Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أننا مخطط بروتوكول للكشف عن التعبير المتزامن للوكيميا الخلايا الجذعية علامات على الخلايا الأولية من سرطان الدم النقوي الحاد بالتدفق الخلوي. نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها.

Abstract

سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو غير المتجانسة، وإذا لم تعالج، المرض المميت. هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم لدى البالغين. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض خلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة من اللوكيميا انفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. عدم التجانس ويمتد إلى وجود الخلايا الجذعية اللوكيميا (المهارات)، مع هذه الخلية الحيوية المقصورة المتطورة للتغلب على الضغوط المختلفة اختيار المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. لتعريف السكان احلركه، يسمح إضافة CD90 و CD45RA بالتمييز هسكس الطبيعي وفروعه multipotent داخل المقصورة الخلايا CD34 + CD38. هنا، فإننا مخطط بروتوكولا للكشف عن التعبير المتزامن لعدة علامات احلركه المفترضة (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الخلايا الانفجار الأساسي للبشرية في مكافحة غسل الأموال بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي. وعلاوة على ذلك، نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها. يمكن استخدام هذا الأسلوب للكشف والتحديد الكمي للمهارات المفترضة للمتابعة السريرية لاستجابة العلاج الكيميائي (أي.، الحد الأدنى من الأمراض المتبقية)، كما احلركه المتبقية قد تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال.

Introduction

سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض الاستنساخ من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة لانفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. في الآونة الأخيرة، أنشئت الاستنساخ تنافر انفجار الخلية أساسا باستخدام استراتيجيات التسلسل (خ ع) الجيل المقبل، وتشير إلى وجود تطور الاستنساخ داخل ورم الخلايا1.

عدم تجانس يمتد إلى وجود الخلايا الجذعية ليوكيميك (المهارات). هو الافتراض بأن تتطور هذه المقصورة الخلية الحيوية للتغلب على الضغوط التحديد المختلفة المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. ولذلك يفترض أن تكون مقاومة لنظم العلاج الكيميائي الحالي والتوسط في انتكاس المرض، مع آثار عميقة السريرية2احلركه. وقد وصف علامات مختلفة لتوصيف احلركه مثل CD1233, CLL-14، CD975 أو تيم-36. يعتبر الإثراء احلركه7 CD34 + CD38-حجرة الانفجار الخلايا بل يشمل أيضا HSC العادي. CD90 و CD45RA التعبير ينطبق على CD34 + CD38-المقصورة (P6) (الشكل 1) تصاريح لفصل عدة مراحل من السلائف المكونة للدم العادي والخبيث8. على وجه التحديد، العادي CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-هسكس, multipotent موروث (MPP) مثل CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-الخلايا CD34 + CD38-CD90-CD45RA + يمكن تحديد الخلايا اللمفاوية أعدادا السلف multipotent (لمب) في معظم مكافحة غسل الأموال الحالات8 ،9. الأسفار متوسط الكثافة (MFI) CD38 مهم بشكل خاص النظر داخل المقصورة الخلايا CD34 +. نظراً لكثافة CD38 يحدد ثلاث مقصورات خلية جديدة منها: CD38 السلبية (P6)، CD38 خافت (P7) ومشرق CD38 (P8) (الشكل 1). وقد يحدد مؤسسة مونتانيار CD38 استخدام أما هيماتوجونيس و/أو خلايا البلازما كرقابة داخلية إيجابية كما أعرب هذه الخلايا بشدة CD38.

الطراز الماوسفارغة (مجموعة موردي المواد النووية) العوز إيماءة/نظام/IL2Rγc يستخدم على نطاق واسع ل engraftment عادي والخلايا المكونة للدم الخبيثة الإنسان10،11. وتستخدم فحوصات السلالة المسلسل تجريبيا التحقق من الدالة احلركه أو HSC. هذه الدراسات قد تم تحليلها على نطاق واسع بالنهج تسلسل واسعة النطاق. على الرغم من ذلك، يعرف حول إيمونوفينوتيبي احلركه و HSC لمكافحة غسل الأموال الانفجار السكاني انجرافتيد في الفئران مجموعة موردي المواد النووية مقارنة مكافحة غسل الأموال الأولية (الشكل 2).

إعداد احلركه أصلاً منخفضة وبالتالي، والتحديد الكمي للمهارات التحدي والطريقة الموضحة هنا يمكن استخدامها مقايسة سيتوميتريك تدفق في التشخيص والمتابعة السريرية لتقييم استجابة العلاج الكيميائي (كما قد احلركه المتبقية تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال). قد يشير إلى وجود احلركه الأمراض المتبقية ضئيلة الإيجابية (MRD). وحتى الآن، رصد في مكافحة غسل الأموال في معظمها تعتمد على الأساليب الجزيئية (أي، الرايت-بكر، خ ع)10،12. بيد في هذا البروتوكول يمكننا الكشف عن التعبير البروتين المتزامن لعدة علامات HSC/احلركه (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الابتدائي انفجار الخلايا لمكافحة غسل الأموال البشرية بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي2،،من89. يمكن تطبيق هذا المزيج من الأجسام المضادة في أي مختبر قياس التدفق القياسي وهذا الإنزيم MRD تدفق مثير للاهتمام خاصة عند MRD بالوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (RT-PCR) ليس من الممكن، أيإذا اللوكيميا محددة جزيئية علامات لا يمكن كشفها في العينة التشخيصية مكافحة غسل الأموال. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول، مكمل للتقنيات الجزيئية MRD أكثر حساسية، كما أنها تهدف إلى كشف وتحديد الخلايا غير طبيعية السلف المكونة للدم الذي يمثل إحدى خصائص وظيفية خلية (الشكل 3).

نعرض كيفية قياس الثلاث المكونة للدم السلف السكان وحجرة احلركه المفترضة مع اختلاف درجة النضج بالتدفق الخلوي مع الأجسام المضادة متوفرة في معظم المختبرات السريرية. وعلاوة على ذلك، أكدت وجود هذه المقصورات الخلية في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها (PDX)، وفي العلاج متابعة.

Protocol

ونحن نتابع المعايير الأوروبية لاستخدام الحيوانات للأغراض العلمية. أقر هذه الدراسة اللجنة المحلية للأخلاقيات (#3097-2015120414583482v3).

1. إعداد نموذج

  1. جمع نخاع العظم (2 مل) من حيثياته مكافحة غسل الأموال في الأنابيب التي تحتوي على حمض التخثر الإيثيلين (يدتا) بتركيز 1.8 ملليغرام كل مل نخاع العظام.
  2. أداء فيكل فصل، فصل كثافة متدرجة لعزل الخلايا وحيدات النوى من الخلايا الحمراء والمحببة، كما يتبع. تمييع نخاع العظام في 3 مجلدات من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (برنامج تلفزيوني: خ2ص4 ، غ2هبو4 ملم 10 ملم 137 كلوريد الصوديوم، بوكل 2.7 مم 1.8 مم). تراكب 1 حجم فيكل بحجم 1 من المخفف نخاع العظام بعناية. تدور 30 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل. نقل الطبقة البيضاء معطف بافي خلايا مونونوكليتيد في أنبوب عقيم جديدة.
  3. تغسل الخلايا مرتين في 10 مل من برنامج تلفزيوني) والطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق، بغية إزالة تلويث المصل المكونات.

2-تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)

  1. إضافة 2 مل من تحلل المخزن المؤقت (كلوريد الأمونيوم 0.8 في المائة) إلى الخلية بيليه، دوامة بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، كرر هذه الخطوة.
  2. أغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني كما تم وصفه سابقا (1.3.).

3-المريض المستمدة تكثيفها.

  1. الحصول على انفجار الخلايا من نخاع العظم بعد الانفصال فيكل وبعد استنفاد الخلايا الليمفاوية باستخدام إيمونوماجنيتيك السلبية التحديد (CD3 T-، و CD20 للخلايا الليمفاوية ب). اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. حقن 5 × 106 مكافحة غسل الأموال انفجار الخلايا في هذا السياق ذيل من الفئران مجموعة موردي المواد النووية غير المشروطة. استخدام جهاز تقييدي لتيسير حقن الوريد الذيل. تبقى الفئران تحت الشروط التقليدية، وخاصة في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض خاصة في جميع الأوقات، باستخدام الأقفاص التهوية الفردية والتلاعب تحت غطاء الاندفاق الصفحي. كل أسبوعين، تأخذ 60 ميليلتر من الدم بطريقة جمع اللهاة استخدام الهيماتوكريت الشعرية. مكان شعري في 5 مل جولة الأنبوبة السفلي. إيقاف التسييل بتطبيق ضغط لطيف باستخدام وسادة صغيرة شاش معقم. اكسبولسي الدم بحقنه نظيفة.
  3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي في 300 غرام x لأدنى 5 يغسل مع برنامج تلفزيوني وسينتريفوجري في 300 x ز لمدة 5 دقائق. إزالة المادة طافية، إضافة 100 ميليلتر برنامج تلفزيوني مع وصمة عار ألبومين المصل البقري 10% (BSA) مع 3 ميليلتر المضادة الإنسان CD45-فيتك والفاري المضادة 1 ميليلتر CD45-آسيا والمحيط الهادئ، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. بيليه خلية يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني (2 مل) مع جيش صرب البوسنة 10% وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  5. الكوة تصل إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب التدفق الخلوي.
  6. باستخدام المسح انجرافتمينت كل أسبوعين بتحليل تشيميريسم التعبير CD45 (البشرية مقابل مورين) التدفق الخلوي (الشكل 2 أ و ب).
  7. بتضحيات (انفجار الطرفية عدد أكبر من 70% أو علامات سريرية شديدة من المرض)، جمع وحيدات النوى انفجار الخلايا من سحق الطحال ونخاع العظام بالتنظيف تيبياس وقصبة مع برنامج تلفزيوني كما تم وصفه سابقا13. Euthanize الفئران بسرطان عنق الرحم التفكك اتباع المبادئ التوجيهية الدولية.
  8. إذا احتوت الخلية بيليه على ربك، أداء تحلل خلايا الدم الحمراء مع تحلل المخزن المؤقت (الخطوة 2، 1).
  9. أغسل بيليه الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (2 مل) مع جيش صرب البوسنة 10% وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  10. جمع الخلايا والكوة إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب التدفق الخلوي.

4-التلوين

  1. إضافة الأجسام المضادة مترافق (راجع الخطوة 4، 2) ودوامه. احتضان خلايا لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  2. استخدم لوحة التالية للبشرية الأولية أو عينات PDX يتألف من 10 ميليلتر لمكافحة--CD36-فيتك، 5 ميليلتر لمكافحة--CD19-النماء، 5 ميليلتر لمكافحة--CD33-PC5.5، 5 ميليلتر لمكافحة--CD90--آسيا والمحيط الهادئ، 5 ميليلتر لمكافحة--CD34-AA700، 5 ميليلتر لمكافحة--CD45RA--آسيا والمحيط الهادئ-H7، 5 ميليلتر الأزرق ومكافحة CD38--المحيط الهادئ، 5 ميليلتر من مكافحة--CD123-PC7 و 2.5 ميليلتر لمكافحة--CD45-كو.
  3. إزالة الأجسام المضادة غير منضم بغسل الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
  4. إعادة تعليق الخلايا في 450 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتحليل تدفق النهائي سيتوميتريك.

5-النابضة استراتيجية لتحليل التدفق الخلوي

  1. إجراء الحصول على البيانات (خلايا على الأقل 500,000) على سيتوميتير تدفق مجهزة بأشعة الليزر الأحمر والأزرق والبنفسجي. تحقق من إعدادات سيتوميتير كل يوم لمحاذاة 1) البصري ونظام 2) فلويديك حساسية 3) البصرية 4) توحيد استخدام فلوروسفيريس
  2. اتبع استراتيجية النابضة متسلسلة تعريف تعبير CD38 (الشكل 1).
    1. استخدام الخلايا من عينات نخاع العظم الطبيعي لتعريف هيماتوجونيس أو خلايا البلازما التي ستكون بمثابة السيطرة الإيجابية لتعبير CD38.
      ملاحظة: هذه البوابة أهمية خاصة لتقييم اللاحقة السكان احلركه المفترضة تتوقف على التعريف الخاص به.
    2. تحديد الخلايا السلائف الفسيولوجية (انفجار الخلايا الطبيعية) بالمعايير السكانية المنخفضة (الجانب مبعثر) CD45dim/SSC (الشكل 1A). داخل هذا الانفجار السكاني، تحديد هيماتوجونيس، الذي عرض CD38 + + CD19 + النمط الظاهري (الشكل 1B) وأخيراً، استخدام تعبير CD36 و CD33 لتعريف مييلوبلاستس ومونوبلاستس واريثروبلاستس (الشكل 1). تحديد التعبير CD34 في هيماتوجونيس كما هو موضح في (الشكل 1E). تقييم العديد من الفئات السكانية الفرعية السلائف داخل خلايا الانفجار يعرف P6-P10 (الشكل 1). فصل المقصورة CD34 انفجار الخلايا في P6، P7، P8 السلف الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى إعداد مسبق CD38 غيتس. ضمان أن حجرة P8 يحتوي على الانفجارات التي لها نفس الكثافة CD38 هيماتوجونيس، أن يشمل P6 الخلايا التي CD38-استناداً إلى الأسفار CD38 ناقص واحد (FMO) مراقبة وما بين النقيضين فيما يتعلق CD38 الخلايا P7 التعبير (الشكل 1).
  3. من CD34 + 38-(P6) فصل الخلايا، وبوابات HSC من احلركه المفترضة التي تستخدم تعبير CD90 و CD45RA (الشكل 1F).
    ملاحظة: هو النمط الظاهري HSC CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-وفروعه multipotent (MPP) تعرف بأنها CD34 + CD38-CD90-CD45RA-. النمط الظاهري احلركه المفترضة هو CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + والسكان المتلقين للمعلومات غير ناضجة أكثر من موروث اللمفاوية معبي (لمب) يعرف CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.

6-رصد RT-PCR MRD

  1. رصد مستويات واسطة RT-PCR كما هو موضح سابقا من14.

النتائج

هنا نقدم طريقة لتحديد السكان السلف في عينات نخاع العظام البشرية العادية والخبيثة. ونحن جمع نخاع العظم والطحال من PDX ناجحة وإجراء قياس التدفق مولتيباراميتريك كما هو موضح أعلاه. أننا بالمقارنة مع الفئات السكانية الفرعية عدة خلايا الانفجار بين عينة المريض التشخيص و PDX المقابلة وخاصة، حجرة CD3...

Discussion

ويتطلب إجراء تقييم دقيق واستنساخه من علامات هيولى بالتدفق الخلوي أو غشاء أن إعدادات أداة يتم التحقق من كل يوم لمحاذاة البصري، سليمة الأداء نظام فلويديك والحساسية الضوئية، وتوحيد استخدام الخرز المعايرة.

الكشف عن خلية انفجار السكان في مكافحة غسل الأموال باستخدام CD90 و CD45RA بت...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل جزئيا فيوجين لوريت الرابطة الفرنسية والسرطان le ليجويكونتري (مركز الشمال)، ومؤسسة دي فرنسا (اللوكيميا) "اللجنة"، أونكوليلي SIRIC، ومعهد السرطان الوطني الفرنسي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PancollPAN-BiotechP04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)OzymeBLE420301RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  miceJACKSON LABORATORYStock No: 005557
PBSGibco by life technologies14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation BufferMACS Buffer Miltenybiotec130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)Beckman CoulterPN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)Beckman CoulterB36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)Biolegend328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)Beckman CoulterA07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)Beckman CoulterB92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) Beckton Dickinson560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)Beckman CoulterB92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)Beckman CoulterB36294
Anti-CD3-PEBeckman CoulterIM1451
Anti-CD20-PEBeckman CoulterA07747
Anti-CD123-PC7Beckman CoulterB13647
Flow-SetBeckman CoulterA63492
Flow-CheckBeckman CoulterA63493
NaviosBeckman CoulterDS-14644A
LSR Fortessa X20BD Biosciences
CST BDBD Biosciences655051
FacsFlow BD Biosciences336911
Anti-hCD45-FITCBiolegendBLE304006
Anti-mCD45-APCBiolegendBLE103112
EasySep human PE selection kitStem Cell Technologies18000
EasySep  magnet Stem Cell Technologies18551

References

  1. Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
  2. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
  3. Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
  4. van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
  5. Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
  6. Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
  7. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
  8. Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
  9. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  10. Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
  11. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  12. Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
  13. Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
  14. Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 PDX MRD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved