" בספריית תמונות. אם רק חתיכה אחת של נתונים נבחרה, יסומנו כסעיפים את הקובץ "CleanedBodies.csv" או "CleanedCapsules.csv".

תוצאות

תמונות מתקבלים לראשונה על ידי מיקרוסקופ של דיות שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בשילוב עם מצלמה (איור 1א'). חשוב לקבוע תאים נפרדו, בצפיפות נמוכה מספיק לא להכריע בתחום התצוגה, כמו גם באשר להשתמש הכתם מספיק כדי ליצור ניגודיות בין תאים לבין הרקע. כ...

Discussion

השלבים הקריטיים של טכניקה זו מכין את השקופית אינדיה אינק, רכישת תמונות מיקרוסקופ. בעוד האלגוריתם נבדק בהצלחה עם מגוון רחב של טכניקות שקופיות ותמונה הפרוטוקול המומלץ מתואר בכתב היד. הקפסולה רב-סוכר מזוהה בהתבסס על הכללת חלקיקי דיו הודו מהתחום של הקפסולה, כמו חלקיקי האלה גדולות מדי לחדור לר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813