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Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Resumo

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Introdução

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aberrantes mecanismos epigenéticos podem levar a organização inadequada da estrutura da cromatina, incluindo o acesso aos elementos reguladores, sistemas loop cromossômicos e de padrões de expressão de gene6, 7,8,9,10.

Apesar dos avanços recentes, nós limitamos a compreensão das alterações epigenéticas que estão associados com a progressão do tumor ou resposta terapêutica. A Epigenoma consiste de uma matriz de modificações, incluindo marcas de histona e metilação de DNA, que coletivamente formam um estado dinâmico (designado Estado de cromatina) que colide com redes de expressão de gene e outros processos críticos para a manutenção identidade celular. Recentemente, alterações em potenciadores foram mostradas em várias neoplasias malignas através do estudo de perfis de H3K27Ac11. Embora tais estudos fornecem insights sobre a correlação de marcas epigenéticas isoladas, mais de 100 modificações epigenéticas têm sido identificadas12,13 , sem uma compreensão clara das suas funções biológicas e interdependência. Além disso, há um número ainda maior de possíveis padrões combinatórios destes histona e modificações de DNA, e é desses padrões combinatórios - modificações não individuais - que ditam Estados epigenéticas14. Portanto, há uma enorme necessidade de identificar alterações nestes Estados de cromatina durante a progressão do câncer ou respostas à terapia. Conhecimento abrangente das alterações Epigenoma em cânceres tem sido atrasadas em parte devido à técnica (por exemplo, a geração de dados em larga escala de pequena quantidade de células de material/única clínicas) e analítico (por exemplo, algoritmos para definir desafios de combinatória Estados). Portanto, há uma necessidade crítica de robustas métodos de alta produtividade para criação de perfil de grande número de marcas de modificação do histone de material clínico e fácil de implementar abordagens computacionais para prever padrões combinatórios que facilitará determinação da epigenéticas Estados associados com diferentes estágios de resistência terapêutica e tumorigênese. Dados complementares, disponíveis a partir do recente Epigenoma de perfil estudos15,16,17,18,19,20,21, 22,23 em linhas de células e tecidos normais podem ser integrados com perfis de cromatina de tumores para mais introspecções Epigenoma contribuição à biologia do tumor.

Criação de perfil de cromatina, tornou-se uma poderosa ferramenta para identificar os padrões de ligação global de cromatina várias modificações15,24. Nos últimos anos, ChIP-seq tornou-se o "padrão ouro" para estudar interações DNA-proteína em uma escala global25,26,27. Para qualquer experiência de ChIP-seq, existem passos críticos necessários para seu sucesso, incluindo processamento de tecido e dissociação, determinar condições optimal sonication, determinar a concentração de anticorpo para a precipitação, preparação de biblioteca, pós-sequenciamento de processamento de dados e análise a jusante. Cada um destes passos contêm pontos de verificação de chave de controle de qualidade e quando tomados em conjunto, são crucial para adequadamente, identificando potenciais alvos para validação funcional. Através da inovação nessas etapas, vários estudos prévios desenvolveram metodologias para executar o ChIP ou ChIP-Seq de pequena quantidade de tecidos28,29,30,31,32 . Além disso, alguns estudos têm sugerido que os protocolos para experimentos de ChIP do elevado-throughput seguidos pelo PCR baseado quantificação33,34. Finalmente, algumas plataformas de análise disponível publicamente para ChIP-Seq dados agora estão disponíveis como Easeq35 e galáxia36. No entanto, uma plataforma integrada para a realização de ChIP-Seq em uma moda de alta produtividade em combinação com um encanamento computacional para executar marca única, bem como análises de estado cromatina tem faltado.

Este protocolo descreve um completo e abrangente ChIP-seq de fluxo de trabalho para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor e linhas de celular, com fácil de seguir diretrizes englobando todas as etapas necessárias para uma experiência bem sucedida. Através da adopção de um método de alta produtividade anteriormente descrito por Blecher-Gonen et al 37, este protocolo pode ser executado em dezenas de amostras em paralelo e tem sido aplicado com sucesso em linhas de células de câncer e tumores humanos como melanoma, cólon, próstata e glioblastoma multiforme. Vamos demonstrar a metodologia para seis modificações do histone de núcleo que representam os principais componentes da paisagem epigenética regulamentar em linhas de células de melanoma humano e amostras de tumor. Essas modificações incluem H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão) e H3K9me3 (heterocromático repressão). Estas marcas podem ser usadas sozinho ou em combinação para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos.

Protocolo

Todas as amostras clínicas foram obtidas seguindo as orientações do Conselho de revisão institucional.

1. preparação buffer

  1. Fazer 200 mL de tampão TE (Tris-HCl, pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 10mm 8.0 de 10 mM).
  2. Fazer 200 mL de tampão STE (10 mM Tris-HCl, pH de EDTA 10 mM 8.0, 140 mM de NaCl).
  3. Fazer 200 mL de glicina 2,0 M (37,52 g de glicina em 200 mL de água) e aquecê-lo a 65 ° C.
  4. Fazer 200 mL de solução a 5% de sódio deoxycholate (DOC) (10 g de DOC em 200 mL de água).
  5. Fazer 500 mL de tampão de colheita de ChIP (12 mM Tris-Cl, 0,1 x solução salina tampão fosfato (PBS), EDTA, 0,5% sulfato dodecyl de sódio (SDS) de 6 mM).
  6. Fazer 500 mL de tampão de diluição de ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM de NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Fazer 500 mL de tampão de lavagem RIPA (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Fazer 500 mL de tampão de lavagem RIPA/500 (amortecedor de RIPA + 360 mM NaCl).
  9. Fazer 500 mL de tampão de lavagem LiCL (TE, LiCl, 0,5% de 250 mM NP-40, 0,5% DOC).
  10. Fazer 500 mL de tampão de eluição direto: pH 10 mM Tris-Cl 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM de NaCl, SDS 0,5%.
  11. Fazer 50 mL de tampão de ligação/bloqueio de anticorpo (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% IgG-livre BSA).

2. tecido/célula linha de processamento e cross-linking

  1. Se o tecido for flash congelado, dethaw-lo no gelo antes da dissociação.
  2. Desassocie a 50 mg de tecido (~ 8 mg por anticorpo de modificação de histona) manualmente em 2 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) usando uma lâmina de barbear estéril. Picar o tecido em pedaços de 3 a 4 mm para cerca de 5 min em um prato de cultura de tecido estéril.
  3. Transferir a solução HBSS e tecido em um tubo de dissociador e adicionar outro 8 mL de HBSS. Mais desassocie o tecido usando um dissociador até homogeneizado.
  4. Para tumores de melanoma, coloque os tubos em um dissociador e executar os seguintes ciclos cada um uma vez nesta ordem: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 e m_heart_02.01.
  5. Arranhão 21 × 106 células em 10 mL de meio (~ 3 × 106 por modificação de histona e entrada; isso pode ser reduzido para 100.000 células por marca para populações raras) cultivado em cultura de tecido padrão prato e cobrá-los em um tubo cônico de 15 mL.
    Nota: Os suportes utilizados para a linhagem de células de melanoma representante WM115 são DMEM suplementado com 10% de soro Fetal bovino e 5% penicilina/estreptomicina.
  6. Crosslink os tecidos/células usando uma concentração de 1% de formaldeído final adicionando-se 200 µ l de 16% de formaldeído por 3 mL HBBS para tecido (ou 3 mL de meio para as células). Agitar a mistura em 10 rpm usando um mixer para exatamente 10 min a 37 ° C.
    Cuidado: Formol é tóxico e deve ser tratada em uma coifa adequado.
  7. Adicionar 200 µ l de glicina 2,0 M por 3 mL da amostra e continuar apertando a 10 rpm por mais 5 min a 37 ° C.
    Nota: Glicina atua como um quencher. Fazer a solução de glicina fresco cada mês como o pH pf que a solução tende ao longo do tempo.
  8. Gire as amostras a 934 x g por 5 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante, adicionar 5 mL de PBS frio gelo, Centrifugar as amostras novamente a 934 x g e remover o sobrenadante.
  9. Flash congelar a pelota e armazená-lo a-80 ° C para posterior processamento.

3. tecido Lysis, Sonication e preparação de anticorpos

  1. Dissolva 1 comprimido de inibidor de protease por 10 mL de tampão de colheita do ChIP.
  2. Adicionar 300 µ l de tampão de colheita ChIP com inibidores de protease por 50 mg de tecido e deixar 30 min de Lise no gelo.
    Nota: Adicione 300 µ l de tampão de colheita ChIP com inibidores de protease por 10 X 17 de WM115 linhas de células de melanoma.
  3. Enquanto as células são Lise, ligar o o disruptor do banho-maria e o sistema de resfriamento associado e permitir que a temperatura chegar a 4 ° C. Coloque os tubos do sonicador no disruptor em tanque de imersão e proceda à sonicação os tecidos de melanoma em 60 ciclos com 30 s no e 30 s para obter fragmentos de cromatina de ~ 200-600 pares de bases (bp).
    Nota: Tempo Sonication pode diferir entre o tipo de tecido e deve ser ajustado em conformidade. Esta é uma etapa crítica e deve ser otimizada no experimento piloto antes de prosseguir para a imunoprecipitação.
  4. Durante sonication, lave 20 µ l de grânulos magnético de proteína G por anticorpo por amostra três vezes usando 1000 µ l de tampão de ligação/bloqueio (PBS 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Para ~ 8 mg de tecido de melanoma, incube 3 µ g de cada anticorpo de histona em 100 µ l de ligação / bloqueio de buffer para 2 h a 4 ° C com rotação usando um revólver de tubo. 12 amostras para um anticorpo singular contêm 240 µ l de grânulos, 36 µ g de anticorpo e 1200 µ l de tampão de ligação/bloqueio.
    Nota: Para 3 × 106 células, use 5 µ g de cada anticorpo e 30 µ l de grânulos magnéticos de proteína G por anticorpos. Anticorpo e grânulos de proteína-G devem ser titulados se diferentes quantidade de tecido está sendo usada. Este protocolo ilustra imunoprecipitação condições para as modificações de histona seis descritos (Tabela de materiais), no entanto, as concentrações de anticorpos devem ser otimizadas para outras modificações e fatores de transcrição.
  6. Para determinar o tamanho do fragmento, remover 20 µ l de solução de cromatina sonciated e adicionar um tampão de eluição mestre mistura (temperatura ambiente) contendo 44 µ l de eluição direta buffer, 1 µ l de RNase (20mg/mL) e 5 µ l Proteinase K (20mg/mL) por amostra. Incubar as amostras em um termociclador PCR pelo menos 2 h a 50 ° C. Purifica a amostra usando um kit de purificação de PCR, seguindo as instruções dos fabricantes.
  7. Certifique-se de cromatina é suficientemente cortada, determinando o tamanho do fragmento usando um instrumento de electroferograma de DNA de alta sensibilidade antes de prosseguir para a etapa 3.6. Ligue o instrumento de electroferograma.
  8. Carrega 2 µ l de reagente de buffer de alta sensibilidade em cada poço de uma tira de tubo óptico 8 poços. Carrega 2 µ l de escada alta sensibilidade para o primeiro bem e 2 µ l das amostras purificadas em poços restantes.
  9. Colocar tampões tubo óptico no tubo stips e vórtice as amostras a 2000 rpm por 1 min. abrir a tampa e uma nova fita de tela de alta sensibilidade e caixa de pontas de carregamento. Remova as tampas de strip-tease e carregar as amostras no instrumento electroferograma.
  10. Abra o software de análise, destacar os primeiro treze espaços na fita tela e pressione o guia início, no canto inferior direito. Fragmentos de cromatina, variando entre ~ 200-1000 bp são adequados para o ChIP.
  11. Transferir a solução lisada para tubos estéreis e girar os tubos no 21.130 x g, utilizando uma centrífuga de mesa para 15 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para tubos novos.
  12. Determinar o volume total do líquido sobrenadante e remover 10% da solução total para o controle de entrada e armazená-lo em 4 ° C.

4. imunoprecipitação da cromatina

  1. Dissolva 2 tabletes de inibidor de protease por 20 mL de tampão de diluição do ChIP.
  2. Depois sonication diluir a amostra restante 5 vezes usando tampão de diluição de ChIP para trazer os níveis de SDS até 0,1%. Dilua a 270 µ l do sobrenadante restante com 1080 µ l de tampão de diluição do ChIP para obter um volume total final de 1350 µ l.
  3. Quando termina a incubação do anticorpo e proteína grânulos magnéticos de G, colocar o tubo em um ímã e remover o sobrenadante.
  4. Com o tubo ainda sentado sobre o ímã, lave os grânulos uma vez adicionando 750 µ l de tampão de diluição de ChIP com inibidores de protease.
    Nota: É importante para não perturbar os grânulos ou girar os tubos durante esta etapa.
  5. Retire o ChIP de tampão de diluição lavar e Resuspenda os grânulos em 240 µ l do tampão de diluição de ChIP mesmo. Alíquota 20 µ l de grânulos para 12 tubos separados, cada um dos quais é usado para uma amostra de tecido separado.
  6. Alíquota lisado material uniformemente a grânulos de proteína G com anticorpo específico e tombo usando um revólver do tubo durante a noite a 4 ° C.

5. lavagem e reversa reticulação de complexos de Immunoprecipitated DNA-proteína

  1. Na manhã seguinte após a reticulação reversa, transferir a solução de anticorpo-proteína para uma placa de 96 poços e coloque-o sobre o suporte magnético. Permitir que os grânulos de aderir para pelo menos 30 s e remover o sobrenadante.
  2. Lave os grânulos 5 vezes com 150 µ l de tampão de lavagem gelado RIPA usando uma pipeta multicanal. Durante as etapas de lavagem, fazer não Pipetar os grânulos, mas mover o ímã continuamente da direita para a esquerda para 30 s por lavagem.
  3. Lave as amostras duas vezes com 150 µ l de tampão de lavagem gelado RIPA-500.
  4. Lave as amostras duas vezes com 150 µ l de tampão de lavagem LiCl gelado.
  5. Lavar as amostras com 150 µ l de tampão de lavagem TE gelado e remover o tampão TE imediatamente. Esta etapa pode ser omitida para aplicações de entrada baixas.
  6. Adicione o controle de entrada da etapa 3.7 em frescos poços da placa de 96 poços, contendo as amostras de DNA de ChIP.
  7. Após as etapas de lavagem, adicione uma eluição reserva mestre mistura (temperatura ambiente) contendo 44 µ l de tampão de eluição direto, 1 µ l de RNase (20mg/mL) e 5 µ l Proteinase K (20mg/mL) por amostra ChIP e entrada para reticulação reversa.
  8. Incubar as amostras usando um termociclador PCR por 4 h a 37 ° C, 4 h a 50 ° C e 8-16 h a 65 ° C.

6. purificação e quantificação de DNA precipitado

  1. A manhã seguinte, o lugar as amostras de volta sobre o ímã e a transferência de sobrenadante para uma nova placa PCR de 96 poços que contém o DNA de immunoprecipitated.
  2. Adicione 2.3 x grânulos paramagnéticos a solução (115 µ l para 50 µ l de solução) e, cuidadosamente, pipeta e descer 25 vezes usando uma pipeta multicanal. A solução se tornará homogênea se corretamente misturado.
  3. Incube a solução à temperatura ambiente fora do ímã de 4 min. lugar as amostras de volta sobre o ímã e incubam a temperatura ambiente por mais 4 min. descartar o sobrenadante.
  4. Deixando as amostras sobre o ímã, adicione 150 µ l de etanol 70% (vol/vol) e incubar a temperatura ambiente por 30 s sem perturbar os grânulos.
  5. Remova o etanol e repita a lavagem. Permitir que os grânulos paramagnéticos de ar seco sobre o ímã por 5 min.
    Nota: Remova todos o etanol após a segunda lavagem como etanol restante irá interferir com a purificação.
  6. Remover as amostras do ímã e adicione 30 µ l de pH de 10 mM Tris-Cl 8.0. Misture pipetando 25 vezes e incubar as amostras à temperatura ambiente fora do ímã para 4 min.
  7. Coloque o ímã as amostras e incubar a temperatura ambiente por outro µ l de 4 min. 20 transferência de cada amostra para uma nova placa de 96 poços para preparação de biblioteca. Armazene os restantes 10 µ l de DNA de ChIP em caso de quaisquer problemas potenciais com geração de bibliotecas.
  8. Nesta fase, quantificar o DNA de ChIP antes da preparação da biblioteca. A concentração de DNA é medida com reagentes de DNA de alta sensibilidade. Determine a distribuição de tamanho de DNA precipitado, usando um processo de instrumento de electroferograma de DNA alta sensibilidade ao passo 7.1.

7. Biblioteca geração usando o NEBNext Ultra II DNA Kit biblioteca preparação

  1. Gere bibliotecas para sequenciamento NGS usando DNA Biblioteca preparação seguindo o protocolo recomendado do fabricante. Todas as reações são executadas em placas de 96 poços e incubação do é executadas em um termociclador PCR com o conjunto de temperatura tampa > 100 ° C e o volume de 50 µ l.
  2. Para índices, são utilizados os Oligos Multiplex para plataforma NGS. Realizar um total de 10 ciclos de x para amplificação por PCR usando as seguintes configurações: desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s, desnaturação a 98 ° C, durante 10 s, recozendo/extensão a 65 ° C por 30 s (10 x ciclos), extensão final 65 ° C por 5 min e espera a 4° C.
    Nota: A tabela 1 contém os primers utilizados para amplificação por PCR.
  3. Após a amplificação por PCR, remover as amostras e trazer o volume total de 100 µ l utilizando água livre de nuclease. Realizar seleção de dupla face tamanho paramagnético (0.55x/0.8x) por µ l 55 adicionando primeiro dos grânulos e misture pipetando 25 vezes. Incube as amostras à temperatura ambiente fora do ímã para 4 min.
  4. Coloque um ímã as amostras e incubar a temperatura ambiente por mais 4 minutos. Esta etapa é usada para reter fragmentos grandes sobre as contas que são impróprios para sequenciamento.
  5. Transferi o sobrenadante para uma nova placa PCR de 96 poços. Não desprezar o sobrenadante como contém DNA parcialmente purificado.
  6. Adicione outro 25 µ l de grânulos paramagnéticos e misturar pipetando 25 vezes e incubar a temperatura fora do ímã para 4 min.
  7. Colocar as amostras de volta sobre o ímã e incubar a temperatura ambiente por mais 4 minutos e descartar o sobrenadante. Esta etapa é usada para reter fragmentos de ~ 200 a 600 bp que será usado para finalizado bibliotecas.
  8. Deixando as amostras sobre o ímã, adicione 150 µ l de etanol 70% (v/v) e permitir a incubação por 30 s sem perturbar os grânulos (não passe enquanto o ímã). Remova o etanol e repita a lavagem uma segunda vez.
  9. Permitir que os grânulos paramagnéticos de ar seco sobre o ímã de 5 min. remover todo etanol após a segunda lavagem como etanol restante irá interferir com a purificação.
  10. Remover as amostras do ímã e adicione 25 µ l de pH de 10 mM Tris-Cl 8.0. Misture pipetando 25 vezes e incubar a temperatura fora do ímã de 4 min. lugar as amostras de volta sobre o ímã e incubam a temperatura ambiente por mais 4 minutos.
  11. Quantificar as bibliotecas usando um instrumento de electroferograma de DNA de alta sensibilidade antes de multiplexação para garantir tamanhos são apropriados para o sequenciamento. Concluídas as bibliotecas variam entre 200-600 bp e são desprovidas de todos os dímeros da primeira demão.
    Nota: Se necessário, outro 0.7 x purificação paramagnética do grânulo é realizada para remover dímeros cartilha indesejáveis que estão presentes em ~ 130 bp.
  12. O DNA quantificado com base em cartilhas de índice exclusivo de acordo com a concentração de piscina. Para uma piscina que contém seis amostras com concentrações de 1 ng / µ l e 6ng / µ l, a distribuição é 15 µ l da amostra mais baixa e 2,5 µ l da amostra maior. Isto é feito para garantir a leitura contagens serão distribuídas uniformemente em cada lane da célula de fluxo.

8. pós-processamento de dados do ChIP-seq

  1. Um pipeline com base no snakemake38,39 é usado para processo de todas as seguintes etapas em um único comando. Importante, cada um destes passos são discutidos individualmente com os respectivos comandos.
  2. Determinar a qualidade das leituras de sequenciamento bruto fastq usando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Abra o terminal unix e altere o diretório (cd) para a pasta que contém os arquivos de fastq cru para cada uma das seis modificações do histone. No tipo de terminal unix, fastqc *fastq.gz e pressione [retorno]. Isso executará métricas de controle de qualidade em todos os arquivos fastq na pasta.
  3. Alinhe a leituras de qualidade para o genoma de referência e remover duplicatas antes da compactação de arquivos de bam. Isto é realizado usando bowtie versão 1.1.239, SAMBLASTER versão 0.1.2140e SAMTOOLS versão 1.3.141: no unix terminal tipo, bowtie -m 1 - n 1..--melhor..--estratos -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Ver os -Sb - > histone1.bam e imprensa [retorno].
    Nota: path_to indica a pasta que contém o assembly de genoma humano hg19. Isto mudará dependendo do organismo de interesse.
  4. Classificar arquivos de bam usando SAMTOOLS com o seguinte comando: o tipo de terminal unix, samtools tipo histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted e imprensa [retorno].
  5. Indexar arquivos bam usando SAMTOOLS com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai de índice e pressione [retorno].
  6. Determinar excepcionalmente mapeadas e desalinhadas leituras usando SAMTOOLS flagstat com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam e pressione [retorno].
  7. Normalizar arquivos de bam por contagens de leitura por meio de amostragem aleatória, com o seguinte comando: o tipo de terminal unix, sambamba exibir bam -f-subamostragem-semente = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools classificar -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam e imprensa [retorno].
  8. Indexar os arquivos bam novamente usando o SAMTOOLS com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai de índice e pressione [retorno].
  9. Para visualizar o ChIP-seq bibliotecas em um navegador do genoma (i. e. UCSC ou IGV), gerar arquivos de figurão usando deepTools versão 2.4.040 dimensionando os arquivos bam de leituras por mil por milhão (RPKM). Isso pode ser realizada usando os seguintes comandos:
    1. Para arquivos padrão manda-chuva: o tipo de terminal unix, bamCoverage -b histone1. downsample.Sorted.bam - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300..--extendReads 200 -o histone1.bw e imprensa {RETURN].
    2. Para entrada subtraído arquivos figurão: no tipo de terminal unix, bamCompare..--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam..--bamfile2. input1.downsample.sorted.bam..--normalizeUsingRPKM..--relação de subtrair..--binSize 30..--smoothLength 300..--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW e imprensa [retorno].
  10. Identifique o enriquecimento de sinal do ChIP-seq sobre fundo de "Entrada" usando a análise do modelo com base de ChIP-seq (MACS) versão 1.4.225,26 e versão 2.1.0. Use macs1 para "ponto de origem" fatores H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac e macs2 por fatores "fonte ampla" H3K79me2, H3K27me3 e H3K9me3. Isto é realizado usando os seguintes comandos:
    1. Para o ponto de origem: Do tipo terminal unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5..--nomodel..--Mantenha-dup todas histone1.file - n e pressione [retorno].
    2. Para ampla fonte: No tipo de terminal unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6..--ampla..--larga-corte 1e-6..--Mantenha-dup todos..--nomodel histone1.file - n e pressione [retorno].
  11. Uso ChromHMM24 para identificar padrões de cromatina combinatória estado baseia-se a modificações do histone estudadas usando os seguintes comandos:
    1. No terminal unix digite cd/path_to/ChromHMM_folder e [retorno].
    2. Uma vez no ChromHMM tipo diretório, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output e pressione [retorno].
    3. Tipo, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/hg19 output_directory 15 e pressione [retorno].

Resultados

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O suces...

Discussão

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios42,<...

Divulgações

Autores declaram sem conflitos.

Agradecimentos

Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo do SMF no MDACC para suporte de sequenciamento. O trabalho descrito neste artigo foi apoiado por subsídios do grant NIH (CA016672) ao núcleo do SMF e ICN awards (1K99CA160578 e R00CA160578) para K. R.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Referências

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