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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Zusammenfassung

Histon-Modifikationen stellen eine wichtige Komponente des das epigenom und eine wichtige regulatorische Rolle bei der Bestimmung der transkriptionellen Status der zugehörigen Loci. Darüber hinaus hat das Vorhandensein von spezifischen Änderungen verwendet worden, die Position und nicht-kodierenden Funktionselemente wie Enhancer für Identität bestimmen. In den letzten Jahren geworden Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-Seq) ein mächtiges Werkzeug bei der Bestimmung der genomweiten Profile der einzelnen Histon-Modifikationen. Jedoch ist es immer deutlicher geworden, dass die kombinatorische Muster von Chromatin Modifikationen, als Chromatin Staaten bezeichnet die Identität und die Natur von der damit verbundenen genomischen Locus bestimmen. Daher, bestehend aus robusten Hochdurchsatz-(HT) Methoden für die Profilerstellung einer Reihe von Histon Modifikation Marken sowie computergestützte Analysen Rohrleitungen in der Lage, Arbeitsabläufe Umgang mit Myriaden von ChIP-Seq profiling Datasets, sind notwendig für umfassende Ermittlung der epigenomischen Staaten in große Anzahl von Proben. Die HT-ChIP-Seq-Workflow, die hier vorgestellten besteht aus zwei Modulen: 1) ein experimentelles Protokoll für die Profilerstellung mehrere Histon-Modifikationen von geringen Mengen an tumorproben und Zell-Linien in einem 96-Well-Format; und 2) eine numerische Daten-Analyse-Pipeline, die vorhandenen Tools zur Berechnung der einzelnen Mark Belegung und kombinatorische Chromatin Zustand Muster kombiniert. Zusammen ermöglichen diese beiden Module einfache Verarbeitung von Hunderten von ChIP-Seq-Proben in eine schnelle und effiziente Weise. Die hier vorgestellten Workflow wird verwendet, um 6 Histon Mark Profile in Melanom Tumoren und Zelllinien Chromatin Zustand Muster abgeleitet. Insgesamt präsentieren wir Ihnen einen umfassende ChIP-Seq-Workflow, der die Dutzende von menschlichen tumorproben und Krebszelllinien festzustellen, epigenomischen Aberrationen in verschiedenen Tumoren angewendet werden kann.

Einleitung

Die Mehrheit der Säugetier-Genome (98-99 %) bestehen aus Nichtkodierende Sequenz, und diese Nocoding-Regionen enthalten regulatorische Elemente bekannt, bei der Kontrolle der Genexpression und Chromatin Organisation1,2teilzunehmen. In einer normalen Zelle ist die angegebene Assembly genomic DNA in verdichteten Chromatinstruktur entscheidend für die räumliche Organisation, Regulierung und präzises Timing von verschiedenen DNA-assoziierten Prozesse3,4,5. In eine Krebszelle führen jedoch Chromatin Modifikationen von aberranten epigenetischen Mechanismen zu unsachgemäßen Organisation von Chromatinstruktur, einschließlich des Zugangs zu regulatorischen Elemente, chromosomale Schleife Systeme und Gen Ausdruck Muster6, 7,8,9,10.

Trotz der jüngsten Fortschritte haben wir Verständnis für epigenetische Veränderungen beschränkt, die Tumorprogression oder therapeutische Reaktion zugeordnet sind. Das epigenom besteht aus einer Reihe von Änderungen, einschließlich Histon Marks und DNA-Methylierung, die bilden zusammen einen dynamischen Zustand (bezeichnet als Chromatin-Staat), der bei der Gen-Expression-Netzwerken und anderen Prozessen entscheidend für die Aufrechterhaltung der auftrifft zelluläre Identität. Vor kurzem wurden Änderungen in Enhancer in mehreren Malignome gezeigt, durch das Studium der H3K27Ac profile11. Obwohl solche Studien in die Korrelation von isolierten epigenetischen Markierungen Einblick, wurden mehr als 100 epigenetische Modifikationen identifizierten12,13 ohne klares Verständnis ihrer biologischen Rollen und Interdependenz. Darüber hinaus gibt es eine noch größere Anzahl von möglichen kombinatorische Muster dieser Histon und DNA-Veränderungen, und es ist diese kombinatorische Muster - keine individuelle Anpassungen -, die epigenetische Staaten14diktieren. Daher gibt es enormen Bedarf zur Identifikation von Veränderungen in diesen Staaten Chromatin während Tumorprogression oder Reaktionen auf die Therapie. Umfassende Kenntnisse der epigenom Änderungen bei Krebsarten hat teilweise aufgrund von technischen (z. B. Erzeugung von großen Datenmengen aus kleinen Menge an klinischen Material/einzelne Zellen) hinken und analytische (z.B. Algorithmen zu definieren Kombinatorische Staaten) Herausforderungen. Daher gibt es kritische Notwendigkeit für robuste Hochdurchsatz-Methoden für die Profilerstellung große Anzahl von Histon Modifikation Markierungen von klinischem Material und einfach zu implementierende rechnerische Ansätze, kombinatorische Muster vorherzusagen, die erleichtert Bestimmung der epigenetischen Staaten mit verschiedenen Stufen der Tumorgenese und therapeutischen Widerstand verbunden. Darüber hinaus verfügbaren Daten aus den letzten epigenom profiling Studien15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normalen Geweben und Zelllinien mit Chromatin Profile von Tumoren für weitere Einblicke in epigenom Beitrag zur Tumorbiologie integriert werden können.

Chromatin-profiling ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Ermittlung der global verbindliche Muster von verschiedenen Chromatin Änderungen15,24geworden. In den letzten Jahren ist die ChIP-Seq der "Goldstandard" für die Untersuchung von DNA-Protein Interaktionen auf einer globalen Skala25,26,27geworden. Für jeden ChIP-Seq-Experiment sind wichtige Schritte für seinen Erfolg, einschließlich Gewebe Verarbeitung und Dissoziation, bestimmen optimale Beschallung Bedingungen bestimmen optimale antikörperkonzentration für Niederschlag, Bibliothek Vorbereitung notwendig, nach Abschluss der Sequenzierung Datenverarbeitung und nachgelagerte Analyse. Jeder dieser Schritte enthalten wichtige Qualitätskontrolle Prüfpunkte und zusammengenommen sind ausschlaggebend für richtig identifizieren potenzielle Ziele für die funktionelle Validierung. Durch Innovation in den folgenden Schritten haben mehrere vorherige Studien Methoden zum Ausführen von ChIP oder ChIP-Seq aus kleine Menge an Gewebe28,29,30,31,32 entwickelt. . Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, Protokolle für Hochdurchsatz-ChIP Experimente gefolgt von PCR-basierte Quantifizierung33,34. Schließlich sind einige öffentlich zugängliche Analyse Plattformen für ChIP-Seq-Daten jetzt wie Easeq35 und Galaxy36zur Verfügung. Allerdings hat eine integrierte Plattform für die Durchführung von ChIP-Seq in eine Hochdurchsatz-Mode in Kombination mit einer rechnerischen Pipeline einzelne Markierung sowie Chromatin-Zustand-Analysen durchführen gefehlt.

Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen und umfassenden ChIP-Seq-Workflow für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten im Tumorgewebe und Zell-Linien, mit leicht Richtlinien umfasst alle die notwendigen Schritte für ein gelungenes Experiment. Durch die Annahme einer Hochdurchsatz-Methode zuvor von Blecher-Gonen Et Al. beschrieben 37, dieses Protokoll auf Dutzenden von Proben parallel durchgeführt werden kann und auf Krebszelllinien und menschlichen Tumoren wie Melanom, Dickdarm, Prostata und Glioblastoma Multiforme erfolgreich angewendet wurde. Wir zeigen die Methodik für die sechs Kern-Histon-Modifikationen, die Schlüsselkomponenten der epigenetischen regulatorischen Landschaft im menschlichen Melanom-Zelllinien und tumorproben darstellen. Diese Änderungen umfassen H3K27ac (Enhancer), H3K4me1 (aktive und Balanciert, Enhancer), H3K4me3 (Promotoren), H3K79me2 (transkribiert Regionen), H3K27me3 (Polycomb Repression) und H3K9me3 (heterochromatischen Repression). Diese Markierungen können entweder allein oder in Kombination verwendet werden, um funktionell unterschiedlichen Chromatin Staaten repräsentieren sowohl repressive als auch aktive Domains zu identifizieren.

Protokoll

Alle klinische Proben wurden nach den Richtlinien der Institutional Review Board erhalten.

1. Puffer Vorbereitung

  1. 200 mL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0) zu machen.
  2. 200 mL STE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) zu machen.
  3. 200 mL von 2,0 M Glycin (37,52 g Glycin in 200 mL Wasser) zu machen und auf 65 ° c erwärmen
  4. 200 mL 5 % Natrium-Deoxycholate (DOC)-Lösung (10 g DOC in 200 mL Wasser) zu machen.
  5. 500 mL ChIP Ernte Puffer (12 mM Tris-Cl, 0,1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 6 mM EDTA, 0,5 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS)) zu machen.
  6. 500 mL ChIP Verdünnungspuffer machen (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1 % DOC, 1 % Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. 500 mL Waschpuffer RIPA machen (STE, 1 % Triton x-100, 0,1 % SDS, 0,1 % DOC).
  8. 500 mL RIPA/500 Waschpuffer (RIPA Puffer + 360 mM NaCl) zu machen.
  9. 500 mL Waschpuffer LICI machen (TE, 250 mM LICI, 0,5 % NP-40, 0,5 % DOC).
  10. 500 mL von direkten Elution Buffer zu machen: 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5 % SDS.
  11. 50 mL der Antikörper-Bindung/Blocking-Puffer (PBS + 0,1 % TWEEN-20 + 0,2 % IgG-freie BSA) zu machen.

(2) Gewebe/Zelle Zeile Verarbeitung und Vernetzung

  1. Wenn Gewebe flash eingefroren ist, dethaw es auf dem Eis vor der Dissoziation.
  2. 50 mg des Gewebes (~ 8 mg pro Histon Modifikation Antikörper) manuell in 2 mL von Hanks' Balanced Salz Lösung (HBSS) mit einer sterilen Rasierklinge zu distanzieren. Hacken Sie das Gewebe in 3 bis 4 mm Stücke für ca. 5 min in ein steriles Gewebe Kulturschale.
  3. Übertragen Sie Gewebe und HBSS Lösung in ein Dissociator Rohr zu und eine weitere 8 mL HBSS. Weiter distanzieren Sie das Gewebe mit einem Dissociator bis homogenisiert.
  4. Für Melanom Tumoren, legen Sie die Rohre in einer Dissociator und führen Sie die folgenden Zyklen jeweils einmal in dieser Reihenfolge: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 und m_heart_02.01.
  5. Schaben 21 × 106 Zellen in 10 mL Medium (~ 3 × 106 pro Histon Änderungen und Eingang; auf 100.000 Zellen pro Mark für seltene Populationen absenkbar) gewachsen in einer standard Gewebekultur-Speise- und sammeln sie in einem 15 mL konische Röhrchen.
    Hinweis: Die Medien zur repräsentativen Melanom-Zell-Linie WM115 ist DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum und 5 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
  6. Crosslink die Gewebezellen mit einer 1 % final Formaldehyd-Konzentration durch Zugabe von 200 µL von 16 % Formaldehyd pro 3 mL HBBS für Gewebe (oder 3 mL Medium für Zellen). Schütteln Sie die Mischung 10 u/min mit einem Mixer genau 10 min bei 37 ° C.
    Achtung: Formaldehyd ist giftig und sollte in einem entsprechenden Abzug gehandhabt werden.
  7. Fügen Sie 200 µL 2,0 M Glycin pro 3 mL der Probe und weiter schütteln bei 10 u/min für weitere 5 Minuten bei 37 ° C.
    Hinweis: Glycin wirkt wie ein Durstlöscher. Stellen Sie frische Glycin-Lösung jeden Monat als der pH Pf neigt die Lösung im Laufe der Zeit.
  8. Drehen Sie die Proben bei 934 X g für 5 min bei 4 ° C mit einer Benchtop-Zentrifuge. Den überstand, 5 mL kaltem PBS Eis hinzugeben, die Proben wieder auf 934 X g zentrifugieren entfernen und überstand.
  9. Flash Einfrieren das Pellet und bei-80 ° C zur Weiterverarbeitung zu speichern.

(3) Gewebe Lyse, Beschallung und Antikörper-Vorbereitung

  1. 1 Protease-Inhibitor-Tablette pro 10 mL ChIP Ernte Puffer zu lösen.
  2. 300 µL des ChIP-Ernte-Puffer mit Proteaseinhibitoren pro 50 mg des Gewebes und 30 min von Lyse auf Eis.
    Hinweis: Fügen Sie 300 µL des ChIP-Ernte-Puffers mit Proteaseinhibitoren pro 1 X 107 WM115 Melanom-Zelllinien.
  3. Während die Zellen Lyse sind, schalten Sie die das Wasserbad Disruptor und zugehörigen Kühlsystem und lassen Sie die Temperatur um 4 ° c erreichen. Die sonikator Röhren in das Wasserbad Disruptor und beschallen die Melanom-Gewebe für 60 Zyklen bei 30 s ein und 30 s aus Chromatin Fragmente von ~ 200-600 Basenpaaren (bp) zu erhalten.
    Hinweis: Beschallungsdauer Gewebetyp unterscheiden kann und sollten entsprechend angepasst werden. Dies ist ein wichtiger Schritt und sollte im Pilotversuch bevor Sie fortfahren, Immunopräzipitation optimiert werden.
  4. Während der Beschallung waschen Sie 20 µL Protein G magnetische Beads pro Antikörper pro Probe dreimal mit 1000 µL Puffer Bindung/blockieren (PBS + 0,1 % TWEEN-20 + 0,2 % BSA).
  5. Inkubieren Sie für ~ 8 mg von Melanom-Gewebe 3 µg jedes Histon-Antikörper in 100 µL verbindlich / Puffer für 2 h bei 4 ° C mit Drehung mit einem Rohr-Revolver blockieren. 12 Proben für eine singuläre Antikörper enthalten 240 µL Perlen, 36 µg des Antikörpers und 1200 µL Puffer Bindung/blockieren.
    Hinweis: Verwenden Sie für 3 × 106 Zellen, 5 µg jedes Antikörpers und 30 µL Protein G magnetische Beads pro Antikörper. Antikörper und Protein-G Perlen sollten titriert werden, wenn unterschiedliche Menge an Gewebe verwendet wird. Dieses Protokoll zeigt Immunopräzipitation Bedingungen für die beschriebenen sechs Histon-Modifikationen (Table of Materials), Antikörper-Konzentrationen sollte jedoch für andere Modifikationen und Transkriptionsfaktoren optimiert werden.
  6. Fragmentgröße bestimmen, 20 µL Sonciated Chromatin Lösung zu entfernen und fügen Sie eine Elution Buffer master-Mix (Raumtemperatur) mit 44 µL direkte Elution buffer, 1 µL RNase (20mg/mL) und 5 µL Proteinase K (20mg/mL) pro Probe. Inkubieren Sie die Proben in einer PCR-Thermocycler für mindestens 2 h bei 50 ° c Reinigen Sie die Probe mit einem PCR-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  7. Sicherstellen Sie, dass Chromatin ausreichend durch die Bestimmung mit einem hochempfindlichen DNA Electropherogram Instrument, bevor Sie fortfahren mit Schritt 3.6 Fragmentgröße geschert wird. Schalten Sie das Electropherogram-Instrument.
  8. Laden Sie 2 µL hohe Empfindlichkeit Puffer Reagenz in jede Vertiefung von einem 8-Brunnen optischen Tubus-Strip. Die zunächst gut und 2 µL der gereinigten Proben in den verbleibenden Brunnen bestücken Sie 2 µL der hochempfindlichen Leiter.
  9. Optischen Tubus Kappen auf Röhre gewölbt und Wirbel die Proben bei 2000 u/min für 1 min. Öffnen den Deckel und schieben Sie einen neuen hochempfindlichen Bildschirm Band und Box laden Tipps. Entfernen Sie die Streifen-Kappen und laden Sie die Proben in Electropherogram Instrument.
  10. Öffnen Sie Analyse-Software zu, markieren Sie die ersten dreizehn Räumen auf dem Bildschirm-Band und drücken Sie auf die Registerkarte "Start" in der rechten unteren Ecke. Chromatin Fragmente zwischen ~ 200-1000 bp eignen sich für ChIP.
  11. Transfer der beschallten Lösung zum sterilen Röhrchen und Drehen der Rohre bei 21.130 x g mit einer Tischplatte Zentrifuge für 15 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den überstand auf neue Rohre.
  12. Das Gesamtvolumen des Überstands ermitteln und entfernen Sie 10 % der Gesamtlösung für Input-Regler und bei 4 ° c Lagern

4. Chromatin Immunopräzipitation

  1. 2 Protease Inhibitor Tabletten pro 20 mL ChIP Verdünnungspuffer auflösen.
  2. Nach Beschallung verdünnte Mal die restlichen Probe 5 mit ChIP Verdünnungspuffer, um die SDS-Ebenen bis zu 0,1 % zu bringen. Verdünnen Sie 270 µL verbleibende überstand mit 1080 µL ChIP Verdünnungspuffer, eine endgültige Gesamtvolumen von 1350 µL zu erhalten.
  3. Nach Beendigung der Inkubation von Antikörper und Proteine G magnetische Beads legen Sie das Rohr auf einen Magneten und entfernen Sie den überstand zu.
  4. Waschen Sie mit dem Rohr sitzt immer noch auf den Magneten die Perlen einmal durch Zugabe von 750 µL ChIP Verdünnungspuffer mit Protease-Inhibitoren.
    Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu stören die Perlen oder Drehen der Rohre während dieses Schritts.
  5. Entfernen Sie ChIP Verdünnungspuffer waschen und die Perlen in den gleichen ChIP Verdünnungspuffer 240 µL aufzuwirbeln. Aliquoten 20 µL Perlen in 12 separate Röhren, von denen jede für eine separate Gewebeprobe verwendet wird.
  6. Aliquot der beschallten Material gleichmäßig zu Protein G Perlen mit spezifischen Antikörper und Wäschetrockner mit einem Rohr-Revolver über Nacht bei 4 ° C.

5. Waschen und Reverse Vernetzung von Immunoprecipitated DNA-Protein-komplexe

  1. Am nächste Morgen nach rückwärts Vernetzung der Antikörper-Protein-Lösung auf einer 96-Well-Platte übertragen und legen Sie es auf die Magnetstativ. Ermöglichen die Perlen zu halten für mindestens 30 s und Entfernen der Überstand.
  2. Waschen Sie die Perlen 5 Mal mit 150 µL des eiskalten RIPA Waschpuffer mit einer Multi-Channel-pipettieren. Während der Wäsche Schritte tun nicht pipettieren der Perlen, aber bewegen Sie den Magneten kontinuierlich von rechts nach Links für 30 s pro Waschgang.
  3. Waschen Sie die Proben zweimal mit 150 µL des eiskalten RIPA-500 Waschpuffer.
  4. Waschen Sie die Proben zweimal mit 150 µL des eiskalten LICI Waschpuffer.
  5. Die Proben einmal mit 150 µL des eiskalten TE Waschpuffer waschen und TE-Puffer sofort entfernen. Dieser Schritt kann für niedrige input Anwendungen entfallen.
  6. Fügen Sie Input-Regler aus Schritt 3,7 in frischen Brunnen der 96-Well-Platte mit ChIP DNA-Proben.
  7. Nach der Waschschritte hinzufügen einen Elution Buffer master-Mix (Raumtemperatur) mit 44 µL direkte Elution Buffer, 1 µL RNase (20mg/mL) und 5 µL Proteinase K (20mg/mL) pro ChIP und Input Sample für umgekehrte Vernetzung.
  8. Inkubieren Sie die Proben unter Verwendung einer PCR-Thermocycler für 4 h bei 37 ° C, 4 h bei 50 ° C und 8-16 h bei 65 ° c

6. Reinigung und Quantifizierung der ausgefällte DNA

  1. Am nächsten Morgen, Ort zurück die Proben auf den Magneten und die Übertragung überstand auf eine neue 96-Well PCR Platte enthält die Immunoprecipitated DNA.
  2. Fügen Sie 2.3 x paramagnetischen Perlen Lösung (115 µL für 50 µL der Lösung) und vorsichtig nach oben und unten 25 Mal mit einem Mehrkanal-pipettieren pipettieren hinzu. Die Lösung wird homogen, wenn richtig gemischt werden.
  3. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur aus der Magnet für 4 min. Platz die Proben wieder auf den Magneten und Inkubation bei Raumtemperatur für eine weitere 4 min. überstand verwerfen.
  4. Wobei die Proben auf den Magneten hinzufügen 150 µL Ethanol 70 % (Vol/Vol) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 s ohne die Perlen zu stören.
  5. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Wäsche. Lassen Sie auf den Magneten für 5 min die paramagnetischen Perlen an der Luft trocknen.
    Hinweis: Entfernen Sie das Ethanol nach der zweiten Wäsche als Reinigung verbleibenden Ethanol stören wird.
  6. Entfernen Sie die Proben vom Magneten zu, und fügen Sie 30 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mischen von 25 Mal pipettieren und die Proben bei Raumtemperatur aus der Magnet für 4 min inkubieren.
  7. Setzen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine weitere 4 min. Transfer 20 µL jeder Probe auf eine neue 96-Well-Platte Bibliothek Vorbereitung. Die restlichen 10 µL DNA-ChIP bei möglichen Problemen mit Generation der Bibliotheken zu speichern.
  8. Quantifizieren Sie in diesem Stadium ChIP DNA vor der Bibliothek Vorbereitung. Die DNA-Konzentration wird mit hoher Empfindlichkeit DNA Reagenzien gemessen. Die Größenverteilung der ausgefällte DNA mit einem hochempfindlichen DNA Electropherogram Instrument Verfahren Schritt 7.1 zu bestimmen.

(7) Bibliothek-Generation mit dem NEBNext Ultra II DNA Bibliothek Vorbereitung Kit

  1. Bibliotheken für die NGS Sequenzierung mit DNA-Bibliothek Vorbereitung nach der empfohlenen Protokolls vom Hersteller zu generieren. Die Reaktionen sind in 96-Well-Platten und Inkubationen durchgeführt in einer PCR-Thermocycler mit Deckel eingestellte Temperatur > 100 ° C und die Lautstärke auf 50 µL eingestellt.
  2. Für Indizes Multiplex Oligos für NGS-Plattform verwendet. Insgesamt 10 X Zyklen für PCR-Amplifikation mit folgenden Einstellungen durchführen: erste Denaturierung bei 98 ° C für 30 s, Denaturierung bei 98 ° C für 10 s, Glühen/Verlängerung bei 65 ° C für 30 s (10 X Zyklen), letzte Erweiterung 65 ° C für 5 min und Halt bei 4° C.
    Hinweis: Tabelle 1 enthält die Primer für PCR Verstärkung verwendet.
  3. Entfernen Sie nach PCR Verstärkung die Proben und bringen Sie Gesamtvolumen zu 100 µL mit Nuklease-freies Wasser zu. Doppelseitige paramagnetischen Größenauswahl (0.55x/0.8x) vom ersten Hinzufügen von 55 µL Perlen führen und durch pipettieren 25 mal mischen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur aus der Magnet für 4 min.
  4. Setzen Sie die Proben wieder auf einen Magneten und bei Raumtemperatur für weitere 4 min inkubieren. Dieser Schritt wird verwendet, um große Fragmente auf die Perlen, die ungeeignet für die Sequenzierung zu behalten.
  5. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 96-Well-PCR-Platte. Verwerfen Sie überstand nicht, wie dies teilweise gereinigte DNA enthält.
  6. Ein weiterer 25 µL der paramagnetischen Beads und Mischen von pipettieren 25 Mal und bei Raumtemperatur aus der Magnet für 4 min inkubieren.
  7. Proben der Magnet wieder aufsetzen und Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 4 Minuten und überstand verwerfen. Dieser Schritt wird verwendet, um Fragmente von ~ 200 bis 600 behalten bp, die für verwendet wird finalisiert Bibliotheken.
  8. Wobei die Proben auf den Magneten 150 µL Ethanol 70 % (V/V) und Inkubation für 30 s ohne zu stören die Perlen (nicht bewegen, während auf den Magneten). Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal.
  9. Lassen Sie die paramagnetischen Perlen an der Luft trocken auf den Magneten für 5 min. alle Ethanol nach der zweiten Wäsche entfernen, als Reinigung verbleibenden Ethanol stören wird.
  10. Entfernen Sie die Proben vom Magneten zu, und fügen Sie 25 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mischen von 25 Mal pipettieren und inkubieren Sie bei Raumtemperatur aus der Magnet für 4 min. Platz die Proben wieder auf den Magneten und Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 4 Minuten.
  11. Bibliotheken mit einem hochempfindlichen DNA Electropherogram Instrument vor Multiplexen um sicherzustellen, dass Größen sind geeignet für die Sequenzierung zu quantifizieren. Fertige Bibliotheken im Bereich zwischen 200-600 bp und sind frei von allen Grundierung Dimere.
    Hinweis: Bei Bedarf eine weitere 0,7 x paramagnetischen Wulst Reinigung wird durchgeführt, um unerwünschte Grundierung Dimere zu entfernen bei ~ 130 bp.
  12. Die quantifizierte DNA anhand eindeutiger Index Primer je nach Konzentration zu bündeln. Für einen Pool mit sechs Proben mit Konzentrationen zwischen 1 ng/µL und 6ng/µL ist die Verteilung 15 µL der niedrigsten Probe und 2,5 µL der höchsten Probe. Dies geschieht, um lesen zu gewährleisten, die Grafen auf jeder Spur der Durchflusszelle gleichmäßig verteilt werden.

8. Post-ChIP-Seq-Datenverarbeitung

  1. Eine Pipeline basierend auf Snakemake38,39 wird verwendet, um alle der folgenden Schritte bei einem einzigen Befehl. Wichtig ist, jeden dieser Schritte werden individuell besprochen mit zugehörigen Befehle.
  2. Qualität des rohen Fastq Sequenzierung lautet mit FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) zu bestimmen: Unix terminal öffnen und ändern Verzeichnis (cd) in den Ordner mit den rohen Fastq-Dateien für jede der sechs Histon-Modifikationen. In der UNIX-terminal-Typ, Fastqc *fastq.gz und drücken Sie die [EINGABETASTE]. Dies läuft Qualitätskontrolle Metriken auf alle Fastq-Dateien im Ordner "".
  3. Richten Sie Qualität Lesezugriffe auf das Referenz-Genom und entfernen Sie Duplikate vor der Komprimierung auf Bam-Dateien. Dies erfolgt über Bowtie Version 1.1.239, SAMBLASTER Version 0.1.2140und SAMTOOLS Version 1.3.141: In der UNIX-terminal-Typ, Fliege -m 1 - n 1--beste--Schichten -S - Q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | Samblaster - RemoveDups | Samtools anzeigen -Sb - > histone1.bam und drücken Sie die [EINGABETASTE].
    Hinweis: Path_to zeigt den Ordner mit der hg19 menschlichen Genoms Assembly. Dies ändert sich abhängig von dem Organismus von Interesse.
  4. Bam-Dateien mithilfe von SAMTOOLS mit dem folgenden Befehl Sortieren: In der Unix-terminal-Typ sortieren Samtools histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  5. Bam-Dateien mithilfe von SAMTOOLS mit dem folgenden Befehl Index: In der Unix-terminal-Typ, Samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai index und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  6. Bestimmen eindeutig zugeordnet und nicht ausgerichtete liest SAMTOOLS Flagstat mit dem folgenden Befehl verwenden: In der UNIX-terminal-Typ, Samtools Flagstat histone1.sorted.bam und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  7. Normalisieren Sie Bam-Dateien pro lesen Sie zählt durch Stichproben mit dem folgenden Befehl ausführen: In der Unix-terminal-Typ Sambamba -f Bam anzeigen-subsampling-Samen = 3 -s-0.X-histone1.sorted.bam | Samtools sortieren -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  8. Index die Bam-Dateien wieder mit SAMTOOLS mit dem folgenden Befehl: In der Unix-terminal-Typ, Samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai index und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  9. ChIP-Seq-Bibliotheken auf einem Genom-Browser (zB. zu visualisieren UCSC oder IGV), erzeugen Bigwig Dateien mit DeepTools Version 2.4.040 durch die Skalierung der Bam-Dateien für Lesevorgänge pro Kilobase pro million (RPKM). Dies kann mit den folgenden Befehlen ausgeführt werden:
    1. Für standard Bigwig Dateien: In der UNIX-terminal-Typ, BamCoverage -b histone1. Downsample.sorted.BAM--NormalizeUsingRPKM--BinSize 30--SmoothLength 300 - ExtendReads 200 -o histone1.bw und drücken Sie {RETURN].
    2. Für die Eingabe subtrahiert Bigwig Dateien: In der UNIX-terminal-Typ, BamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--NormalizeUsingRPKM--Verhältnis subtrahieren--BinSize 30--SmoothLength 300 - ExtendReads 200 -o histone1.subtracted.BW und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  10. Identifizieren Sie ChIP-Seq Signal Bereicherung über "Input" Hintergrund mit Modellanalyse der ChIP-Seq (MACS) Version 1.4.225,26 und Version 2.1.0. Verwenden Sie macs1 für "Punktquelle" Faktoren H3K4me3, H3K4me1 und H3K27ac und macs2 für "Breite Quelle" Faktoren, H3K79me2, H3K27me3 und H3K9me3. Dies erfolgt über die folgenden Befehle:
    1. Für Punktquelle: In der UNIX-terminal-Typ, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - C input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--Nomodel--Keep-Dup alle - n histone1.file und drücken Sie die [EINGABETASTE].
    2. Für Breite Quelle: In der UNIX-terminal-Typ, macs2 Callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - C input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1E-6--breit - breit-Cutoff 1E-6--Keep-Dup alle--Nomodel - n histone1.file und drücken Sie die [EINGABETASTE].
  11. Verwendung ChromHMM24 kombinatorische Chromatin Zustand Muster zu erkennen anhand der Histon-Modifikationen studierte mit den folgenden Befehlen:
    1. Geben Sie in der Unix-Terminal ein, cd/Path_to/ChromHMM_folder, und drücken Sie die [EINGABETASTE].
    2. Einmal in das ChromHMM Verzeichnistyp Java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/Path_to/Bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/Path_to/BinarizeBam_output und drücken Sie die [EINGABETASTE].
    3. Typ, Java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/Path_to/BinarizeBam/Path_to/Output_directory 15 hg19 und drücken Sie die [EINGABETASTE].

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die Immunopräzipitation aus gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien, die auf Dutzenden von Proben parallel mit einer Hochdurchsatz-Methode (Abbildung 1A)ausgeführt werden können. Chromatin Fragmente sollte im Bereich zwischen ~ 200-1000 bps für optimale Immunopräzipitation. Wir haben festgestellt, dass der Zeitaufwand für die Schur die selbe zu erreichen für verschiedene Gewebe und Zelltypen unterscheidet si...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige und umfassende Hochdurchsatz-ChIP-Seq-Modul für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten in menschlichen Tumorgewebe und Zell-Linien. In jedem ChIP-Seq-Protokoll ist einer der wichtigsten Schritte Antikörperbesonderheit. Hier veranschaulicht diese Methode Immunopräzipitation Bedingungen für die beschriebenen sechs Histon Änderungen, von die alle sind ChIP-Klasse und wurden zuvor in unserer und anderer Labors42,44

Offenlegungen

Autoren erklären keine Konflikte.

Danksagungen

Wir danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF Kern am MDACC für Sequenzierung Unterstützung. Die in diesem Artikel beschriebene Arbeiten wurde unterstützt durch Zuschüsse von der NIH-Zuschuss (CA016672), SMF Kern und NCI vergibt (1K99CA160578 und R00CA160578) an K. R.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Referenzen

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