Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.

Abstract

היסטון השינויים מהווים מרכיב עיקרי של epigenome, תפקיד רגולטורי חשוב בקביעת מצב תעתיק לוקוסים המשויך. בנוסף, הנוכחות של שינויים ספציפיים שימש כדי לקבוע את המיקום ואת זהות ללא קידוד פונקציונלי רכיבים כגון מוצרי טיפוח טבעיים. בשנים האחרונות, immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף הדור הבא (צ'יפ-seq) הפך להיות כלי רב עוצמה בקביעת הפרופילים ברמת הגנום של שינויים היסטון בודדים. עם זאת, הוא הפך יותר ויותר ברור כי דפוסי קומבינטורית שינויים כרומטין, המכונה כרומטין הברית, לקבוע את הזהות ואת אופי מיקומה גנומית המשויך. לכן, זרימות עבודה המורכב חזקים מתודולוגיות (HT) תפוקה גבוהה עבור פרופיל מספר סימני שינוי היסטון, כמו גם ניתוחים חישובית צינורות מסוגל לטפל רבבות שבב-Seq פרופיל datasets, יש צורך נחישות מקיף של מדינות epigenomic במספר גדול של דוגמאות. זרימת העבודה HT-צ'יפ-Seq המובאת כאן כוללת שני מודולים: 1) טיפול נסיוני פרופיל מספר שינויים היסטון של כמויות קטנות של הגידול ודוגמאות שורות תאים בתבנית 96-ובכן; ו- 2) צינור ניתוח נתונים חישובית משלב בין הכלים הקיימים לחישוב התפוסה מארק בודדים והן כרומטין קומבינטורית המדינה דפוסים. יחד, אלה שני מודולים להקל קל לעיבוד של מאות דוגמאות שבב-Seq בצורה מהירה ויעילה. זרימת העבודה המוצגת כאן משמש שואבים כרומטין המדינה דפוסי פרופילי מארק היסטון 6 גידולים מלנומה, שורות תאים. בסך הכל, אנו מציגים מקיף שבב-seq שזרימת עבודה שניתן להחיל על עשרות שורות תאים סרטן כדי לקבוע סטיות epigenomic של גידולים ממאירים שונים ודוגמאות גידול אנושי.

Introduction

הרוב המכריע של הגנום יונקים (98-99%) המורכב מעובדים noncoding רצף, אזורים אלה nocoding להכיל רגולציה מרכיבים הידועים להשתתף בשליטה על ביטוי גנים וכרומטין הארגון1,2. בתא רגיל, הרכבה ספציפיים של דנ א גנומי לתוך הכרומטין הדחוס הוא קריטי עבור הארגון המרחבי, רגולציה תזמון מדויק של תהליכים הקשורים דנ א שונים3,4,5. בתא סרטן אולם כרומטין שינויים על ידי מנגנוני epigenetic סוטה יכול להוביל ארגון לקוי של הכרומטין, כולל גישה אלמנטים רגולטוריות, מערכות לולאה כרומוזומלית, דפוסי ביטוי גנים6, 7,8,9,10.

למרות ההתקדמות, מוגבלים הבנה של שינויים epigenetic המקושרים עם התקדמות הגידול או תגובה טיפולית. Epigenome מורכב מערך של שינויים, כולל סימני היסטון מתילציה DNA, אשר יחדיו יוצרים מדינה דינמי (המכונה כרומטין המדינה) או"עובדות ג'ין ביטוי רשתות ותהליכים אחרים קריטיים לשמירה הזהות הסלולר. לאחרונה, כבר הראו שינויים משפרי ב ממאירות מרובים על ידי לימוד פרופילים H3K27Ac11. למרות מחקרים כאלה לספק תובנה המתאם של סימני epigenetic מבודד, יותר מ-100 שינויים epigenetic היה מזוהה12,13 ללא הבנה ברורה של התפקידים הביולוגיים שלהם, תלות הדדית. יתר על כן, יש מספר גדול עוד יותר דפוסי קומבינטורית אפשרי היסטון ובשינויי הדנ א הללו, וזה דפוסי קומבינטורית - שינויים לא בודדים - אלה המכתיבים הברית epigenetic14. לפיכך, יש צורך אדיר כדי לזהות שינויים במדינות אלה כרומטין במהלך התקדמות סרטן או תגובות על טיפול. מידע מקיף על epigenome שינויים ב סרטן יש כבר משתרך בחלקו בשל טכני (למשל הדור של נתונים בקנה מידה גדול כמות קטנה של תאים בודד חומר קליני) אנליטיים (למשל אלגוריתמים כדי להגדיר אתגרים קומבינטורית הברית). לכן, יש צורך קריטי עבור שיטות יציבות תפוקה גבוהה עבור פרופיל מספר גדול של סימני שינוי היסטון חומר קליני, קל ליישם שיטות חישוביות לצורך לחזות דפוסי קומבינטורית אשר יקל הנחישות של הברית epigenetic הקשורים עם שלבים שונים של tumorigenesis והתנגדות טיפולית. נתונים נוספים, מהשעה האחרונה epigenome פרופיל מחקרים15,16,17,18,19,20,21, 22,23 רקמות רגילה, שורות תאים ניתן לשלב עם כרומטין פרופילים של גידולים עבור עוד תובנות epigenome תרומתו הגידול ביולוגיה.

כרומטין פרופיל הפך להיות כלי רב עוצמה לזיהוי דפוסי האיגוד העולמי שונים כרומטין שינויים15,24. בשנים האחרונות הפך שבב-seq "תקן הזהב" ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א26,25,מידה עולמי27. עבור כל ניסוי שבב-seq, ישנם שלבים קריטיים הכרחי להצלחה שלו, לרבות עיבוד רקמה של השיוך, קובע תנאים sonication אופטימלית, קובע ריכוז נוגדן אופטימלית עבור משקעים, ספריית הכנה, רצף שלאחר עיבוד נתונים, וניתוח במורד הזרם. כל הצעדים האלה מכילים מחסומים מרכזיים בקרת איכות, כאשר נלקח יחד מכריעים לזיהוי מטרות אפשריות עבור אימות פונקציונלי כראוי. באמצעות חדשנות בשלבים אלה, מספר מחקרים קודמים פיתחו שיטות לביצוע צ'יפ או שבב-Seq מתוך כמות קטנה של רקמות28,29,30,31,32 . יתר על כן, מספר מחקרים הציעו פרוטוקולים לניסויים שבב תפוקה גבוהה, ואחריו PCR המבוסס על כימות33,34. לבסוף, בחלק מהפלטפורמות ניתוח בפומבי זמינים עבור שבב-Seq נתונים זמינים כעת Easeq35 ו גלקסי36. עם זאת, יש שהיה חסר פלטפורמה משולבת לביצוע שבב-Seq אופנה תפוקה גבוהה בשילוב עם צינור חישובית לבצע מארק יחיד, כמו גם ניתוחים המדינה כרומטין.

פרוטוקול זה מתאר מלא ומקיף, צ'יפ-seq זרימת עבודה למיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית גידול רקמות, שורות תאים, עם קל לעקוב אחר הנחיות המקיף את כל השלבים הדרושים עבור ניסוי יירוט מוצלח. על ידי אימוץ שיטת תפוקה גבוהה שתואר קודם לכן על ידי בלכר-גונן. et al. 37, פרוטוקול זה יכול להתבצע על עשרות דוגמאות במקביל, הוחל בהצלחה על שורות תאים סרטן וגידולים אנושיים כגון מלנומה, המעי הגס, הערמונית, glioblastoma חוזרות. נדגים את המתודולוגיה במשך ששה שינויים היסטון הליבה המייצגים רכיבי מפתח של הנוף רגולטוריות epigenetic שורות תאים מלנומה אנושית ודוגמאות הגידול. שינויים אלה כוללים H3K27ac (משפרי), H3K4me1 (משפרי פעיל ולאחר מקסימה), H3K4me3 (היזמים), H3K79me2 (עיבד אזורים), H3K27me3 (דיכוי polycomb), ו- H3K9me3 (דיכוי heterochromatic). סימנים אלה יכול לשמש לבד או בשילוב לזהות מצבי כרומטין פונקציונלית נפרדים המייצגים תחומי הדיכוי והן פעיל.

Protocol

כל דגימות קליניות התקבלו לבצע את ההנחיות של ועדה מוסדית.

1. מאגר הכנה

  1. להפוך 200 מ ל TE מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0).
  2. להפוך 200 מ ל מאגר סטי (10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ EDTA pH 8.0, 140 מ מ NaCl).
  3. 200 מ של 2.0 מ' גליצין (37.52 גרם של גליצין ב 200 מ ל מים) ואני אחמם את זה עד 65 ° C.
  4. להפוך 200 מ של 5% נתרן deoxycholate (DOC) פתרון (10 גרם של דוק ב 200 מ של מים).
  5. להפוך 500 מ"ל של שבב הקציר מאגר (12 מ מ טריס-קלרנית, 0.1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 6 מ מ EDTA, 0.5% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות)).
  6. להפוך 500 מ"ל של שבב דילול מאגר (10 מ"מ טריס-קלרנית, 140 מ"מ NaCl, 0.1% דוק, 1% טריטון-X, 1 מ"מ EDTA).
  7. להפוך 500 מ"ל מאגר שטיפת ריפה (סטי, 1% טריטון x-100, 0.1% מרחביות, 0.1% דוק).
  8. להפוך 500 מ"ל של מאגר שטיפת ריפה/500 (מאגר ריפה + 360 ממ NaCl).
  9. להפוך 500 מ"ל LiCL שטיפת מאגר (טה, 250 מ מ LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% דוק).
  10. להפוך 500 מ"ל • תנאי ישיר המאגר: 10 מ מ טריס-Cl pH 8.0, 5 מ מ EDTA, 300 מ"מ NaCl, 0.5% מרחביות.
  11. להפוך 50 מ של הנוגדן מחייב/חסימת מאגר (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0.2% ללא IgG BSA).

2. רקמת תא קו עיבוד ו- cross-linking

  1. אם הרקמה הוא פלאש קפוא, dethaw זה על הקרח לפני דיסוציאציה.
  2. בטל שיוך 50 מ"ג של רקמות (~ 8 מ ג לכל נוגדן שינוי היסטון) באופן ידני ב- 2 מ"ל של מאוזנת מלח פתרון (HBSS הנקס) באמצעות תער סטרילי. מינצ הרקמה לחתיכות 3-4 מ מ כ 5 דקות בקערה תרביות רקמה סטרילי.
  3. העברת רקמות ופתרון HBSS לתוך צינור dissociator ולהוסיף עוד 8 מ ל HBSS. בהמשך לבטל שיוך של הרקמה באמצעות dissociator ובודקים.
  4. עבור גידולים מלנומה, למקם את הצינורות dissociator ולהפעיל את הבאות מחזורים כל פעם אחת בצו זה: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 ו- m_heart_02.01.
  5. מגרדים 21 × 106 תאים 10 מ"ל של מדיום (~ 3 × 106 לכל שינוי היסטון קלט; זה ניתן להוריד לתאים 100,000 לכל מארק לאוכלוסיות נדיר) גדלו בתרבות רקמה רגילה צלחת ולאסוף אותם צינור חרוטי 15 מ"ל.
    הערה: המדיה המשמש עבור שורת התאים מלנומה נציג WM115 היא DMEM בתוספת 10% סרום שור בעובר ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין.
  6. Crosslink התאים/הרקמות באמצעות ריכוז 1% פורמלדהיד סופית על-ידי הוספת µL 200 של 16% פורמלדהיד לכל 3 מ"ל HBBS רקמות (או 3 מ"ל של מדיום עבור תאים). לנער את התערובת על סל"ד 10 בעזרת מערבל בדיוק 10 דקות ב 37 º C.
    התראה: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume המתאים.
  7. להוסיף 200 µL של 2.0 מ' גליצין לכל 3 מ של דגימה ולהמשיך רועד ב rpm 10 למשך עוד 5 דקות ב 37 º C.
    הערה: גליצין משמש כ'חטיף. להפוך פתרון גליצין טריים בכל חודש כמו pf pH שהפתרון נוטה לאורך זמן.
  8. לסובב את הדגימות-g 934 x עבור 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה benchtop. הסר את תגובת שיקוע, הוסף 5 מ של PBS קר קרח, centrifuge את הדגימות שוב ב 934 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  9. פלאש להקפיא בגדר ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עיבוד נוסף.

3. רקמות פירוק Sonication, הכנת נוגדנים

  1. להמיס 1 טבליה מעכב פרוטאז לכל 10 מ"ל שבב הקציר המאגר.
  2. להוסיף 300 µL שבב מאגר הקציר עם מעכבי פרוטאז לכל 50 מ"ג של רקמות ולאפשר 30 דקות של פירוק על קרח.
    הערה: להוסיף 300 µL שבב מאגר הקציר עם מעכבי פרוטאז לכל עונה 1 פרק 107 שורות תאי מלנומה WM115.
  3. בעוד התאים הם lysing, הפעל waterbath מפצל של מערכת הקירור הקשורים ולאפשר הטמפרטורה להגיע 4 ° C. למקם את הצינורות sonicator מפצל waterbath ואת sonicate הרקמות מלנומה 60 מחזורים 30 s s על ו-30 כבוי כדי להשיג כרומטין שברי ~ 200-600 בסיסי זוגות (bp).
    הערה: זמן Sonication יכולים להיות שונים בין סוג הרקמה, צריך להיות מותאם בהתאם. זהו שלב קריטי והוא צריך להיות באופן מיטבי פיילוט לפני שימשיך immunoprecipitation.
  4. במהלך sonication, לשטוף µL 20 של חלבון G beads מגנטי לכל נוגדן לדגימה שלוש פעמים באמצעות 1000 µL חוסם/איגוד מאגר (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0.2% BSA).
  5. עבור ~ 8 מ ג של מלנומה רקמות, דגירה 3 µg של כל נוגדן היסטון ב 100 µL של איגוד / חסימת המאגר עבור 2 h ב 4 ° C עם סיבוב באמצעות אקדח צינור. הדוגמאות 12 עבור נוגדן יחיד מכילים µL 240 של חרוזים, 36 µg של נוגדנים, 1200 µL חוסם/איגוד המאגר.
    הערה: עבור 3 × 106 תאים, השתמש µg 5 של כל נוגדן ו 30 µL של חלבון G beads מגנטי לכל נוגדן. נוגדן וחרוזים חלבון G צריך להיות טיטרציה אם כמות שונה של רקמות נמצא בשימוש. פרוטוקול זה מדגים תנאי immunoprecipitation תיאר את שש היסטון שינויים (טבלה של חומרים), לעומת זאת, ריכוז נוגדן צריך להיות אופטימיזציה עבור שינויים אחרים, גורמי שעתוק.
  6. כדי לקבוע את גודל המקטע, להסיר µL 20 sonciated כרומטין פתרון להוסיף מאגר • תנאי מיקס מאסטר (טמפרטורת החדר) המכיל µL 44 של • תנאי ישיר מאגר, µL 1 של RNase (20 מ"ג/מ"ל), ו- 5 µL Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) עבור דגימה. דגירה בדגימות ב הצנטרפוגה תרמי PCR כבר לפחות שעתיים ב 50 º C. לטהר את הדגימה באמצעות ערכת טיהור PCR ההוראות יצרנים.
  7. ודא כרומטין הוא לכסנתם מספיק על-ידי קביעת גודל מקטע באמצעות מכשיר electropherogram DNA רגישות גבוהה לפני שתמשיך לשלב 3.6. הפעל את הכלי electropherogram.
  8. לטעון µL 2 של רגישות גבוהה מאגר ריאגנט לבאר כל רצועת צינור אופטי 8-. טוב. לטעון µL 2 של רגישות גבוהה בסולם לתוך µL קודם היטב ו-2 דוגמאות מטוהרים בבארות הנותרים.
  9. הניחו צינור אופטי כמוסות על צינור stips ואת מערבולת הדגימות ב 2000 סל ד עבור מינימלית 1 פתח המכסה והכנס של רגישות גבוהה מסך קלטת חדשה ותיבת טיפים טעינה. להסיר את הפקקים רצועת ולטעון את הדגימות לתוך כלי electropherogram.
  10. פתח את תוכנת ניתוח, סמן את החללים שלוש-עשרה לראשונה על הקלטת המסך ולחץ בכרטיסיה ' התחלה ' בפינה הימנית התחתונה. שברי כרומטין הנעים בין ~ 200-1000 bp מתאימים שבב.
  11. להעביר את הפתרון sonicated צינורות סטרילי, לסובב את הצינורות ב g 21,130 x באמצעות צנטריפוגה מלמעלה בטבלה למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינורות חדשים.
  12. לקבוע את הנפח הכולל של תגובת שיקוע ולאחר להסיר 10% הפתרון הכולל עבור פקד קלט ולאחסן אותו ב 4 º C.

4. כרומטין Immunoprecipitation

  1. לפזר 2 טבליות מעכב פרוטאז לכל 20 מ של שבב דילול מאגר.
  2. לאחר sonication שתדללו הדגימה הנותרים 5 פעמים באמצעות שבב דילול מאגר להביא את רמות מרחביות עד 0.1%. לדלל µL 270 של תגובת שיקוע הנותרים עם 1080 µL שבב מאגר דילול כדי לקבל נפח הכולל הסופי של 1350 µL.
  3. כשהטיפול הדגירה של נוגדנים, חלבון G beads מגנטי, הנח את השפופרת על מגנט ולהסיר את תגובת שיקוע.
  4. עם הרכבת התחתית עדיין יושב על המגנט, לשטוף את החרוזים פעם אחת על-ידי הוספת µL 750 שבב מאגר דילול עם מעכבי פרוטאז.
    הערה: חשוב לא להפריע את החרוזים או לסובב את הצינורות במהלך שלב זה.
  5. הסר את השבב דילול מאגר רוחצים את resuspend את החרוזים ב- 240 µL של המאגר דילול שבב באותו. Aliquot 20 µL של חרוזים לתוך 12 צינורות נפרדים, שכל אחד מהם משמש דגימת רקמה נפרדות.
  6. Aliquot החומר sonicated אחיד חלבון G חרוזים עם נוגדנים ספציפיים ומאבקים באמצעות אקדח צינור לילה ב 4 º C.

5. שטיפת והפוכה Crosslinking של מתחמי של חלבון ה-דנ א Immunoprecipitated

  1. למחרת בבוקר לאחר crosslinking הפוכה, להעביר את הפתרון נוגדן-חלבון צלחת 96-ובכן ומניחים אותו על הדוכן מגנטי. לאפשר את החרוזים לדבוק במשך לפחות 30 s והסר תגובת שיקוע.
  2. לשטוף את החרוזים 5 פעמים עם 150 µL קר כקרח ריפה שטיפת המאגר באמצעות pipet של רב ערוצית. במהלך השלבים לשטוף, האם לא pipet את החרוזים, אך להעביר את המגנט ברציפות מימין לשמאל עבור 30 לשנייה בכל שטיפה.
  3. לשטוף את הדגימות פעמיים עם µL 150 המאגר הקר של שטיפת ריפה-500.
  4. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 150 µL של המאגר הקר של שטיפת LiCl.
  5. לשטוף את הדגימות פעם אחת עם µL 150 קר כקרח טה שטיפת מאגר ולהסיר טה מאגר מיד. שלב זה יכול להיות מושמט ליישומים קלט נמוכה.
  6. הוסף פקד קלט מהשלב 3.7 לתוך בארות טריים של צלחת 96-ובכן המכיל דגימות ה-DNA שבב.
  7. אחרי הצעדים כביסה, להוסיף • תנאי מאגר בסיס תערובת (טמפרטורת החדר) המכיל µL 44 של מאגר ישיר • תנאי, µL 1 של RNase (20 מ"ג/מ"ל) 5 µL Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) לפי דוגמת שבב, קלט עבור crosslinking הפוכה.
  8. דגירה בדגימות באמצעות הצנטרפוגה תרמי של PCR במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 4 h-50 ° C ו- h 8-16-65 מעלות צלזיוס.

6. כימות של DNA זירז וטיהור

  1. למחרת בבוקר, מקום הדגימות חזרה על מגנט, העברה supernatant צלחת PCR 96-ובכן חדש אשר מכיל את immunoprecipitated ה-DNA.
  2. להוסיף 2.3 x חרוזים פאראמגנטיים פתרון (115 µL עבור µL 50 של פתרון) ובזהירות pipet לאורך 25 פעמים משתמש של pipet רב-ערוצי. הפתרון יהפוך הומוגנית אם כראוי.
  3. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר את המגנט עבור 4 דק את המקום בחזרה על המגנט ודוגמאות דגירה בטמפרטורת החדר במשך עוד 4 דק להשליך תגובת שיקוע.
  4. תוך השארת את הדוגמאות על המגנט, להוסיף 150 µL של 70% אתנול (vol/כרך), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s מבלי להפריע את החרוזים.
  5. הסר האתנול וחזור בכביסה. לאפשר את החרוזים פאראמגנטיים מהאוויר יבש על המגנט במשך 5 דקות.
    הערה: הסר כל האתנול לאחר לשטוף את השני כמו אתנול הנותרים יתערב בטהרה.
  6. הסר את הדגימות של המגנט ולהוסיף µL 30 של 10 מ מ טריס-Cl pH 8.0. לערבב על-ידי pipetting 25 פעמים, דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר את המגנט במשך 4 דקות.
  7. מניחים את הדגימות חזרה על המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך µL עוד 4 דק 20 העברה של כל דגימה על צלחת 96-ובכן חדשה עבור ספריית הכנה. אחסן את הנותרים 10 µL של ChIP הדנ א במקרה של בעיות פוטנציאליות עם הדור של הספריות.
  8. בשלב זה, לכמת ChIP הדנ א לפני ההכנה הספרייה. ריכוז הדנ א נמדד עם רגישות גבוהה-חומרים כימיים של הדנ א. לקבוע את התפלגות גודל ה-DNA זירז באמצעות הליך כלי electropherogram של ה-DNA רגישות גבוהה לשלב 7.1.

7. דור הספרייה באמצעות NEBNext אולטרה II DNA ספריית הכנת ערכת

  1. ליצור ספריות עבור הגדרות רצף באמצעות הכנה ספריית ה-DNA בעקבות הפרוטוקול המומלץ של היצרן. כל התגובות מבוצעות ב- 96-ובכן צלחות, incubations מבוצעות בהצנטרפוגה תרמי PCR עם ערכת טמפרטורה המכסה > 100 ° C, האחסון שוכן בגובה 50 µL.
  2. עבור אינדקסים, משמשים Oligos מולטיפלקס לפלטפורמה המיתרים. ביצוע סך של 10 מחזורים x עבור הגברה PCR באמצעות ההגדרות הבאות: דנטורציה הראשונית ב 98 ° C ל 30 s, דנטורציה ב 98 ° C עבור 10 s, חישול/סיומת ב 65 ° C ל 30 s (x 10 מחזורים), סיומת הסופי 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות והחזק ב 4 º C.
    הערה: טבלה 1 מכיל את צבעי בסיס המשמש PCR הגברה.
  3. לאחר הגברה PCR, להסיר את הדגימות ולהביא הנפח הכולל 100 µL בעזרת נוקלאז ללא מים. לבצע בחירה דו צדדי גודל פאראמגנטיים (0.55x/0.8x) על-ידי µL 55 הוספת הראשון של חרוזים ומערבבים על ידי pipetting 25 פעמים. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר את המגנט במשך 4 דקות.
  4. מניחים את הדגימות חזרה על מגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך עוד 4 דקות. שלב זה נועד לשמור על קטעים גדולים על חרוזים זה הזדהמו רצף.
  5. להעביר את תגובת שיקוע צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. אל תמחק תגובת שיקוע זה מכיל DNA מטוהרים חלקית.
  6. להוסיף עוד 25 µL של חרוזים פאראמגנטיים לערבב על ידי pipetting 25 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר את המגנט במשך 4 דקות.
  7. במקום דגימות בחזרה על המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך עוד 4 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע. שלב זה נועד לשמור על שברי ~ 200 עד 600 bp שישמש עבור סופית ספריות.
  8. תוך השארת את הדוגמאות על המגנט, להוסיף 150 µL של 70% אתנול (v/v) ולאפשר המקננת ב-30 s מבלי להפריע את החרוזים (לא זז בזמן המגנט). הסר האתנול וחזור לשטוף את פעם השנייה.
  9. לאפשר שהחרוזים פאראמגנטיים לאוויר יבש על המגנט עבור 5 דק להסיר אתנול כל לאחר לשטוף את השני כמו אתנול הנותרים יתערב בטהרה.
  10. הסר את הדגימות של המגנט ולהוסיף µL 25 של 10 מ מ טריס-Cl pH 8.0. לערבב על-ידי pipetting 25 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר את המגנט עבור 4 דק את המקום בחזרה על המגנט ודוגמאות דגירה בטמפרטורת החדר במשך עוד 4 דקות.
  11. לכמת ספריות באמצעות מכשיר electropherogram DNA רגישות גבוהה לפני ריבוב כדי להבטיח בגדלים מתאימים רצף. ספריות הושלמה נעות בין 200-600 bp, הם חסרי כל הדימרים פריימר.
    הערה: במקרה הצורך, עוד 0.7 x חרוז פאראמגנטיים טיהור מתבצע כדי להסיר הדימרים פריימר לא רצויים שנמצאים ב- ~ 130 bp.
  12. מאגר ה-DNA כימות המבוסס על צבעי יסוד אינדקס ייחודי על פי ריכוז. למאגר המכיל ששת המדגמים עם ריכוזים בין 1 ng/µL 6ng/µL, ההתפלגות הוא µL 15 המדגם הנמוך 2.5 µL של הדוגמה הגבוהה ביותר. זה נעשה כדי להבטיח קריאה ספירות יחולקו באופן שווה על כל ליין של התא זרימה.

8. פוסט seq שבב עיבוד נתונים

  1. צינור בהתבסס על38, snakemake39 הוא היה תהליך של כל הנושאים הבאים נכנס פקודה יחידה. חשוב, כל אחד משלבים אלה נידונות בנפרד עם פקודות המשויך.
  2. לקבוע את איכות הקריאות רצף fastq גלם באמצעות FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): פתיחת מסוף unix ושינוי מדריך (cd) אל התיקיה המכילה את קבצי raw fastq עבור כל אחד השינויים היסטון שש. סוג המסוף unix, fastqc *fastq.gz, הקש [חזרה]. זה יפעל על כל הקבצים fastq בתיקיה מדדים בקרת איכות...
  3. ליישר איכות שאוחזרו כדי הגנום הפניה ולהסיר כפילויות לפני דחיסה לקבצי בם. זה מתבצע באמצעות גרסה 1.1.2 עניבת הפרפר39, גירסה 0.1.21 SAMBLASTER40ו- SAMTOOLS גירסה 1.3.141: בסוג unix מסוף, עניבת הפרפר -m 1 - n 1--הטוב ביותר - histone1.fastq.gz /path_to/hg19 - q -S רבדים | samblaster - removeDups | samtools להציג -Sb - > histone1.bam, הקש [חזרה].
    הערה: path_to מציינת את התיקייה המכילה את מכלול הגנום האנושי hg19. זה ישתנה בהתאם האורגניזם עניין.
  4. למיין קבצים באם באמצעות SAMTOOLS עם הפקודה הבאה: בסוג מסוף unix, samtools למיין histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted ולחץ [חזרה].
  5. אינדקס קבצים באם באמצעות SAMTOOLS עם הפקודה הבאה: בסוג מסוף unix, samtools אינדקס histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai ולחץ [חזרה].
  6. לקבוע באופן ייחודי והן unaligned קריאות באמצעות SAMTOOLS flagstat עם הפקודה הבאה: סוג המסוף unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam, הקש [חזרה].
  7. לנרמל באם קבצים לפי ספירת קריאה על-ידי ביצוע דגימה אקראית עם הפקודה הבאה: בסוג מסוף unix, sambamba להציג bam -f-תת-דגימה-זרע = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools למיין -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam ולחץ [חזרה].
  8. אינדקס הקבצים באם שוב באמצעות SAMTOOLS עם הפקודה הבאה: בסוג מסוף unix, samtools אינדקס histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai ולחץ [חזרה].
  9. לדמיין את צ'יפ-seq ספריות על דפדפן הגנום (כלומר. UCSC או igv ב), ליצור קבצי אישיות חשובה באמצעות שינוי גודל הקבצים באם קורא לכל kilobase לכל deepTools גרסה 2.4.040 מיליון (RPKM). זה יכול להתבצע באמצעות הפקודות הבאות:
    1. עבור קבצים סטנדרטי אישיות חשובה: בסוג unix מסוף, bamCoverage -b histone1. downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw ולחץ {חזרה].
    2. עבור קלט המופחת אישיות חשובה קבצים: בסוג unix מסוף, bamCompare..--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam..--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - יחס הפחת, binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o... histone1.subtracted.bw ולחץ [חזרה].
  10. זיהוי השבב-seq אות העשרה על רקע "קלט" בעזרת ניתוח מודל המבוסס על שבב-seq (מקינטוש) גירסה 1.4.225,26 וגירסה 2.1.0. השתמש macs1 עבור גורמים "המקור" H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, macs2 על גורמים "מקור רחב" H3K79me2, H3K27me3 ו- H3K9me3. זה מתבצע באמצעות הפקודות הבאות:
    1. נקודת מקור: בסוג unix מסוף, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 - nomodel - שמור-dup - n histone1.file וכל העיתונות [חזרה].
    2. עבור מקור רחב: בסוג unix מסוף, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f 1e - p BAM-6 - רחבה - רחבה-הפסקת 1e-6-שמור-dup histone1.file - n - nomodel וכל העיתונות [חזרה].
  11. שימוש ChromHMM24 כדי לזהות תבניות המדינה כרומטין קומבינטורית מבוסס על השינויים היסטון למד באמצעות הפקודות הבאות:
    1. ב מסוף unix הקלד cd/path_to/ChromHMM_folder, ולחץ על ' [חזרה] '.
    2. פעם בסוג ChromHMM מדריך, java-mx2G-ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output, ג'אר ולחץ [חזרה].
    3. סוג, java-mx2G-ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19, ג'אר ולחץ [חזרה].

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר את immunoprecipitation בין קפוא גידול רקמות שורות תאים שניתן לבצע על עשרות דוגמאות במקביל באמצעות שיטה תפוקה גבוהה (איור 1 א'). כרומטין שברי צריך לנוע בין ~ 200-1000 סל ' ש של האופטימלית immunoprecipitation. אנו ציינו הזמן הדרוש כדי להשיג את אותו אורך חית...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודול שבב-seq מלא ומקיף, של תפוקה גבוהה, למיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית רקמות הגידול האנושית ואת שורות תאים. בכל פרוטוקול שבב-seq, אחד הצעדים החשובים ביותר הוא נוגדן ירידה לפרטים. . הנה, שיטה זו ממחישה immunoprecipitation התנאים המתוארים שישה היסטון השינויים, כל אשר שבב-כיתה, יש קודם ...

Disclosures

המחברים מצהירים אין קונפליקטים.

Acknowledgements

אנו מודים מרקוס קויל, Gumbs קרטיס, הליבה SMF MDACC לתמיכה רצף. העבודה המתוארות במאמר זה נתמך על ידי מענקים מן המענק NIH (CA016672) SMF הליבה של NCI פרסים (1K99CA160578 ו- R00CA160578) ק ר

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

References

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134Seqimmunoprecipitation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved