Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Résumé

Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.

Résumé

La leucémie myéloïde aiguë (AML) est un hétérogène et si ne pas traitée, la maladie mortelle. C’est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie chez l’adulte. Au départ, AML est une maladie des cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques de leucémie et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches de la leucémie (LSC), avec cette cellule dynamique compartiment évoluer pour surmonter les diverses pressions de sélection imposée pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. Pour définir plus précisément la population de la LSC, l’ajout de CD90 et CD45RA permet la discrimination de la GPX normales et de cellules souches multipotentes dans le compartiment de cellules CD34 + CD38. Ici, nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée de plusieurs marqueurs LSC putatifs (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par cytométrie en flux multiparamétrique. De plus, nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes. Cette méthode de détection et de quantification de LSC putatif sont utilisables pour suivi clinique de la réponse de la chimiothérapie (i.e., maladie résiduelle), comme le LSC résiduelle peut provoquer une récidive AML.

Introduction

Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie. Initialement, AML est une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. Récemment, clonale hétérogénéité de la population cellulaire blast a été établie essentiellement à l’aide de stratégies de séquençage (NGS) prochaines génération et montrant l’existence d’une évolution intra-clonale de cellules de tumeur¹.

L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches leucémiques (LSC). Il est possible que ce compartiment cellulaire dynamique évolue pour surmonter les diverses pressions de sélection imposées pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. C’est pourquoi LSC sont censés être résistante aux traitements chimiothérapeutiques actuels et agir comme médiateur de la rechute de la maladie, avec de profondes implications cliniques². Différents marqueurs ont été décrites pour caractériser la LSC comme CD123³, CLL-1⁴, CD97⁵ ou TIM-3,⁶. Le CD34 + CD38-compartiment de cellules blastiques est censé être enrichie pour LSC⁷ mais inclut également des HSC normal. CD90 et CD45RA expression appliquée à la CD34 + CD38-compartiment (P6) (Figure 1) permet de séparer plusieurs étapes de précurseurs hématopoïétiques normales et malignes⁸. Plus précisément, normaux CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-CSH, multipotentes progéniteurs (MPP) comme CD90dimCD45RA-cellules CD34 + CD38 et CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellules souches multipotentes lymphoïdes-amorcé (PPSP) peuvent être déterminées dans la plupart des AML cas^{8 ,},⁹. L’intensité de la fluorescence moyenne (IFM) de CD38 est particulièrement importante à considérer dans le compartiment de cellules CD34 +. Parce que l’intensité CD38 définit trois nouveaux compartiments cellulaires celle-ci : CD38 négatif (P6), CD38 dim (P7) et CD38 lumineux (P8) (Figure 1). L’IFM de CD38 peut être déterminée à l’aide de hematogones ou plasmocytes comme contrôle positif interne que ces cellules expriment fortement CD38.

Le modèle de souris^null (NSG) immunodéficientes NOD/SCID/IL2Rγc est employé couramment pour greffe de normal et les cellules hématopoïétiques malignes humaines^10,11. Série de xénotransplantation dosages sont utilisés pour valider expérimentalement fonction LSC ou HSC. Ces études ont été longuement analysés par les approches de séquençage à grande échelle. Néanmoins, on connaît moins le LSC et HSC lymphoblastiques de population de blast AML implantée chez des souris NSG par rapport à ses principaux AML (Figure 2).

Les numéros de LSC sont donc intrinsèquement faibles, identification et quantification de LSC sont difficiles et la méthode décrite ici peut être épuisée comme un essai de cytométrie en flux au diagnostic et au suivi clinique pour évaluer la réponse de la chimiothérapie (comme résiduel LSC peut provoquer une récidive AML). La présence de LSC peut indiquer la maladie résiduelle positive (MRD). À ce jour, MRD surveillance principalement dans AML s’appuient sur des méthodes moléculaires (c.-à-d., RT-PCR, NGS)^10,12. Toutefois, dans ce protocole nous détectons expression de la protéine simultanée de plusieurs marqueurs HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par multiparamétriques écoulement cytometry^2,8,9. Cette combinaison d’anticorps peut être appliquée dans n’importe quel laboratoire de cytométrie de flux standard et ce dosage MRD de débit est particulièrement intéressant lorsque MRD par PCR en temps réel (RT-PCR) n’est pas possible, c'est-à-diresi spécifique de la leucémie moléculaire marqueurs ne sont pas détectables dans l’échantillon diagnostic d’AML. En outre, le présent protocole, est complémentaire aux techniques plus sensibles MRD moléculaires, puisqu’il vise à détecter et à quantifier les cellules progénitrices hématopoïétiques anormales qui représente une caractéristique fonctionnelle cellulaire (Figure 3).

Nous montrons comment quantifier les trois populations de cellules souches hématopoïétiques et du compartiment de LSC putatif avec le degré de maturation par cytométrie de flux avec des anticorps disponibles dans la plupart des laboratoires cliniques. En outre, nous a confirmé la présence de ces compartiments cellulaires en correspondants patient-dérivés-xénogreffes (PDX) et au traitement suivi.

Protocole

Nous suivons les normes européennes pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique local (#3097-2015120414583482v3).

1. préparation de l’échantillon

1. Recueillir la moelle osseuse (2 mL) de novo de AML dans des tubes contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) à une concentration de 1,8 mg / mL de moelle osseuse.
2. Effectuer la séparation de Ficoll, une séparation de gradient de densité à isoler des cellules mononucléaires de globules rouges et des granulocytes, comme suit. Diluer la moelle osseuse en 3 volumes de solution saline de tampon au phosphate (PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na₂HPO₄ , KH₂PO₄ 1,8 mM). Le recouvrement soigneusement 1 volume de Ficoll et 1 volume de moelle diluée. Faire tourner 30 minutes à 300 x g sans frein. Transférer la couche blanc couche leuco-plaquettaire de cellules mononucléées dans un nouveau tube stérile.
3. Laver les cellules deux fois dans 10 mL de PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, afin de supprimer les composants de sérum contaminantes.

2. la lyse des globules rouges (RBC)

1. Ajouter 2 mL de tampon de lyse (chlorure d’ammonium 0,8 %) à la cellule de granule, vortex doucement et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
   Remarque : si nécessaire, répétez cette étape.
2. Cellules de lavage en PBS comme décrit précédemment (1.3.).

3. le patient dérivé des xénogreffes.

1. Obtenir les cellules blastiques de la moelle osseuse après la séparation de Ficoll et après épuisement de lymphocytes à l’aide d’immunomagnetic négatif sélection (CD3 pour T- et CD20 des lymphocytes B). Suivez les instructions du fabricant.
2. Injecter 5 x 10⁶ cellules blastiques d’AML dans la veine de queue de souris NSG inconditionnées. Utiliser un dispositif de retenue pour faciliter l’injection dans la veine queue. Garder des souris dans des conditions classiques et surtout dans des conditions spécifiques-exempts de micro-organismes pathogènes en tout temps, en utilisant des cages ventilées individuelles et en manipulation sous hotte à flux laminaire. Toutes les deux semaines, prenez 60 µL de sang par la méthode de collecte sous-maxillaire utilise un hématocrite capillaire. Place le capillaire dans un 5 mL rond tube inférieur. Arrêter le saignement en appliquant une légère pression à l’aide d’une petite compresse stérile. Expulser le sang avec une seringue propre.
3. Ajouter 1ml de tampon de lyse et incuber pendant 5min. Puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min. laver avec PBS et centrifugre à 300 x g pendant 5 minutes. Retirer le surnageant, l’ajouter 100 µL PBS avec 10 % d’albumine sérique bovine (BSA) tache avec 3 anti-humain µL CD45-FITC et anti-murin 1 µL CD45-APC et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes.
4. Laver le culot cellulaire deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
5. Aliquote jusqu'à 1 x 10⁶ cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.
6. Enquête sur la prise de greffe toutes les deux semaines par l’analyse de chimérisme d’expression de CD45 (humain versus murin) utilisant l’écoulement cytometry (Figure 2 a et B).
7. Au moment du sacrifice (comte de blast périphérique supérieure à 70 % ou de signes cliniques graves de la maladie), recueillir les cellules blastiques mononucléaires des rates concassées d’et de la moelle osseuse en rinçant les tibias et fémurs avec PBS comme décrit plus haut¹³. Euthanasier souris par dislocation cervicale après les lignes directrices internationales.
8. Si le culot cellulaire contient RBC, effectuer la lyse des globules rouges avec le tampon de lyse (point 2.1).
9. Laver les cellules granule deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
10. Recueillir des cellules et aliquote à 1 x 10⁶ cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.

4. coloration

1. Ajouter vortex et anticorps conjugués (voir point 4.2). Incuber les cellules pendant 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
2. Utilisez le panneau suivant pour primaires humaines ou des échantillons PDX comprenant 10 µL d’anti-CD36-FITC, 5 µL d’anti-CD19-DCE, 5 µL d’anti-CD33-PC5.5, 5 µL d’anti-CD90-APC, 5 µL d’anti-CD34-AA700, 5 µL d’anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL d’anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL de anti-CD123-PC7 et 2,5 µL d’anti-CD45-KO.
3. Ôter les anticorps non liés en lavant les cellules dans 2 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
4. Remettre en suspension cellules dans 450 µL de PBS pour cytométrie final.

5. gating stratégie pour analyse en cytométrie en flux

1. Acquisition de données (au moins 500 000 cellules) effectuer un cytomètre en flux équipée avec les lasers rouges, bleues et violettes. Vérifiez les paramètres de cytomètre chaque jour pour un alignement 1) optique, système 2) fluidique, sensibilité 3) optique et 4) normalisation à l’aide de LeukoSure
2. Suivre la stratégie de déclenchement séquentielle pour définir l’expression de CD38 (Figure 1).
   1. Cellules à partir des échantillons de moelle osseuse normale permet de définir des hematogones ou des cellules de plasma qui servira de témoin positif pour l’expression de CD38.
      Remarque : cette porte est particulièrement importante d’évaluer les populations de LSC putatives ultérieures dépendent de sa définition.
   2. Définir les cellules précurseurs physiologique (les cellules blastiques normales) selon des critères de population faible CD45dim/SSC (diffusion latérale) (Figure 1 a). Au sein de cette population de blast, définir hematogones, qui affichent une CD38 ++ CD19 + phénotype (Figure 1 b) et enfin, utiliser CD36 et CD33 expression pour définir myeloblasts, monoblastes et érythroblastes (Figure 1). Déterminer CD34 expression sur hematogones comme illustré (Figure 1E). Évaluer plusieurs sous-populations de précurseurs dans les cellules blastiques définis comme P6-P10 (Figure 1). Séparer le compartiment CD34 de cellules blastiques dans P6, P7, P8 sous-populations de géniteur issues de préréglage CD38 gates. Veiller à ce que le compartiment P8 contienne les explosions qui ont la même intensité de CD38 comme le hematogones, que P6 contient des cellules qui sont CD38-basé sur la fluorescence CD38 moins un contrôle (FMO) et que les cellules P7 sont entre ces deux extrêmes en ce qui concerne CD38 expression (Figure 1).
3. Le CD34 + 38-(P6) cellules fermées, séparer HSC de LSC putatif à l’aide de l’expression CD90 et CD45RA (Figure 1F).
   Remarque : le phénotype HSC est CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- et les cellules souches multipotentes (MPP) sont définis comme CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Le phénotype putatif de la LSC est CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + et la population en aval plus immature sont les progéniteurs lymphoïdes-amorcé (PPSP) définis comme CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.

6. MRD suivi par RT-PCR

1. Surveille les niveaux MRD par RT-PCR comme décrit plus haut¹⁴.

Résultats

Nous présentons ici une méthode pour déterminer les populations de souches dans des échantillons de la moelle osseuse humaine normaux et malins. Nous prélevé un PDX réussie de la moelle osseuse et la rate et cytométrie multiparamétriques comme décrit ci-dessus. Nous avons comparé plusieurs sous-populations de cellules blastiques entre le sérum du patient diagnostique et le PDX correspondante et en particulier, le compartiment de CD34 + CD38-géniteur, notamment enrichis en LSC putatif. Nous avons trouvé que ...

Discussion

Une évaluation précise et reproductible de membrane ou de marqueurs cytoplasmiques par cytométrie nécessite que les paramètres de l’instrument sont vérifiés tous les jours pour un alignement optique, bon fonctionnement du systeme fluidique, sensibilité optique et normalisation à l’aide de perles de calibration.

Détection des populations cellulaires blast AML utilisant CD90 et CD45RA par analyse en cytométrie en flux multi paramétrique est une méthode relativement simple et fia...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551