JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تصف الفائق محسن رقاقة-تسلسل البروتوكول وأنابيب التحليلات الحسابية لتحديد أنماط الدولة الكروماتين على نطاق الجينوم من أنسجة الورم المجمدة وخطوط الخلية.

Abstract

التعديلات هيستون تشكل عنصرا رئيسيا ابيجينومي ولعب أدوار تنظيمية هامة في تحديد حالة النسخي المكاني المرتبطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت وجود تعديلات محددة لتحديد موقع وهوية غير ترميز العناصر الفنية مثل القدرة على. في السنوات الأخيرة، أصبحت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً تسلسل الجيل القادم (الرقائق-seq) أداة قوية في تحديد الملامح على نطاق الجينوم التعديلات هيستون الفردية. ومع ذلك، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن أنماط اندماجي لتعديلات الكروماتين، يشار إلى الدول الكروماتين، تحديد هوية وطبيعة محور الجينوم المرتبطة بها. ولذلك، مهام سير العمل تتألف من المنهجيات (HT) الفائق قوية للتنميط عددا من هستون تعديل علامات، فضلا عن التحليلات الحسابية أنابيب قادرة على التعامل مع إعداد كبيرة من شرائح Seq التنميط مجموعات البيانات، هناك حاجة تصميم شامل من الدول ابيجينوميك في عدد كبير من العينات. سير العمل تقنية HT-رقاقة-Seq المعروضة هنا تتكون من وحدتين: 1) على بروتوكول تجريبي للتنميط عدة تعديلات هستون من كميات صغيرة من عينات الورم وخطوط الخلايا في صيغة 96-جيدا؛ و 2) خط أنابيب تحليل بيانات حسابية التي تجمع بين الأدوات الموجودة لحساب الأشغال مارك الفردية وأنماط الدولة الكروماتين اندماجي. معا، تيسير هذه الوحدات اثنين من السهل معالجة مئات من عينات Seq رقاقة بطريقة سريعة وفعالة. يتم استخدام سير العمل المقدمة هنا لاستخلاص أنماط الكروماتين الدولة من هستون 6 مارك الملامح في أورام سرطان الجلد، وخطوط الخلايا. عموما، فإننا نعرض سير عمل رقاقة seq شاملة التي يمكن تطبيقها على العشرات من عينات الورم البشري وسرطان الخلية خطوط لتحديد الانحرافات ابيجينوميك في مختلف الأورام الخبيثة.

Introduction

معظم الثدييات الجينوم (98-99 في المائة) وتتألف من تسلسل فضله، وهذه المناطق نوكودينج تحتوي على العناصر التنظيمية المعروفة للمشاركة في التحكم في التعبير الجيني والكروماتين المنظمة1،2. في خلية عادية، الجمعية العامة المحددة من الحمض النووي في هيكل الكروماتين المضغوطة الحاسمة للمنظمة المكانية والتنظيم والتوقيت الدقيق لمختلف العمليات المرتبطة بالحمض النووي3،،من45. في خلية سرطان بيد الكروماتين تعديلات من قبل آليات جينية شاذة يمكن أن يؤدي إلى سوء تنظيم هيكل الكروماتين، بما في ذلك الوصول إلى العناصر التنظيمية، ونظم حلقات الكروموسومات والجينات أنماط التعبير6، 7،،من89،10.

وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، لدينا محدودة الفهم لتعديلات جينية المرتبطة بتطور الورم أو الاستجابة العلاجية. Epigenome يتكون من مجموعة تعديلات، بما في ذلك علامات هيستون ومثلايشن الحمض النووي، التي تشكل مجتمعة دولة ديناميكية (المشار إليها كدولة الكروماتين) التي تؤثر على شبكات التعبير الجيني وغيرها من العمليات الهامة للمحافظة على الهوية الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد تبين التعديلات في القدرة على في الأورام الخبيثة متعددة بدراسة ملامح H3K27Ac11. على الرغم من أن مثل هذه الدراسات توفر نظرة ثاقبة الترابط بين علامات جينية معزولة، أكثر من 100 إجراء تعديلات جينية قد حددت12،13 دون فهم واضح لدورها البيولوجي و الترابط. وعلاوة على ذلك، هناك عدد أكبر من أنماط اندماجي ممكن هذه هيستون وتعديلات الحمض النووي، ومن هذه الأنماط اندماجي-التعديلات الفردية لا-أن تملي الولايات جينية14. ومن ثم، هناك حاجة هائلة لتحديد التعديلات في هذه الدول الكروماتين أثناء تطور السرطان أو الردود على العلاج. معرفة شاملة بالتعديلات ابيجينومي في حالات السرطان قد تم متخلفة جزئيا بسبب التقنية (مثل توليد البيانات على نطاق واسع من كمية صغيرة من الخلايا مفرد المواد السريرية) وتحليلية (مثل خوارزميات لتحديد التحديات التي تواجه الدول اندماجي). ولذلك، هناك حاجة ماسة لأساليب الفائق قوية للتنميط عدد كبير من هستون تعديل علامات من المواد السريرية وسهلة لتنفيذ النهج الحسابية للتنبؤ بأنماط التوافقي الذي سيسهل تصميم جينية الدول المرتبطة بمراحل مختلفة من توموريجينيسيس والمقاومة العلاجية. علاوة على ذلك، البيانات المتاحة من الأخيرة epigenome التنميط الدراسات15،16،17،،من1819،20،21، 22،23 في الأنسجة العادية وخطوط الخلايا يمكن أن تكون متكاملة مع التشكيلات الكروماتين للأورام لمزيد ثاقبة epigenome مساهمة البيولوجيا الورم.

الكروماتين التنميط أصبح أداة قوية لتحديد أنماط الربط العالمي الكروماتين مختلف التعديلات15،24. وفي السنوات الأخيرة، أصبحت رقاقة seq "المعيار الذهبي" لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين على نطاق عالمي26،25،27. لأي تجربة رقاقة seq، هناك الخطوات الحاسمة اللازمة لنجاحها، بما في ذلك تجهيز الأنسجة وعدم اقتران، وتحديد شروط sonication الأمثل، تحديد تركيز الضد الأمثل لهطول الأمطار، إعداد مكتبة، التسلسل بعد تجهيز البيانات، وتحليل المتلقين للمعلومات. كل خطوة من هذه الخطوات تتضمن نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة، وعندما تؤخذ معا، تعتبر حاسمة لتحديد الأهداف المحتملة للتحقق من الصحة الوظيفية بشكل صحيح. من خلال الابتكار في هذه الخطوات، العديد من الدراسات السابقة قد وضع منهجيات لأداء رقاقة أو Seq تشيب من كمية صغيرة من الأنسجة28،،من2930،31،32 . علاوة على ذلك، اقترحت بعض الدراسات القائمة على بروتوكولات لإجراء التجارب على رقاقة الفائق تليها بكر كوانتيتيشن33،34. وأخيراً، بعض مناهج التحليل المتاحة علانية Seq رقاقة البيانات متاحة الآن مثل عزق35 و36من المجرة. ومع ذلك، تفتقر إلى برنامج متكامل لأداء رقاقة Seq في طريقة الفائق في تركيبة مع خط أنابيب حسابية لأداء مارك واحد، فضلا عن تحليلات الدولة الكروماتين.

هذا البروتوكول يصف سير seq شريحة كاملة وشاملة لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للدول الكروماتين في أنسجة الورم وخطوط الخلية، مع سهولة اتباع المبادئ التوجيهية ليشمل جميع الخطوات اللازمة لتجربة ناجحة. باعتماد أسلوب الفائق الموصوفة سابقا من جونين Blecher et al. 37، هذا البروتوكول يمكن أن يؤديها على عشرات من العينات في نفس الوقت وقد طبق بنجاح في خطوط خلايا السرطان والأورام البشرية مثل سرطان الجلد والقولون والبروستاتا وجليوبلاستوما عديدة الأشكال. علينا أن نظهر منهجية التعديلات هيستون الأساسية الستة التي تمثل المكونات الرئيسية في الساحة التنظيمية جينية في خطوط الخلايا البشرية سرطان الجلد وعينات الورم. وتشمل هذه التعديلات H3K27ac (محسنات)، H3K4me1 (القدرة على نشاط ويستعد)، H3K4me3 (مروجي)، H3K79me2 (نسخها من المناطق)، H3K27me3 (بوليكومب القمع)، و H3K9me3 (heterochromatic القمع). يمكن استخدام هذه العلامات أما وحدها أو في تركيبة لتحديد الدول الكروماتين وظيفيا متميزة تمثل المجالات القمعية والنشطة على السواء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتم الحصول على العينات السريرية جميع اتباع المبادئ التوجيهية "مجلس المراجعة المؤسسية".

1. إعداد المخزن المؤقت

  1. جعل 200 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، 10 مم الإيثيلين (يدتا) حمض pH 8.0).
  2. جعل 200 مل صق المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، 10 مم يدتا pH 8.0، 140 ملم كلوريد الصوديوم).
  3. جعل 200 مل من 2.0 M جليكاين (ز 37.52 من جليكاين في 200 مل الماء) والحرارة عليه إلى 65 درجة مئوية.
  4. جعل 200 مل من 5% صوديوم ديوكسيتشولاتي (DOC) الحل (10 جرام دوك في 200 مل الماء).
  5. جعل 500 مل رقاقة حصاد المخزن المؤقت (12 مم تريس-Cl، 0.1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 6 مم يدتا، 0.5% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)).
  6. جعل 500 مل من المخزن المؤقت لتمييع رقاقة (10 ملم تريس-Cl، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 0.1% دوك، 1% تريتون العاشر، 1 مم يدتا).
  7. جعل 500 مل من المخزن المؤقت ليغسل ريبا (صق، 1% x-100 تريتون، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% DOC).
  8. جعل 500 مل من المخزن المؤقت ليغسل ريبا/500 (ريبا المخزن المؤقت + 360 مم كلوريد الصوديوم).
  9. جعل 500 مل ليكل يغسل المخزن المؤقت (الشركة المصرية للاتصالات، 250 ملم ليكل، 0.5% NP-40، 0.5% DOC).
  10. جعل 500 مل من المخزن المؤقت "شطف المباشر": 10 ملم تريس Cl pH 8.0، 5 ملم يدتا، 300 مم كلوريد الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.5%.
  11. جعل 50 مل من جسم ملزم/حجب المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.1% توين-20 + 0.2 ٪ خالية من مفتش جيش صرب البوسنة).

2-الأنسجة/الخلية "خط المعالجة" والعابرة للربط

  1. إذا كان النسيج فلاش المجمدة، ديتو على الجليد قبل الانفصال.
  2. إلغاء إقران 50 مغ أنسجة (~ 8 ملغ في جسم تعديل هيستون) يدوياً في 2 مل من متوازن الملح الحل (حبس هانكس) باستخدام شفرة حلاقة عقيمة. فرم النسيج أربا 3 إلى 4 ملم لمدة 5 دقائق تقريبا في طبق استنبات الأنسجة عقيمة.
  3. نقل الأنسجة وحبس الحل في أنبوب ديسوسياتور وإضافة آخر مل 8 من حبس. كذلك إلغاء إقران الأنسجة باستخدام ديسوسياتور حتى تجانس.
  4. لاورام سرطان الجلد، وضع الأنابيب في ديسوسياتور وتشغيل التالية دورات كل مرة واحدة بهذا الترتيب: h_tumor_01.01، h_tumor_02.01، h_tumor_03.01، و m_heart_02.01.
  5. كشط 21 × 106 خلايا في 10 مل متوسطة (~ 3 × 106 لكل تعديل هيستون والمدخلات؛ يمكن تخفيضها إلى خلايا 100,000 كل علامة للسكان نادرة) تزرع في ثقافة الأنسجة قياسية صحن وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: الوسائط المستخدمة لخط خلية سرطان الجلد ممثل WM115 هو دميم وتستكمل مع 10% "مصل بقرى الجنين" و 5% البنسلين/ستربتوميسين.
  6. التشعب/خلايا الأنسجة باستخدام تركيز 1% فورمالدهايد نهائي بإضافة 200 ميليلتر من 16% فورمالدهايد كل 3 مل هبس للأنسجة (أو 3 مل من المتوسطة للخلايا). اهتز المخلوط 10 لفة في الدقيقة باستخدام خلاط للضبط 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    تنبيه: فورمالدهايد سامة وينبغي التعامل معها في غطاء الأبخرة مناسبة.
  7. إضافة 200 ميليلتر من جليكاين 2.0 M كل 3 مل عينة ويستمر الهز 10 لفة في الدقيقة لآخر 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: جليكاين بمثابة يحتوي. جعل الحل جليكاين جديدة كل شهر ك pf الأس الهيدروجيني الحل يميل على مر الزمن.
  8. تدور العينات في س 934 ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية باستخدام الطرد مركزي benchtop. إزالة المادة طافية، وإضافة 5 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني والطرد المركزي العينات مرة أخرى في 934 س ز وإزالة المادة طافية.
  9. فلاش تجميد بيليه وتخزينها في-80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.

3-الأنسجة تحلل و Sonication وإعداد جسم

  1. حل 1 قرص المانع حوزتي كل 10 مل من الرقائق العازلة الحصاد.
  2. إضافة 300 ميليلتر رقاقة حصاد المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز الواحد 50 مغ أنسجة والسماح لتحلل على الجليد و 30 دقيقة.
    ملاحظة: إضافة 300 ميليلتر من الرقائق العازلة الحصاد مع مثبطات البروتياز الواحدة 1 × 107 من خطوط خلايا سرطان الجلد WM115.
  3. بينما هي ليسينج الخلايا، قم بتشغيل حمام مائي disruptor ويرتبط نظام التبريد ودرجة الحرارة لتصل إلى 4 درجات مئوية. وضع أنابيب سونيكاتور في disruptor حمام مائي و sonicate أنسجة سرطان الجلد لدورات 60 في 30 s s على و 30 للحصول على شظايا الكروماتين ~ 200-600 قاعدة أزواج (bp).
    ملاحظة: يمكن أن تختلف بين نوع الأنسجة الوقت Sonication وأن تعدل وفقا لذلك. هذا هو خطوة حاسمة، وينبغي أن يكون الأمثل في تجربة رائدة قبل الشروع في إيمونوبريسيبيتيشن.
  4. أثناء سونيكيشن، تغسل 20 ميليلتر من البروتين ز المغناطيسي الخرز كل جسم كل عينة باستخدام ثلاث مرات 1000 ميليلتر ملزم/حجب المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني 0.1% توين-20 + + 0.2% جيش صرب البوسنة).
  5. ~ 8 ملغ أنسجة سرطان الجلد، لاحتضان 3 ميكروغرام لكل جسم هستون في 100 ميليلتر من ملزمة/حجب المخزن المؤقت لح 2 في 4 درجات مئوية مع تناوب استخدام مسدس أنبوب. 12 عينات لجسم المفرد تحتوي على 240 ميليلتر من الخرز، 36 ميكروغرام من الأجسام المضادة و 1200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم/حظر.
    ملاحظة: 3 × 106 خلايا، استخدام 5 ميكروغرام لكل جسم و 30 ميليلتر من "البروتين ز" المغناطيسي الخرز كل جسم. وينبغي أن تيتراتيد الأجسام المضادة والبروتين-ز الخرز إذا كان يتم استخدام كمية مختلفة من الأنسجة. هذا البروتوكول يوضح شروط إيمونوبريسيبيتيشن لوصف التعديلات هيستون ستة (جدول المواد)، ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل تركيزات الأجسام المضادة لعوامل النسخ وتعديلات أخرى.
  6. لتحديد حجم الشظايا وإزالة 20 ميليلتر لحل الكروماتين سونسياتيد وإضافة مخزن مؤقت شطف المزيج الرئيسي (درجة حرارة الغرفة) التي تحتوي على 44 ميليلتر من شطف المباشر المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من رناسي (20 ملغ/مل)، و 5 ميليلتر بروتيناز ك (20 ملغ/مل) كل عينة. احتضان هذه العينات في بكر cycler حرارية على الأقل 2 ح في 50 درجة مئوية. تنقية العينة استخدام مجموعة أدوات تنقية PCR تعليمات الشركات المصنعة.
  7. ضمان الكروماتين هو المنفصمة بما فيه الكفاية بتحديد حجم الشظايا باستخدام أداة اليكتروفيروجرام الحمض النووي حساسية عالية قبل المتابعة إلى الخطوة 3، 6. قم بتشغيل الأداة اليكتروفيروجرام.
  8. تحميل 2 ميليلتر من حساسية عالية العازلة الكاشف في كل بئر قطاع أنبوب بصري 8-جيدا. تحميل 2 ميليلتر من سلم حساسية عالية في ميليلتر أولاً جيدا و 2 من العينات النقية في الآبار المتبقية.
  9. وضع قبعات البصرية أنبوب على أنبوب استعراضات ودوامه العينات 2000 لفة في الدقيقة للحد الأدنى 1 فتح الغطاء وإدراج شريط جديد في شاشة عالية الحساسية ومربع من نصائح التحميل. إزالة قبعات قطاع وتحميل العينات في الصك اليكتروفيروجرام.
  10. فتح برامج التحليل وتسليط الضوء على المساحات الثلاث عشرة الأولى في الشريط الشاشة واضغط علامة التبويب ابدأ في الزاوية اليمنى السفلي. الكروماتين الشظايا التي تتراوح بين bp ~ 200-1000 تصلح للرقائق.
  11. نقل الحل سونيكاتيد لأنابيب معقمة وتدور هذه الأنابيب في س 21,130 ز استخدام جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية بأنابيب جديدة.
  12. تحديد الحجم الكلي للمادة طافية وإزالة 10% الحل الكلي لمراقبة المدخلات وتخزينها عند 4 درجة مئوية.

4-الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن

  1. حل قرصين مثبط البروتياز كل مل 20 رقاقة تمييع المخزن المؤقت.
  2. بعد sonication تمييع العينة المتبقية 5 مرات باستخدام رقاقة تمييع العازلة لجلب مستويات مخزونات النشر الاستراتيجي وصولاً إلى 0.1%. تمييع ميليلتر 270 من المادة طافية المتبقية مع ميليلتر 1080 رقاقة تمييع المخزن المؤقت للحصول على إجمالي حجم نهائي 1350 ميليلتر.
  3. عند انتهاء الحضانة للأجسام المضادة والبروتين ز المغناطيسي الخرز، ضع الأنبوبة في مغناطيس وإزالة المادة طافية.
  4. مع الأنبوب لا يزال جالساً على المغناطيس، يغسل الخرز مرة واحدة عن طريق إضافة 750 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع رقاقة مع مثبطات البروتياز.
    ملاحظة: من المهم عدم الإخلال بالخرز أو تدوير الأنابيب خلال هذه الخطوة.
  5. إزالة الرقائق العازلة تمييع تغسل وريسوسبيند الخرز في 240 ميليلتر لتمييع رقاقة نفس المخزن المؤقت. الكوة 20 ميليلتر من حبات إلى 12 أنابيب منفصلة، كل منها يستخدم عينة أنسجة منفصلة.
  6. قاسمة المواد سونيكاتيد بالتساوي للبروتين ز الخرز مع جسم معين وتعثر باستخدام مسدس أنبوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

5-الغسيل وعكس Crosslinking مجمعات البروتين الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد

  1. صباح اليوم التالي بعد crosslinking العكسية، نقل الحل جسم عالي البروتين إلى لوحة 96-جيدا ووضعه في موقف المغناطيسي. تسمح الخرز الانضمام لمالا يقل عن 30 ثانية وإزالة المادة طافية.
  2. أغسل حبات 5 مرات مع 150 ميليلتر المثلج المخزن المؤقت يغسل ريبا استخدام بيبيت متعدد القنوات. خلال خطوات الغسيل، لا لا بيبيت الخرز، ولكن تحريك المغناطيس باستمرار من اليمين إلى اليسار لمدة 30 ثانية لكل غسل.
  3. تغسل العينات مرتين مع 150 ميليلتر ريبا-500 المثلج يغسل المخزن المؤقت.
  4. تغسل العينات مرتين مع 150 ميليلتر ليكل المثلج يغسل المخزن المؤقت.
  5. تغسل العينات مرة واحدة مع 150 ميليلتر TE المثلج يغسل المخزن المؤقت وإزالة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات على الفور. يمكن أن يتم حذف هذه الخطوة لتطبيقات الإدخال المنخفضة.
  6. إضافة عنصر تحكم الإدخال من الخطوة 3.7 في آبار جديدة للوحة 96-كذلك تحتوي على عينات "الحمض النووي رقاقة".
  7. وبعد خطوات الغسيل، إضافة شطف مخزن رئيسي مزيج (درجة حرارة الغرفة) تحتوي على 44 ميليلتر المخزن المؤقت المباشر شطف، 1 ميليلتر من رناسي (20 ملغ/مل) و 5 ميليلتر بروتيناز ك (20 ملغ/مل) كل عينة رقاقة ومدخلات لعكس كروسلينكينج.
  8. احتضانها العينات باستخدام بكر cycler حرارية ح 4 في 37 درجة مئوية، 4 ح في 50 درجة مئوية وح 8-16 عند 65 درجة مئوية.

6-تنقية والتقدير الكمي للدنا سرع

  1. صباح اليوم التالي، ومكان العينات مرة أخرى على المغناطيس ونقل طافية إلى صفيحة بكر 96-بئر جديد الذي يحتوي على إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي.
  2. إضافة 2.3 x الخرز باراماجنيتيك إلى الحل (115 ميليلتر ل 50 ميليلتر من الحل) وبيبيت صعودا وهبوطاً 25 مرة استخدام بيبيت الأقنية بعناية. وسوف يصبح الحل متجانسة إذا كانت مختلطة بشكل صحيح.
  3. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة قبالة المغناطيس لدقيقة 4 مكان العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لآخر دقيقة 4 تجاهل المادة طافية.
  4. بينما تترك العينات على المغناطيس، إضافة 150 ميليلتر من الإيثانول 70% (المجلد/المجلد) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية دون الإخلال بالخرز.
  5. إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل. تسمح الخرز باراماجنيتيك للهواء الجاف في المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: إزالة كافة الإيثانول بعد الغسيل الثاني الإيثانول المتبقية سوف تتداخل مع تنقية.
  6. إزالة العينات من المغناطيس وإضافة 30 ميليلتر من 10 ملم تريس Cl pH 8.0. مزيج من بيبيتينج 25 مرة واحتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة قبالة المغناطيس لمدة 4 دقائق.
  7. وضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لآخر دقيقة 4 نقل 20 ميليلتر لكل عينة للوحة 96-بئر جديدة لإعداد مكتبة. تخزين ميليلتر 10 المتبقية من "رقاقة الحمض النووي" في حالة حدوث أية مشكلات محتملة مع جيل المكتبات.
  8. وفي هذه المرحلة، تحديد حجم "رقاقة الحمض النووي" قبل إعداد المكتبة. يتم قياس تركيز الحمض النووي مع كواشف الحمض النووي حساسية عالية. تحديد توزيع حجم الحمض النووي سرع استخدام حساسية عالية الحمض النووي اليكتروفيروجرام صك متابعة إلى الخطوة 7، 1.

7-مكتبة الجيل باستخدام "نيبنيكست الترا الثاني الحمض النووي مكتبة إعداد مجموعة"

  1. إنشاء مكتبات لتسلسل خ ع استخدام "إعداد مكتبة الحمض النووي" بعد البروتوكول الموصى بها من الشركة المصنعة. وتجري جميع ردود الفعل في لوحات 96-جيدا وتتم إينكوباتيونس في بكر cycler حرارية مع تعيين درجة حرارة الغطاء > 100 درجة مئوية ووحدة التخزين المحددة في 50 ميليلتر.
  2. وتستخدم للفهارس، "أوليجوس متعدد" لمنصة خ ع. نفذ ما مجموعة 10 x دورات للتضخيم PCR باستخدام الإعدادات التالية: تمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 10 s، والصلب/ملحق في 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (10 x دورات)، التمديد النهائي 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتضمن الجدول 1 كبسولة تفجير يستخدم للتضخيم PCR.
  3. بعد التضخيم بكر، إزالة العينات وأن إجمالي حجم 100 ميليلتر استخدام مياه خالية من نوكلاس. القيام بتحديد حجم باراماجنيتيك على الوجهين (0.55x/0.8x) بأول ميليلتر 55 إضافة من الخرز ومزيج من بيبيتينج 25 مرة. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة قبالة المغناطيس لمدة 4 دقائق.
  4. وضع العينات مرة أخرى على مغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لآخر 4 دقيقة. يتم استخدام هذه الخطوة الاحتفاظ بأجزاء كبيرة في الخرز التي غير ملائمة للتسلسل.
  5. نقل المادة طافية على صفيحة بكر 96-بئر جديدة. عدم تجاهل المادة طافية كهذا يحتوي على الحمض النووي المنقي جزئيا.
  6. إضافة آخر ميليلتر 25 من حبات باراماجنيتيك ومزيج من بيبيتينج 25 مرة واحتضان في درجة حرارة الغرفة قبالة المغناطيس لمدة 4 دقائق.
  7. وضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 4 آخر وتجاهل المادة طافية. يتم استخدام هذه الخطوة للاحتفاظ بأجزاء من ~ 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم التي سيتم استخدامها لوضع الصيغة النهائية للمكتبات.
  8. بينما تترك العينات على المغناطيس، إضافة 150 ميليلتر من الإيثانول 70% (v/v) والسماح بحضانة لمدة 30 ق دون الإخلال بالخرز (لا تتحرك بينما على المغناطيس). إزالة الإيثانول وتكرار الغسيل لمرة ثانية.
  9. تسمح الخرز باراماجنيتيك للهواء الجاف في المغناطيس للحد الأدنى 5 إزالة جميع الإيثانول بعد الغسيل الثاني الإيثانول المتبقية سوف تتداخل مع تنقية.
  10. إزالة العينات من المغناطيس وإضافة 25 ميليلتر من 10 ملم تريس Cl pH 8.0. مزيج من بيبيتينج 25 مرة واحتضان في درجة حرارة الغرفة قبالة المغناطيس لدقيقة 4 مكان العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 4 آخر.
  11. التحديد الكمي للمكتبات باستخدام أداة اليكتروفيروجرام الحمض النووي حساسية عالية قبل الإرسال المتعدد للتأكد من أحجام مناسبة للتسلسل. المكتبات المكتملة تتراوح بين 200-600 شركة بريتيش بتروليوم وهي خالية من جميع مبلمر.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يتم تنفيذ آخر 0.7 × تنقية حبة باراماجنيتيك لإزالة مبلمر غير المرغوب فيها التي تكون موجودة في ~ 130 شركة بريتيش بتروليوم.
  12. تجمع كمياً الحمض النووي استناداً إلى فهرس فريد الإشعال وفقا للتركيز. تجمع الذي يحتوي على ست عينات مع التركيزات بين 1 نانوغرام/ميليلتر و 6ng/ميليلتر، هو التوزيع 15 ميليلتر من العينة أقل وميليلتر 2.5 من العينة أعلى. يتم ذلك للتأكد من قراءة التهم سوف توزع بالتساوي على كل حارة من الخلية تدفق.

8-وظيفة seq رقاقة معالجة البيانات

  1. خط أنابيب استناداً إلى38، سناكيماكي39 المستخدمة للخطوات العملية لكل ما يلي في أمر واحد. الأهم من ذلك، تناقش كل خطوة من هذه الخطوات على حدة مع الأوامر المرتبطة بها.
  2. تحديد نوعية ما يلي تسلسل فاستق الخام باستخدام فاستقك (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): فتح المحطة الطرفية unix وتغيير الدليل (cd) إلى المجلد الذي يحتوي على الملفات الخام فاستق لكل من التعديلات هيستون ستة. في نوع المحطة الطرفية unix، *fastq.gz فاستقك واضغط [عودة]. سيتم تشغيل هذا مقاييس مراقبة الجودة على كافة الملفات في المجلد فستق.
  3. محاذاة يقرأ نوعية للجينوم المرجعية وإزالة التكرارات قبل الضغط على ملفات أم. وهذا يتم باستخدام الإصدار 1.1.2 bowtie39و الإصدار 0.1.21 سامبلاستير40سامتولس الإصدار 1.3.141: في unix نوع المحطة الطرفية، bowtie-م 1-ن 1-أفضل-الطبقات-S-q/path_to/hg19 histone1.fastq.gz | سامبلاستير-ريموفيدوبس | عرض سامتولس-س--> histone1.bam والصحافة [عودة].
    ملاحظة: يشير path_to إلى المجلد الذي يحتوي على الجمعية الجينوم البشري hg19. سيؤدي ذلك إلى تغيير تبعاً للكائن الحي للفائدة.
  4. فرز الملفات أم باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي: في نوع المحطة الطرفية unix، فرز سامتولس histone1.bam-م ز 2-@ 5-T histone1.temp-o histone1.sorted والصحافة [عودة].
  5. فهرسة الملفات أم باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي: في نوع المحطة الطرفية unix، مؤشر histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai سامتولس واضغط [عودة].
  6. تحديد القراءات المعينة بشكل فريد والوسط باستخدام فلاجستات سامتولس باستخدام الأمر التالي: نوع المحطة الطرفية unix، سامتولس فلاجستات histone1.sorted.bam واضغط [عودة].
  7. تطبيع الملفات أم كل التهم القراءة عن طريق القيام بأخذ عينات عشوائية باستخدام الأمر التالي: في نوع المحطة الطرفية unix، عرض سامبامبا-إف أم-الاختزال-البذور = 3-s 0.X histone1.sorted.bam | سامتولس فرز-م ز 2-@ 5-T histone1.downsample.temp-o histone1.downsample.sorted.bam والصحافة [عودة].
  8. فهرسة الملفات أم مرة أخرى باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي: في نوع المحطة الطرفية unix، مؤشر histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai سامتولس واضغط [عودة].
  9. لتصور مكتبات رقاقة seq في مستعرض جينوم (أي. التسخن أو IGV)، إنشاء ملفات نتأمل باستخدام الإصدار 2.4.0 ديبتولس40 برفع الملفات أم بما يلي: كل كيلوباسي كل مليون (ربكم). ويمكن إجراء ذلك باستخدام الأوامر التالية:
    1. لملفات نتأمل القياسية: في نوع المحطة الطرفية unix، بامكوفيراجي-ب histone1. downsample.sorted.bam-نورماليزيوسينجربكم-بينسيزي 30-سموثلينجث 300-اكستيندريدس 200-o histone1.bw والصحافة {العودة].
    2. لإدخال خصم نتأمل الملفات: في نوع المحطة الطرفية unix، بامكومباري-histone1.downsample.sorted.bam bamfile1-bamfile2 input1.downsample.sorted.bam-نورماليزيوسينجربكم-نسبة استقطاع-بينسيزي 30-سموثلينجث 300-اكستيندريدس 200-o histone1.subtracted.bw واضغط [عودة].
  10. تحديد seq رقاقة إشارة الإثراء على خلفية "الإدخال" باستخدام نموذج على أساس تحليل الرقائق-seq (ماك) الإصدار 1.4.225،26 والإصدار 2.1.0. استخدام macs1 لعوامل "نقطة المصدر" H3K4me3 و H3K4me1 و H3K27ac و macs2 لعوامل "مصدر واسع النطاق" H3K79me2 و H3K27me3 و H3K9me3. وهذا يتم باستخدام الأوامر التالية:
    1. لنقطة المصدر: نوع المحطة الطرفية unix، macs14-t histone1.downsample.sorted.bam-ج input1.downsample.sorted.bam-ز hs-إف أم-ف 1e-5-نوموديل-تبقى-الحزب الاتحادي الديمقراطي في جميع histone1.file-n ثم اضغط [عودة].
    2. لمصدر واسع النطاق: في نوع المحطة الطرفية unix، macs2 كالبيك-t histone1.downsample.sorted.bam-ج input1.downsample.sorted.bam-ز hs-و 1e-س أم-6-واسعة-واسع-قطع 1e-6-تبقى-الحزب الاتحادي الديمقراطي جميع histone1.file-نوموديل-n ثم اضغط [عودة].
  11. استخدام تشرومهم24 لتحديد أنماط الكروماتين اندماجي الدولة استناداً إلى التعديلات هيستون درس باستخدام الأوامر التالية:
    1. في المحطة الطرفية ل unix اكتب cd/path_to/ChromHMM_folder، واضغط [عودة].
    2. مرة واحدة في نوع الدليل تشرومهم، جافا-mx2G-جرة بيناريزيبام ChromHMM.jar-ب 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory/path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output واضغط [عودة].
    3. نوع، جافا-mx2G-جرة ليرنموديل ChromHMM.jar-ب 1000/path_to/بيناريزيبام/path_to/output_directory 15 hg19 واضغط [عودة].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويسمح هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن من أنسجة الورم المجمدة وخطوط الخلايا التي يمكن أن يؤديها على العشرات من العينات في نفس الوقت باستخدام أسلوب الفائق (الشكل 1A). شظايا الكروماتين ينبغي أن يتراوح بين bps ~ 200-1000 للأمثل إيمونوبريسيبيتيشن. وقد لاح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول وحدة كاملة وشاملة من جانب seq رقاقة الفائق لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للدول الكروماتين في خطوط الخلايا والأنسجة البشرية الورم. في أي بروتوكول seq رقاقة، واحد من أهم الخطوات خصوصية جسم. وهنا، يوضح هذا الأسلوب الظروف إيمونوبريسيبيتيشن للتعديلات هيستون وصف ستة، ك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يعلن أي تعارض.

Acknowledgements

ونحن نشكر ماركوس كويل، غمبس كورتيس، الأساسية SMF في مداكك لدعم التسلسل. العمل الموصوف في هذه المقالة دعم المنح من المنحة المعاهد الوطنية للصحة (CA016672) "نواة صندوق التدابير الخاصة" وجوائز لجنة التحقيق الوطنية (1K99CA160578 و R00CA160578) ر. ك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

References

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 Seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved