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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Abstract

Modificazioni istoniche costituiscono una componente importante dell'epigenoma e svolgono un ruolo importante regolamentazione nella determinazione dello stato trascrizionale di loci associati. Inoltre, la presenza di modifiche specifiche è stata utilizzata per determinare la posizione e l'identità non codificanti elementi funzionali come rinforzatori. Negli ultimi anni, immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è diventato un potente strumento nel determinare i profili di genoma di modificazioni istoniche individuali. Tuttavia, è diventato sempre più chiaro che i modelli combinatoriali delle modificazioni della cromatina, denominati Stati della cromatina, determinano l'identità e la natura del locus genomico associato. Pertanto, i flussi di lavoro costituito da metodologie di (HT) robusti ad alta produttività per l'analisi di un numero di segni di modifiche dell'istone, nonché condotte analisi computazionali capaci di gestire miriadi di ChIP-Seq profilatura DataSet, sono necessari per completa determinazione degli Stati di epigenomic in gran numero di campioni. Il HT-ChIP-Seq flusso di lavoro qui presentato è costituito da due moduli: 1) un protocollo sperimentale per la profilatura diverse modificazioni istoniche da piccole quantità di campioni tumorali e linee cellulari in un formato a 96 pozzetti; e 2) una pipeline di analisi computazionale dati che combina gli strumenti esistenti per calcolare sia marchio individuale occupazione e modelli di stato della cromatina combinatoria. Insieme, questi due moduli facilitano facile elaborazione di centinaia di campioni di ChIP-Seq in maniera veloce ed efficiente. Il flusso di lavoro qui presentato è utilizzato per derivare modelli di stato della cromatina da 6 profili di contrassegno dell'istone in linee cellulari e tumori del melanoma. Nel complesso, vi presentiamo un flusso di lavoro completo di ChIP-seq che possa essere applicato a decine di campioni tumorali umani e linee cellulari di cancro per determinare aberrazioni epigenomic in varie malignità.

Introduzione

La maggior parte del genoma di mammiferi (98-99%) è costituita di sequenza non codificante, e queste regioni nocoding contengono elementi regolatori noti per partecipare nel controllare l'espressione genica e della cromatina organizzazione1,2. In una cellula normale, l'assembly specifico del DNA genomico in struttura della cromatina compattato è critica per l'organizzazione spaziale, regolamento e tempi precisi di vari processi DNA-collegato3,4,5. In una cellula tumorale tuttavia, modificazioni della cromatina di meccanismi epigenetici aberranti possono portare alla errata organizzazione della struttura della cromatina, compreso l'accesso a elementi regolatori, sistemi di loop cromosomiche e gene expression patterns6, 7,8,9,10.

Nonostante i recenti progressi, abbiamo limitato comprensione delle alterazioni epigenetiche che sono associati con la progressione del tumore o risposta terapeutica. L'epigenoma è costituito da una matrice di modifiche, tra cui marchi dell'istone e metilazione del DNA, che collettivamente formano uno stato dinamico (denominato stato di cromatina) che incide su reti di espressione genica e altri processi critici per il mantenimento identità cellulare. Recentemente, le alterazioni in esaltatori sono state indicate in malignità multiple studiando H3K27Ac profili11. Sebbene tali studi consentono di comprendere la correlazione dei marchi epigenetici isolati, più di 100 modificazioni epigenetiche sono stati identificati12,13 senza chiara comprensione dei loro ruoli biologici e interdipendenza. Inoltre, ci sono un numero ancora maggiore di modelli possibili combinatoriale di questi istoni e modificazioni del DNA, e non questi modelli combinatoriali - modifiche non individuali - che dettano epigenetici stati14. Quindi, c'è urgente bisogno di identificare le alterazioni in questi stati di cromatina durante la progressione del cancro o le risposte alla terapia. Conoscenza completa dell'epigenoma alterazioni nei cancri ha stato in ritardo in parte a causa di tecniche (ad esempio la generazione di dati su larga scala da piccole quantità di cliniche materiale/singole cellule) e analitiche (ad es. algoritmi per definire sfide di combinatoria Stati). Di conseguenza, c'è esigenza critica di metodi robusti ad alta produttività per la profilatura di gran numero di segni di modifiche dell'istone da materiale clinico e facile da implementare approcci computazionali per predire i modelli combinatoriale che faciliterà determinazione degli Stati epigenetici associato a diversi stadi di tumorigenesis e resistenza terapeutica. Ulteriori, dati disponibili dal recente epigenome profilatura studi15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in tessuti normali e linee cellulari può essere integrata con i profili di cromatina dei tumori per ulteriori approfondimenti su epigenome contributo alla biologia del tumore.

Profilatura di cromatina è diventato un potente strumento per identificare i modelli di associazione globale di vari cromatina modifiche15,24. Negli ultimi anni, ChIP-seq è diventato il "gold standard" per lo studio delle interazioni DNA-proteina su una scala globale25,26,27. Per ogni esperimento ChIP-seq, ci sono passaggi critici necessari per il suo successo, tra cui la dissociazione e la lavorazione del tessuto, determinare condizioni ottimale sonicazione, determinare la concentrazione di anticorpi ottimale per precipitazione, preparazione di biblioteca, Post-sequenziamento di elaborazione dei dati e dell'analisi a valle. Ognuno di questi passaggi contengono i punti di controllo chiave di controllo di qualità e quando presi insieme, sono cruciale per l'identificazione di potenziali bersagli per validazione funzionale correttamente. Attraverso l'innovazione in questi passaggi, parecchi studi precedenti hanno sviluppato metodologie per eseguire ChIP o ChIP-Seq da piccole quantità di tessuti28,29,30,31,32 . Inoltre, alcuni studi hanno suggerito protocolli per esperimenti di ChIP di alto-rendimento seguiti da PCR basati quantificazione33,34. Infine, alcune piattaforme di analisi disponibili pubblicamente per ChIP-Seq dati sono ora disponibili come Easeq35 e36di Galaxy. Tuttavia, è mancata una piattaforma integrata per l'esecuzione di ChIP-Seq in una moda di alto-rendimento in combinazione con una pipeline di calcolo per eseguire singolo marchio, come pure analisi dello stato della cromatina.

Questo protocollo descrive un workflow di ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in tessuti tumorali e linee cellulari, con facile seguire le linee guida che comprende tutti i passaggi necessari per un esperimento riuscito. Adottando un metodo di alto-rendimento precedentemente descritto da Blecher-Gonen et al. 37, questo protocollo può essere eseguito su decine di campioni in parallelo ed è stato applicato con successo su linee cellulari del cancro e tumori umani quali il melanoma, colon, prostata e glioblastoma multiforme. Dimostriamo la metodologia per sei modifiche dell'istone di nucleo che rappresentano componenti chiave del panorama normativo epigenetico in linee cellulari di melanoma umano e campioni di tumore. Queste modifiche includono H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione) e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Questi segni utilizzabile da solo o in combinazione per identificare stati di cromatina funzionalmente distinte che rappresentano i domini sia repressivi e attivi.

Protocollo

Tutti i campioni clinici sono stati ottenuti seguendo le linee guida di Institutional Review Board.

1. preparazione buffer

  1. Fare 200 mL di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido pH 8.0).
  2. Fare 200 mL di buffer di STE (10 mM Tris-HCl, 10mm EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
  3. Fare 200 mL di 2.0 M glicina (37,52 g di glicina in 200 mL di acqua) e riscaldare fino a 65 ° C.
  4. Fare 200 mL di soluzione di 5% sodio desossicolato (DOC) (10 g di DOC in 200 mL di acqua).
  5. Fare 500 mL di buffer di ChIP raccolto (12 mM Tris-Cl, 0,1 x tampone fosfato salino (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% sodio dodecil solfato (SDS)).
  6. Fare 500 mL di tampone di diluizione dei ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0.1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Fare 500 mL di tampone di lavaggio RIPA (STE, 1% Triton x-100, 0.1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Fare 500 mL di tampone di lavaggio RIPA/500 (RIPA buffer + 360 mM NaCl).
  9. Fare 500 mL di tampone di lavaggio LiCL (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Fare 500 mL di tampone di eluizione diretta: 10 mM Tris-Cl a pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Portare a 50 mL di anticorpo associazione/Blocking buffer (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% privo di IgG BSA).

2. tessuti/cellule Line Processing e cross-linking

  1. Se il tessuto è flash congelati, si dethaw il ghiaccio prima della dissociazione.
  2. Dissociare 50 mg del tessuto (~ 8 mg / anticorpo modifiche dell'istone) manualmente in 2 mL di Hanks' bilanciato sale soluzione (HBSS) utilizzando una lama di rasoio sterile. Tritare il tessuto in pezzi di 3-4 mm per circa 5 min in un piatto di sterili per coltura.
  3. Trasferire la soluzione HBSS e tessuto in una provetta di dissociatore e aggiungere un altro 8 mL di HBSS. Ulteriori dissociare il tessuto utilizzando un dissociatore finché non omogeneizzato.
  4. Per i tumori del melanoma, posizionare i tubi in un dissociatore ed eseguire i seguenti cicli ciascuno una sola volta in questo ordine: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 e m_heart_02.01.
  5. Ruspe 21 × 106 cellule in 10 mL di terreno (~ 3 × 106 modifica dell'istone e ingresso; può essere abbassata a 100.000 cellule per marchio per popolazioni rare) in una coltura di tessuto standard piatto e raccoglierli in una provetta conica da 15 mL.
    Nota: Il supporto utilizzato per la linea cellulare di melanoma rappresentante WM115 è DMEM completati con 10% siero bovino fetale e 5% penicillina/streptomicina.
  6. Crosslink del tessuto/cellule usando una concentrazione di 1% di formaldeide finale con l'aggiunta di 200 µ l di formaldeide del 16% per 3 mL HBBS per tessuto (o 3 mL di terreno per le cellule). Agitare la miscela a 10 giri utilizzando un mixer per esattamente 10 min a 37 ° C.
    Attenzione: Formaldeide è tossica e deve essere gestita in un'appropriata cappa.
  7. Aggiungere 200 µ l di 2.0 M glicina per 3 mL di campione e continuare ad agitare a 10 giri per un altro 5 min a 37 ° C.
    Nota: Glicina agisce come un quencher. Fanno fresco glicina soluzione ogni mese come il pf di pH che la soluzione tende nel tempo.
  8. Girare i campioni a 934 x g per 5 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da banco. Eliminare il surnatante, aggiungere 5 mL di PBS freddo ghiaccio, centrifugare i campioni nuovamente a 934 x g e rimuovere il surnatante.
  9. Flash il pellet di congelare e conservare a-80 ° C per un'ulteriore elaborazione.

3. tessuto Lisi, sonicazione e preparazione di anticorpo

  1. Sciogliere 1 compressa di inibitore della proteasi per 10 mL di buffer di raccolto di ChIP.
  2. Aggiungere 300 µ l di tampone di raccolta di ChIP con inibitori della proteasi per 50 mg di tessuto e 30 min di lisi su ghiaccio.
    Nota: Aggiungere 300 µ l di tampone di raccolta ChIP con inibitori delle proteasi a 1 X 107 di linee cellulari di melanoma WM115.
  3. Mentre le cellule sono Lisi, accendere l'il bagnomaria disruptor e relativo sistema di raffreddamento e consentire temperatura di 4 ° c. Posizionare i tubi sonicatore in bagnomaria disruptor e Sonicare i tessuti del melanoma per 60 cicli a 30 s s on e 30 off per ottenere frammenti di cromatina di ~ 200-600 paia di basi (bp).
    Nota: Tempo di sonicazione può differire tra tipo di tessuto e deve essere regolata di conseguenza. Questo è un passaggio fondamentale e dovrebbe essere ottimizzato in esperimento pilota prima di procedere all'immunoprecipitazione.
  4. Durante la sonicazione, lavare 20 µ l di biglie magnetiche di proteina G a anticorpo per campione tre volte utilizzando 1000 µ l di tampone di associazione/blocco (PBS + 0,1% di TWEEN-20 + 0.2% BSA).
  5. ~ 8 mg di tessuto del melanoma, Incubare 3 µ g di ogni anticorpo istone in 100 µ l di binding / blocking buffer per 2 ore a 4 ° C con rotazione utilizzando un revolver di tubo. 12 campioni per un anticorpo singolare contengono 240 µ l di perline, 36 µ g di anticorpo e 1200 µ l di tampone di associazione/blocco.
    Nota: Per 3 × 106 celle, utilizzare 5 µ g di ogni anticorpo e 30 µ l di biglie magnetiche G di proteine per l'anticorpo. Dell'anticorpo e della proteina-G perle dovrebbero essere titolati se viene utilizzato diverse quantità di tessuto. Questo protocollo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per il descritto sei modifiche dell'istone (Tabella materiali), tuttavia, le concentrazioni nell'anticorpo deve essere ottimizzati per altre modifiche e fattori di trascrizione.
  6. Per determinare la dimensione del frammento, rimuovere 20 µ l di soluzione di sonciated della cromatina e aggiungere un tampone di eluizione del buffer mix master (temperatura ambiente) contenente 44 µ l di eluizione diretta, 1 µ l di RNAsi (20mg/mL) e 5 µ l di proteinasi K (20mg/mL) per campione. Incubare i campioni in un termociclatore PCR per almeno 2 ore a 50 ° C. Purificare il campione utilizzando un kit di purificazione di PCR seguendo le istruzioni del produttore.
  7. Garantire la cromatina è sufficientemente tosata determinando la dimensione del frammento utilizzando uno strumento di elettroferogramma di DNA ad alta sensibilità prima di procedere al punto 3.6. Accendere lo strumento di elettroferogramma.
  8. Caricare 2 µ l di reagente tampone ad alta sensibilità in ciascun pozzetto di una striscia di tubo ottico 8 pozzetti. Caricare 2 µ l di alta sensibilità ladder nel primo bene e 2 µ l di campioni purificati in pozzetti rimanenti.
  9. Tappi tubo ottico su tubo stips e vortice i campioni a 2000 rpm per 1 min. Aprire il coperchio e inserire un nuovo nastro di schermo ad alta sensibilità e la scatola di punte di carico. Rimuovere i tappi di striscia e caricare i campioni in strumento di elettroferogramma.
  10. Aprire il software di analisi, evidenziare i primi tredici spazi sul nastro schermo e premere la linguetta di Start in basso a destra. Frammenti di cromatina che variano tra ~ 200-1000 bp sono adatti per il ChIP.
  11. Trasferire la soluzione lisati mediante in provette sterili e girare i tubi a 21.130 x g usando una centrifuga di piano d'appoggio per 15 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in nuove provette.
  12. Determinare il volume complessivo del surnatante e rimuovere il 10% della soluzione totale per il controllo di Input e conservare a 4 ° C.

4. immunoprecipitazione della cromatina

  1. Sciogliere 2 compresse di inibitore della proteasi per 20 mL di tampone di diluizione dei ChIP.
  2. Dopo sonicazione diluire il campione rimanente 5 volte con tampone di diluizione dei ChIP per portare i livelli di SDS fino a 0,1%. Diluire 270 µ l del surnatante rimanenti con 1080 µ l di tampone di diluizione dei ChIP per ottenere un volume finale totale di 1350 µ l.
  3. Al termine l'incubazione dell'anticorpo e della proteina G perle magnetiche, posizionare il tubo su un magnete e rimuovere il surnatante.
  4. Con il tubo ancora seduto sul magnete, lavare le perle di una volta con l'aggiunta di 750 µ l di tampone di diluizione di ChIP con inibitori delle proteasi.
    Nota: È importante non disturbare i branelli o ruotare i tubi durante questo passaggio.
  5. Rimuovere il ChIP tampone di diluizione lavare e risospendere le sfere in 240 µ l del tampone di diluizione ChIP stesso. Aliquota 20 µ l di perline in 12 tubi separati, ciascuno dei quali è utilizzato per un campione di tessuto separato.
  6. Aliquota del lisati mediante materiale uniformemente ai branelli di proteine G con anticorpo specifico e asciugatrice usando un revolver del tubo durante la notte a 4 ° C.

5. lavaggio e inversa reticolazione dei complessi della DNA-proteina di Immunoprecipitated

  1. La mattina successiva dopo reticolazione inversa, trasferire la soluzione di anticorpo-proteina in una piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul supporto magnetico. Consentire le perline di aderire per almeno 30 s e rimuovere il surnatante.
  2. Lavare le perle 5 volte con 150 µ l di tampone di lavaggio RIPA ghiacciato usando una pipetta multicanale. Durante le fasi di lavaggio, non pipettare le perline, ma spostare il magnete continuamente da destra a sinistra per 30 s a lavaggio.
  3. Lavare i campioni due volte con 150 µ l di tampone di lavaggio di RIPA-500 ghiacciato.
  4. Lavare i campioni due volte con 150 µ l di tampone di lavaggio LiCl ghiacciato.
  5. Lavare i campioni una volta con 150 µ l di tampone di lavaggio TE ghiacciato e rimuovere immediatamente il buffer di TE. Questo passaggio può essere omesso per applicazioni a bassa inpue.
  6. Aggiungere il controllo di Input dal passaggio 3,7 in freschi pozzetti della piastra 96 pozzetti contenenti i campioni di DNA ChIP.
  7. Dopo i passaggi di lavaggio, aggiungere un mix master buffer eluizione (temperatura ambiente) contenente 44 µ l di tampone di eluizione diretta, 1 µ l di RNAsi (20mg/mL) e 5 µ l di proteinasi K (20mg/mL) per campione di ChIP e Input per reticolazione inversa.
  8. Incubare i campioni utilizzando un termociclatore PCR per 4 h a 37 ° C, 4 h a 50 ° C e 8-16 h a 65 ° C.

6. purificazione e quantificazione del DNA precipitato

  1. La mattina successiva, posto i campioni indietro sul magnete e il surnatante di trasferimento ad una nuova piastra PCR a 96 pozzetti che contiene il DNA immunoprecipitato.
  2. Aggiungere 2.3 x perline paramagnetici soluzione (115 µ l 50 µ l di soluzione) e attentamente dispensare su e giù per 25 volte usando una pipetta multicanale. La soluzione diventerà omogenea se mescolato correttamente.
  3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente fuori il magnete per un minimo di 4 posto i campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min scartare il surnatante.
  4. Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% (vol/vol) e incubare a temperatura ambiente per 30 s senza disturbare le perline.
  5. Rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio. Lasciare asciugare le perline paramagnetiche per aria sul magnete per 5 min.
    Nota: Rimuovere tutti l'etanolo dopo il secondo lavaggio in etanolo rimanente interferirà con la purificazione.
  6. Rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 30 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare i campioni a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
  7. Riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min di trasferimento di 20 µ l di ogni campione una nuova piastra 96 pozzetti per la preparazione di biblioteca. Conservare il restante 10 µ l di DNA ChIP in caso di eventuali problemi con generazione delle librerie.
  8. In questa fase, è necessario quantificare ChIP DNA prima della preparazione di biblioteca. La concentrazione di DNA viene misurata con i reagenti di DNA ad alta sensibilità. Determinare la distribuzione delle dimensioni del precipitato DNA mediante un procedimento di strumento ad alta sensibilità del DNA elettroferogramma al punto 7.1.

7. Biblioteca generazione utilizzando il Kit di preparazione NEBNext libreria di DNA II Ultra

  1. Generazione di librerie per il sequenziamento NGS utilizzando DNA libreria preparazione seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Tutte le reazioni avvengono in piastre da 96 pozzetti e le incubazioni vengono eseguite in un termociclatore PCR con il set di temperatura coperchio > 100 ° C e il volume impostato a 50 µ l.
  2. Per gli indici, vengono utilizzati i Oligos Multiplex per piattaforma NGS. Eseguire un totale di 10 cicli di x per l'amplificazione di PCR utilizzando le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s, denaturazione a 98 ° C per 10 s, ricottura/estensione a 65 ° C per 30 s (10 x cicli), estensione finale 65 ° C per 5 min e permanenza a 4° C.
    Nota: La tabella 1 contiene i primers utilizzati per l'amplificazione di PCR.
  3. Dopo l'amplificazione di PCR, rimuovere i campioni e portare il volume totale a 100 µ l utilizzando acqua priva di nucleasi. Selezione dimensione paramagnetico bifacciale (0.55x/0.8x) per eseguire primo 55 µ l aggiunta di perline e Miscelare pipettando 25 volte. Incubare i campioni a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
  4. Posizionare i campioni indietro su un magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min. Questo passaggio è utilizzato per mantenere grandi frammenti sulle perle che non sono adatti per il sequenziamento.
  5. Trasferire il surnatante in una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Non gettare il surnatante come questo contiene DNA parzialmente purificato.
  6. Aggiungere un altro 25 µ l di perline paramagnetici e Miscelare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
  7. I campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min e scartare il surnatante. Questo passaggio consente di conservare frammenti di ~ 200 a 600 finalizzato bp che verrà utilizzato per le librerie.
  8. Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% (v/v) e lasciare Incubare per 30 s senza disturbare le perle (non si muovono mentre sul magnete). Rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio una seconda volta.
  9. Consentire che le perline paramagnetiche per aria secca sul magnete per 5 min, eliminare l'etanolo tutti dopo il secondo lavaggio come etanolo rimanente interferirà con la purificazione.
  10. Rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 25 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente fuori il magnete per un minimo di 4 posto i campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min.
  11. Quantificare le librerie utilizzando uno strumento di elettroferogramma di DNA ad alta sensibilità prima multiplexing per garantire dimensioni sono adatti per il sequenziamento. Completate le librerie variano fra 200-600 bp e sono privi di tutti i dimeri dell'iniettore.
    Nota: Se necessario, un altro 0,7 x purificazione perlina paramagnetico viene eseguito per rimuovere indesiderati dimeri presenti a ~ 130 bp.
  12. Piscina il DNA quantificato basato su primer indice univoco secondo la concentrazione. Per una piscina contenente sei campioni con concentrazioni tra 1 ng / µ l e 6ng / µ l, la distribuzione è 15 µ l del campione più basso e 2,5 µ l del campione più alto. Questo viene fatto per garantire la lettura conteggi verranno distribuiti uniformemente su ogni corsia di cella di flusso.

8. elaborazione dati ChIP-seq

  1. Una pipeline sulla base di38, snakemake39 viene utilizzata per processo di tutti i seguenti passaggi in un unico comando. Cosa importante, ognuno di questi passaggi sono discussi singolarmente con comandi associati.
  2. Determinare la qualità di fastq crudo sequenziamento letture utilizzando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): aprire terminale unix e cambiare directory (cd) nella cartella contenente i file fastq crudo per ognuna delle sei modifiche dell'istone. Il tipo di terminale unix, fastqc *fastq.gz e premere [Invio]. Questo verrà eseguito il controllo qualità metriche su tutti i file fastq nella cartella.
  3. Allineare le letture di qualità per il genoma di riferimento e rimuovere i duplicati prima della compressione per i file bam. Questa operazione è eseguita utilizzando bowtie versione 1.1.239, SAMBLASTER versione 0.1.2140e SAMTOOLS versione 1.3.141: In unix tipo di terminale, bowtie -m 1 - n 1--migliori - strata -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | Vedi samtools -Sb - > histone1.bam e premete [Invio].
    Nota: path_to indica la cartella contenente l'assembly di genoma umano hg19. Questo cambierà a seconda del microrganismo di interesse.
  4. Ordinare i file bam utilizzando SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools ordinare histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted e premete [Invio].
  5. Indicizzare i file bam utilizzando SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai di indice e premete [Invio].
  6. Determinare in modo univoco mappate e non allineate letture utilizzando SAMTOOLS flagstat con il seguente comando: il tipo di terminale unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam e premere [Invio].
  7. Normalizzare file bam per lettura conta eseguendo il campionamento casuale con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, sambamba Mostra -f bam-sottocampionamento-seme = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools ordinare -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam e premete [Invio].
  8. Indicizzare i file bam utilizzando nuovamente SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai di indice e premete [Invio].
  9. Per visualizzare le librerie di ChIP-seq su un browser del genoma (cioè. UCSC o IGV), generare i file Parruccone utilizzando deepTools versione 2.4.040 ridimensionando i file bam per letture al kilobase per milione (RPKM). Questa operazione può essere eseguita utilizzando i seguenti comandi:
    1. Per i file standard Parruccone: nel tipo di terminale unix, bamCoverage -b histone1. Downsample.Sorted.BAM - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw e premere {RETURN].
    2. Per ingresso sottratto file Parruccone: nel tipo di terminale unix, bamCompare - bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam - bamfile2 input1.downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - rapporto sottrarre - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW e premete [Invio].
  10. Identificare arricchimento segnale ChIP-seq sopra priorità bassa di "Input" usando l'analisi del modello basata del ChIP-seq (MACS) versione 1.4.225,26 e versione 2.1.0. Utilizzare macs1 per i fattori di "punto sorgente" H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac e macs2 per i fattori di "vasta sorgente" H3K79me2, H3K27me3 e H3K9me3. Questa operazione è eseguita utilizzando i seguenti comandi:
    1. Per punto di origine: Nel tipo di terminale unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 - nomodel - tenere-dup tutti - n histone1.file e premete [Invio].
    2. Per vasta sorgente: Nel tipo di terminale unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6-- vasto - broad-cutoff 1e-6--tenere-dup tutte le histone1.file - n - nomodel e premete [Invio].
  11. Uso ChromHMM24 per identificare i modelli di stato della cromatina combinatoria basato sulle modificazioni istoniche studiate utilizzando i seguenti comandi:
    1. Nel terminale unix digitare cd/path_to/ChromHMM_folder e premete [Invio].
    2. Una volta nel tipo di directory ChromHMM, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output e premete [Invio].
    3. Tipo, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 e premete [Invio].

Risultati

Questo protocollo permette l'immunoprecipitazione da tessuti tumorali congelati e linee cellulari che possono essere eseguite su decine di campioni in parallelo utilizzando un metodo di alto-rendimento (Figura 1A). Frammenti di cromatina deve essere compreso tra ~ 200-1000 bps per immunoprecipitazione ottimale. Abbiamo notato che il tempo necessario per raggiungere la stessa lunghezza di taglio differisce per diversi tessuti e tipi di cellule...

Discussione

Questo protocollo descrive un modulo di ChIP-seq di alto-rendimento completo ed esaustivo per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in linee cellulari e tessuti del tumore umano. In qualsiasi protocollo di ChIP-seq, uno dei passi più importanti è la specificità dell'anticorpo. Qui, questo metodo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per le modifiche dell'istone sei descritta, i quali sono ChIP-grado e sono stati già convalidati nel nostro ed altri laboratori42,

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti.

Riconoscimenti

Ringraziamo Marcus Coyle, Curtis Gumbs, core SMF a MDACC per il supporto di sequenziamento. Il lavoro descritto in questo articolo è stato sostenuto da sovvenzioni dalla concessione NIH (CA016672) al nucleo di SMF e NCI awards (1K99CA160578 e R00CA160578) a K. R.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Riferimenti

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

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