Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לזהות ביטוי בו זמנית של סמנים תאי לוקמיה בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה הראשי על-ידי cytometry זרימה. אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts.

Abstract

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא הטרוגנית, ואם אינו מטופל, מחלה קטלנית. . זה הגורם הנפוץ ביותר של סרטן הדם-הקשורים לתמותה אצל מבוגרים. בתחילה, AML היא מחלה של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים לוקמיה הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. הטרוגניות משתרע על נוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC), עם תא דינמי זה תא מתפתח כדי להתגבר על לחצים שונים לבחירה שהוטלו על במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לשם הגדרה נוספת של האוכלוסייה ה-LSC, התוספת של CD90 ו- CD45RA מאפשר את האפליה של HSCs נורמלי, אבות multipotent בתוך תא תאי CD34 + CD38. כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול כדי לזהות ביטוי בו זמנית של מספר סמני ה-LSC בשם (CD34, CD38, CD45RA, CD90) בתאי הפיצוץ העיקרי של AML האנושית על ידי cytometry זרימה multiparametric. יתר על כן, אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts. שיטה זו של זיהוי, כימות של ה-LSC בשם עשוי לשמש לצורך מעקב קליני של כימותרפיה תגובה (כלומר., מחלה שיורית מינימלית), כמו ה-LSC שיורית עלול לגרום AML relapse.

Introduction

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוא הגורם הנפוץ ביותר של לוקמיה-הקשורים לתמותה. בתחילה, AML היא מחלה המשובטים של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. לאחרונה, הטרוגניות המשובטים של האוכלוסייה תא הפיצוץ הוקם בעיקרו באמצעות אסטרטגיות רצפי (הגדרות) ' הדור הבא ' ו מציג את קיומו של אינטרה-המשובטים התפתחות גידול תאים1.

הטרוגניות משתרע על הנוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC). זה המשוערות זה את התא תא דינאמית מתפתחת כדי להתגבר על לחצים בחירה שונות שנכפו במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לכן ה-LSC אמורים להיות עמידים בפני משטרי כימותרפיות הנוכחי ולסיים את התדרדרות המחלה, עם השלכות קליניות עמוקה2. סמנים שונים תוארו לאפיין את ה-LSC כמו CD1233, CLL-14, CD975 או טים-36. התא-CD34 + CD38 של תאים הפיצוץ נחשב להיות מועשר עבור ה-LSC7 , אך כולל גם HSC נורמלי. CD90 CD45RA הבעה המוחל על CD34 + CD38-תא (P6) (איור 1) מאפשרת הפרדת מספר שלבים של מבשרי hematopoietic נורמלי וממאירים8. באופן ספציפי, נורמלי CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent אבות (MPP) כמו CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-תאי CD34 + CD38-CD90-CD45RA + הלימפה בשלה multipotent (LMPP) ובתאים יכול להיקבע ברוב המכריע של AML מקרים8 ,9. עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) CD38 זה חשוב במיוחד להיחשב בתוך CD34 + תא התא. מכיוון CD38 עוצמת מגדיר שלושה חדשים תאים תאים הימנו: CD38 שלילי (P6), CD38 דים (P7), CD38 בהיר (P8) (איור 1). MFI של CD38 עשויים להיקבע באמצעות או hematogones ו/או תאים פלזמה כפקד של חיובי פנימי כפי שהתאים האלה מבטאים חריפה CD38.

Immunodeficient הנד/SCID/IL2Rγcnull (NSG) העכבר המודל משמש עבור engraftment של הנורמה, תאים ממאירים האדם hematopoietic10,11. השתלת איברים מבעלי חיים טורי מבחני משמשים לאימות השפעול פונקציית ה-LSC או מועדון הכדורגל מונפלייה. מחקרים אלה יש כבר ניתחו בהרחבה על ידי גישות רצף בקנה מידה גדול. עם זאת, פחות ידוע על immunophenotype ה-LSC ומועדון הכדורגל מונפלייה מאוכלוסיית הפיצוץ AML engrafted לתוך NSG עכברים לעומת AML העיקרי שלה (איור 2).

מספרי ה-LSC מטבעם נמוכים ולכן, וכימות של ה-LSC הם מאתגרים השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש זרימת cytometric assay האבחון ועל מעקב קליני כדי להעריך את התגובה כימותרפיה (כמו ה-LSC שיורית עשוי לגרום AML relapse). הנוכחות של ה-LSC עשוי להצביע על מחלה שיורית מינימלית חיובי (MRD). עד כה, MRD ניטור ב- AML בעיקר להסתמך על שיטות מולקולרית (קרי, RT-PCR, המיתרים)10,12. עם זאת, ב פרוטוקול זה אנחנו לזהות ביטוי חלבון בו זמנית של מספר HSC/ה-LSC הסמנים (CD34, CD38, CD45RA, CD90) בתאי הפיצוץ העיקרי של AML האנושי על-ידי8,2,cytometry זרימה multiparametric9. שילוב זה של נוגדנים ניתן להחיל במעבדה cytometry זרימה רגילה כל ואת וזמינותו MRD זו הזרימה הוא מעניין במיוחד כאשר MRD על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) אינה אפשרית, כלומר, אם לוקמיה ספציפי מולקולרית סמני אינם לזיהוי במדגם AML אבחון. יתר על כן, פרוטוקול זה, הוא משלימים של טכניקות MRD מולקולרי יותר רגיש, מטרתו לזהות ולכמת את ובתאים hematopoietic חריג אשר מייצג מאפיין תפקודי התא (איור 3).

אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון hematopoietic, בשם ה-LSC התא עם מידה שונה של התבגרות מאת cytometry זרימה עם נוגדנים זמינים ברוב המכריע של מעבדות קליניות. יתר על כן, אנו אישרו הנוכחות של אלה התא בתאים המתאימים למטופל-נגזר-xenografts (PDX), על טיפול מעקב.

Protocol

אנו עוקבים אחר תקנים אירופיים עבור השימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית (#3097-2015120414583482v3).

1. הכנת הדוגמא

  1. לאסוף מח עצם (2 מ"ל) דה נובו AML צינורות המכיל חומצה ethylenediaminetetraacetic קרישה (EDTA)-ריכוז של 1.8 מ ג מ של מח העצם.
  2. לבצע הפרדה Ficoll, פרידה הדרגתי צפיפות בידוד תאי תאי תאי דם אדומים, גרנולוציטים, כדלהלן. לדלל מח 3 כרכים של פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS: NaCl 137 מ מ, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, נה2HPO4 10 מ מ, ח'2PO4 מ מ 1.8). בזהירות כשכבת-על נפח 1 של Ficoll עם נפח 1 של מח העצם מדולל. ספין 30 דקות ב g x 300 ללא בלם. העברה לשכבת באפי החלוק הלבן של תאים mononucleated לתוך צינור סטרילי.
  3. לשטוף פעמיים בתאים 10 מ"ל של PBS), צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, על מנת להסיר רכיבים סרום משחיתה.

2. פירוק כדוריות הדם האדומות (RBC)

  1. להוסיף 2 מ של פירוק מאגר (אמוניום כלוריד 0.8%) לתא גלולה, מערבולת בעדינות, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.
    הערה: אם יש צורך, חזור על שלב זה.
  2. שטיפת התאים ב- PBS תיאר כאמור (1.3.).

3. החולה נגזר xenografts.

  1. להשיג הפיצוץ תאי מח עצם לאחר ההפרדה Ficoll ושלילי לאחר דלדול לימפוציטים באמצעות immunomagnetic בחירה (CD3 עבור T- ו -CD20 עבור B-לימפוציטים). בצע הוראות היצרן.
  2. להזריק 5 x 106 AML הפיצוץ תאים לתוך וריד הזנב unconditioned NSG עכברים. להשתמש בהתקן ריסון כדי להקל על הזרקת וריד הזנב. שמור עכברים בתנאים רגילים, במיוחד בתנאים ספציפיים-פתוגן נטול בכלל פעמים, על-ידי שימוש בכלובים בודדים מאוורר, על ידי מניפולציה תחת למינארי. כל שבועיים, לקחת 60 µL של דם על ידי השיטה אוסף submandibular באמצעות של המטוקריט נימי. המקום נימי לתוך מ ל סיבוב התחתית התחתונה. לעצור את הדימום על ידי הפעלת לחץ עדין באמצעות פנקס קטן גזה סטרילית. יחשוף דם עם מזרק נקי.
  3. להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר, תקופת דגירה של 5 דקות. ואז צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק לשטוף עם PBS ו centrifugre ב 300 x g למשך 5 דקות. להסיר את תגובת שיקוע, הוסף 100 µL מגניב עם 10% אלבומין שור (BSA) הכתם עם 3 האנטי-האדם µL CD45-FITC, אנטי-murine 1 µL CD45-APC דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. רחץ תא גלולה פעמיים ב- PBS (2 מ"ל) עם 10% BSA, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
  5. עד aliquot עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 µL ל- PBS לתוך צינורות cytometry זרימה.
  6. סקר engraftment כל שבועיים על ידי ניתוח chimerism של ביטוי CD45 (האדם לעומת מאתר) באמצעות cytometry זרימה(איור 2A ו- B).
  7. -הקרבה (ספירת הפיצוץ היקפיים גדול מ- 70% או חמור סימנים קליניים של מחלה), לאסוף תאי תאי הפיצוץ טחולים כתוש ומן מח עצם על ידי שטיפה tibias, עצמות הירך עם PBS כאמור תיאר13. המתת חסד עכברים מאת נקע בצוואר הרחם בעקבות הנחיות בינלאומיות.
  8. אם התא צניפה מכיל RBC, לבצע פירוק של כדוריות דם אדומות עם פירוק מאגר (שלב 2.1).
  9. רחץ תאים גלולה פעמיים ב- PBS (2 מ"ל) עם 10% BSA, צנטריפוגה ב 300 x g למשך 5 דקות.
  10. איסוף תאים ומעלה aliquot עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 µL ל- PBS לתוך צינורות cytometry זרימה.

4. מכתים

  1. להוסיף מצומדת נוגדנים (ראה צעד 4.2) ו מערבולת. תקופת דגירה תאים של 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  2. השתמש בלוח שלהלן עבור האדם ראשית או דגימות PDX המורכב של 10 µL של אנטי-CD36-FITC, 5 µL של אנטי-CD19-ECD, 5 µL של אנטי-CD33-PC5.5, 5 µL של אנטי-CD90-APC, 5 µL של אנטי-CD34-AA700, 5 µL של אנטי-CD45RA-APC-H7, 5 µL של אנטי-CD38-פסיפיק כחול, 5 µL של µL אנטי-CD123-PC7 ו- 2.5 של אנטי-CD45-קו.
  3. הסר נוגדנים לא מאוגד ע י שטיפת התאים 2 מ של PBS על ידי צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.
  4. להשעות מחדש תאים µL 450 ל- PBS לניתוח cytometric זרימה הסופי.

5. gating אסטרטגיה לניתוח cytometry זרימה

  1. מבצע רכישת נתונים (לפחות 500,000 תאים) cytometer זרימה מצויד עם לייזרים אדומים, כחול וסגול. אמת את ההגדרות cytometer כל יום עבור יישור 1) אופטי, מערכת 2) fluidic, רגישות 3) אופטי ו 4) תקינה באמצעות fluorospheres
  2. בצע את האסטרטגיה המגביל רציפים כדי להגדיר ביטוי CD38 (איור 1).
    1. השתמש תאים מדגימות רגיל מח עצם כדי להגדיר hematogones או תאים פלזמה אשר ישמש בקרה חיובית עבור ביטוי CD38.
      הערה: שער זה חשוב במיוחד להעריך כפי אוכלוסיות ה-LSC בשם הבאים תלויים הגדרתו.
    2. להגדיר סימנים מקדימים הפיזיולוגיות תאים (תאים הפיצוץ רגיל) לפי קריטריונים האוכלוסיה נמוכה (לצד פיזור) CD45dim/האס (איור 1 א'). בתוך אוכלוסייה זו הפיצוץ, להגדיר hematogones, המציגים את CD38 + + CD19 + פנוטיפ (איור 1B), לבסוף, השתמש בביטוי CD36 ו- CD33 להגדרת myeloblasts, monoblasts, erythroblasts (איור 1C). לקבוע CD34 ההבעה על hematogones כפי שמוצג (איור 1E). להעריך כמה subpopulations של סימנים מקדימים בתוך התאים הפיצוץ כהגדרתו P6-P10 (איור 1D). הפרד תא CD34 הפיצוץ תאים לתוך P6, P7, P8 קדמון subpopulations מבוסס על שערי CD38 מראש. ודא כי תא P8 מכיל הפיצוצים שיש באותה אינטנסיביות CD38 כמו hematogones, כי P6 כולל תאים אשר הם מבוססי CD38 על זריחה CD38 מינוס אחד שליטה (FMO) כי P7 תאים הם בין שתי הקיצוניויות ביחס CD38 ביטוי (איור 1D).
  3. מ את CD34 + 38-(P6) תאים מגודרת, להפריד HSC בשם ה-LSC שימוש בביטוי CD90 ו- CD45RA (איור 1F).
    הערה: פנוטיפ HSC הוא CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- ו multipotent המוצא לאגס (MPP) מוגדרים CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. פנוטיפ ה-LSC בשם זה CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + והאוכלוסייה במורד הזרם יותר בוגר שבאוכלוסיה הלימפה בשלה (LMPP) כהגדרתו CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.

6. MRD פיקוח על-ידי ה-RT-PCR

  1. לפקח על רמות MRD מאת RT-PCR כפי שתואר לעיל14.

תוצאות

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת קדמון אוכלוסיות דגימות מח העצם נורמלי וממאירים אנושי. אנחנו שנאסף של מח העצם, הטחול, ממ"ח מוצלחת וביצע cytometry זרימה multiparametric כמתואר לעיל. אנחנו לעומת מספר subpopulations של תאים הפיצוץ בין המדגם המטופל אבחון לבין את PDX המתאימים במיוחד, תא CD34 + CD38-קדמון, ובייחוד מועשר בשם ה-LSC...

Discussion

הערכה מדויקת, לשחזור של הממברנה או סמני cytoplasmic מאת cytometry זרימה דורש כי כלי הגדרות אימות כל יום עבור יישור אופטי, ראוי תפקוד של מערכת fluidic, רגישות אופטי, סטנדרטיזציה באמצעות כיול חרוזים.

זיהוי של אוכלוסיות תאים הפיצוץ ב- AML באמצעות CD90 ו- CD45RA על-ידי ניתוח cytometry זרימה רב פרמטרית היא...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הצרפתי האגודה לורט Fugain, סרטן le LigueContre (צפון מרכז), Fondation דה פראנס (ועדת לוקמיה), SIRIC Oncolille, מכון הסרטן הלאומי הצרפתי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PancollPAN-BiotechP04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)OzymeBLE420301RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  miceJACKSON LABORATORYStock No: 005557
PBSGibco by life technologies14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation BufferMACS Buffer Miltenybiotec130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)Beckman CoulterPN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)Beckman CoulterB36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)Biolegend328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)Beckman CoulterA07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)Beckman CoulterB92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) Beckton Dickinson560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)Beckman CoulterB92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)Beckman CoulterB36294
Anti-CD3-PEBeckman CoulterIM1451
Anti-CD20-PEBeckman CoulterA07747
Anti-CD123-PC7Beckman CoulterB13647
Flow-SetBeckman CoulterA63492
Flow-CheckBeckman CoulterA63493
NaviosBeckman CoulterDS-14644A
LSR Fortessa X20BD Biosciences
CST BDBD Biosciences655051
FacsFlow BD Biosciences336911
Anti-hCD45-FITCBiolegendBLE304006
Anti-mCD45-APCBiolegendBLE103112
EasySep human PE selection kitStem Cell Technologies18000
EasySep  magnet Stem Cell Technologies18551

References

  1. Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
  2. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
  3. Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
  4. van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
  5. Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
  6. Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
  7. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
  8. Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
  9. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  10. Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
  11. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  12. Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
  13. Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
  14. Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133LSChematopoiesisxenograftsPDXcytometry multiparametricMRD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved