Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Özet

Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.

Özet

Akut Miyeloid Lösemi (AML) heterojen, olduğunu ve eğer tedavi değil, ölümcül hastalık. Erişkinlerde lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, lösemi blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) bir hastalık var. Heterojenite lösemi kök hücreleri (LSC) varlığı uzanır, bu dinamik hücre ile çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bölme gelişen üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında empoze. Daha fazla LSC nüfusu tanımlamak için CD34 + CD38 hücreli bölmenin içinde normal HSCs ve multipotent ataları ayrımcılık CD90 ve CD45RA eklenmesini sağlar. Burada, biz birkaç sözde LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) aynı anda ifade algılamak için bir protokol multiparametric Akış Sitometresi tarafından birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML anahat. Ayrıca, üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı. Bu yöntem algılama ve sözde LSC miktar kemoterapi yanıt klinik izlemek için kullanılan (i.e., minimal rezidüel hastalık), kalan LSC AML nüks neden olabilir gibi.

Giriş

Akut Miyeloid Lösemi (AML) Lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) klonal bir hastalık var. Son zamanlarda, klonal heterojenite blast hücre nüfusunun aslında gelecek nesil sıralama (NGS) stratejileri kullanarak ve tümör hücreleri¹intra klonal evrimi varlığını gösteren kurulmuştur.

Heterojenite lösemik kök hücreleri (LSC) varlığı için genişletir. Bunun üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında uygulanan çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bu dinamik hücre bölümü geliştikçe onaylanmadığına karar. Bu nedenle LSC gereken geçerli kemoterapi rejimleri için dayanıklı ve derin klinik sonuçları²ile hastalık nüks aracılık. Çeşitli işaretler LSC CD123³, CLL-1⁴, CD97⁵ veya TIM-3⁶gibi karakterize etmek için tarif edilmistir. CD34 + CD38 bölmeli blast hücrelerinin LSC'yi⁷ için zenginleştirilmiş kabul edilir ancak normal HSC içerir. CD34 + CD38 uygulanan CD90 ve CD45RA ifade-(P6) yuvası (şekil 1) izin veren çeşitli aşamalarında normal ve malign hematopoetik öncüleri⁸ayırmak için. Özellikle, normal CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-hücreleri ve CD34 + CD38 gibi-CD90-CD45RA + multipotent progenitör (LMPP) astarlanmalıdır lenfoid hücrelerin AML çoğunluğu olarak belirlenen durumlarda^{8 ,9}. (MFI) ortalama Floresans yoğunluğunu CD38 CD34 + hücre bölmesi içinde dikkate alınması gereken özellikle önemlidir. CD38 yoğunluk üç yeni cep bölmeleri bunların tanımladığından: CD38 negatif (P6) CD38 dim (P7) ve CD38 parlak (P8) (şekil 1). CD38 MFI bu hücreler şiddetle CD38 hızlı gibi ya hematogones ve/veya plazma hücreleri bir iç pozitif kontrol kullanarak belirlenebilir.

İmmünyetmezligi başını SALLAMAK/SCID/IL2Rγc^null (NSG) fare modeli normal engraftment için yaygın olarak kullanılır ve^10,11kötü huylu insan hematopoetik hücreler. Seri xenotransplantation deneyleri deneysel LSC veya HSC işlevini doğrulamak için kullanılır. Bu çalışmalar geniş büyük ölçekli sıralama yaklaşımlar tarafından analiz edilmiştir. Yine de, daha az onun birincil AML (Şekil 2) karşılaştırıldığında NSG fareler içine engrafted AML patlama nüfus LSC ve HSC immunophenotype hakkında bilinir.

LSC sayıda böylece doğal olarak düşük, kimlik ve LSC miktar zor olan ve burada anlatılan yöntemi bir akış sitometrik tahlil tanı ve klinik takip (kalıntı LSC olabilir gibi kemoterapi yanıtı değerlendirmek için kullanılıyor olabileceği AML relapse) neden. LSC varlığı olumlu minimal rezidüel hastalık (MRD) gösterebilir. Bugüne kadar MRD AML içinde çoğunlukla izleme itimat moleküler yöntemler (Yani, RT-PCR, NGS)^10,12. Ancak, bu protokol için biz aynı anda protein ifade çeşitli HSC/LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML multiparametric Akış Sitometresi^2,8,9tarafından tespit. Antikorlar bu arada herhangi bir standart Akış Sitometresi laboratuvarda uygulanabilir ve bu akışı MRD tahlil özellikle ilginç olduğunda MRD tarafından gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) mümkün değildir Yani, eğer lösemi özel moleküler işaretleyicileri tanılama AML örnekte algılanabilir değildir. Ayrıca, bu iletişim kuralını, daha hassas moleküler MRD teknikleri için tamamlayıcı bu tespit ve anormal hematopoetik progenitör hücre ölçmek için amaç gibi temsil eden bir işlev hücre karakteristik (şekil 3).

Akış Sitometresi ile antikor klinik laboratuvarlar çoğunda kullanılabilir tarafından üç hematopoetik progenitör nüfus ve sözde LSC yuvası ile farklı olgunlaşma derecesini ölçmek için nasıl gösterir. Ayrıca, bu hücre bölmeleri içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts (PDX) varlığını doğruladı ve tedavi takip.

Protokol

Avrupa standartlarında bilimsel amaçlar için hayvan kullanımı için takip ediyoruz. Bu çalışmada yerel Etik Komitesi (#3097-2015120414583482v3) tarafından kabul edildi.

1. numune hazırlama

1. Kemik iliği (2 mL) de novo AML antikoagülan ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren tüpler 1.8 mg-mL kemik iliği bir konsantrasyon, toplamak.
2. Ficoll ayırma, alyuvar ve granülosit, mononükleer hücreler olarak izole etmek için yoğunluğu bir degrade renk ayrımı gerçekleştirin. Kemik iliği fosfat tampon tuz 3 cilt olarak sulandırmak (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 1.8 mM). Dikkatle Ficoll 1 hacmi ile seyreltilmiş kemik iliği 1 birim yerleşimi. 300 x g fren olmadan 30 dakika çevir. İltihap hücrelerinin beyaz buffy önlük katman yeni bir steril tüp içine aktarın.
3. PBS 10 mL hücrelerde iki kez yıkamak) ve santrifüj kapasitesi 300 x g 5 min için de bulaşıcı serum bileşenleri kaldırmak için.

2. lizis kırmızı kan hücrelerinin (RBC)

1. 2 mL lizis arabelleği (amonyum klorür % 0.8) hücreye ekleme cips, girdap yavaşça ve 5 dk. santrifüj 300 x g 5 min için de oda sıcaklığında kuluçkaya.
   Not: gerekirse, bu adımı yineleyin.
2. PBS hücrelerde yıkama daha önce (1.3.) açıklandığı gibi.

3. hasta xenografts türetilmiş.

1. Blast hücreler kemik iliği Ficoll ayrılıktan sonra elde etmek ve sonra lenfositler tükenmesi immunomagnetic kullanarak seçimi negatif (CD3 T-ve CD20 B lenfositler için). Üreticinin yönergeleri izleyin.
2. 5 x 10⁶ AML blast hücre koşulsuz NSG fare kuyruğu damar içine enjekte. Kuyruk ven enjeksiyon kolaylaştırmak için bir yasaklama aygıtı kullanın. Fareler konvansiyonel koşullar altında ve özellikle özel patojen ücretsiz koşullar altında tüm zamanlarda, bireysel havalandırılmış kafesleri kullanarak ve manipülasyon laminar akış başlık altında tutun. İki haftada bir Hematokrit kullanarak çene toplama yöntemi tarafından 60 µL kan kılcal al. Yer içine 5 mL kılcal yuvarlak alt tüp. Taşma payı küçük steril gazlı bez panelini kullanma hafif basınç uygulayarak durdurmak. Temiz bir şırınga ile Ermeniyi kan.
3. 1 ml lizis arabellek ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. O zaman 300 x g 5 dk. yıkama PBS ve 300 x g de centrifugre ile de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant ekle 100 µL PBS ile 3 µL Anti-insan CD45 FITC ve 1 µL Anti-fare ile % 10 sığır serum albumin (BSA) leke kaldırmak CD45 APC ve 4° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya.
4. Hücre Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve 5 min için 300 x g, santrifüj ile yıkayın.
5. PBS 100 µL Akış Sitometresi tüpler içine başına 1 x 10⁶ hücre e aliquot kadar.
6. Anket engraftment iki haftada chimerism analizi tarafından CD45 ifade (insan karşı fare) Akış Sitometresi (şekil 2A ve B) kullanarak.
7. Kurban (periferik blast sayısı % 70 veya klinik belirtileri şiddetli hastalık büyük), mononükleer blast hücre ezilmiş dalağı ve kemik iliği yırtılmalarıteşhis temizlenerek toplamak ve uyluk PBS ile daha önce¹³açıklandığı gibi. Fareler tarafından servikal çıkığı uluslararası yönergeleri izleyerek ötenazi.
8. Hücre Pelet RBC içeriyorsa, kırmızı kan hücre lizis arabelleği (Adım 2.1) ile lizis gerçekleştirin.
9. Hücreleri Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve santrifüj vasıl 300 x g ile 5 dakika yıkayın.
10. PBS 100 µL başına 1 x 10⁶ hücre için hücre ve aliquot yukarı Akış Sitometresi tüpler içine toplamak.

4. boyama

1. (Bkz. Adım 4.2) konjuge antikorlar ve girdap ekleyin. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya.
2. İnsan İlköğretim veya oluşan anti-CD36-FITC 10 µL, anti-CD19-ECD 5 µL, 5 µL anti-CD33-PC5.5, anti-CD90-APC 5 µL, anti-CD34-AA700, anti-CD45RA-APC-H7 5 µL, anti-CD38-Pasifik mavi, 5 µL 5 µL 5 µL PDX örnekleri için aşağıdaki panelini kullanın anti-CD45-KO Anti-CD123-PC7 ve 2.5 µL.
3. İlişkisiz antikorlar PBS 2 mL aralıklarla 300 x g 5 min için de tarafından hücrelerde yıkayarak çıkarın.
4. PBS 450 µL son akış sitometrik çözümlemesi için hücreleri yeniden askıya alma.

5. Akış Sitometresi Analizi için strateji geçişi

1. Veri toplama (en az 500.000 hücreleri) kırmızı, mavi ve mor lazerler ile donatılmış bir Akış Sitometresi gerçekleştirin. Her gün için 1) optik uyum, 2) sıvı sistemi, 3) optik duyarlılık ve 4) standardizasyon Flüorosferlerini kullanan sitometresi ayarlarını doğrulayın
2. (Şekil 1) CD38 ifadesi tanımlamak için sıralı gating strateji izleyin.
   1. Normal kemik iliği örnekleri hücrelerden hematogones veya CD38 ifade için olumlu denetim işlevi görecek plazma hücreleri tanımlamak için kullanın.
      Not: Bu kapı sonraki sözde LSC nüfus onun tanımına bağlı olarak değerlendirmek özellikle önemlidir.
   2. Fizyolojik değişimler hücreleri (normal blast hücreler) CD45dim/SSC (yan dağılım) düşük nüfus kriteri (şekil 1A) tanımlayın. Bu patlama nüfus içinde bir CD38 görüntülemek hematogones tanımlamak ++ CD19 + fenotip (şekil 1B) ve son olarak, myeloblasts, sarkomlardan ve erythroblasts (şekil 1 c) tanımlamak için CD36 ve CD33 ifade kullanırsınız. CD34 ifadesini hematogones üzerinde (şekil 1Eiçinde) gösterildiği gibi belirleyin. Birkaç patlama P6-P10 (şekil 1 d) tanımlanan hücreleri içinde öncüleri altgrupları değerlendirmek. P6, P7, önceden ayarlanmış CD38 gates dayalı P8 progenitör altgrupları blast hücre CD34 bölmesine ayırın. P8 yuvası P6 CD38-eksi bir (FMO) denetim CD38 Floresans dayalı olan hücreleri içeren hematogones olarak aynı CD38 yoğunluk var patlamaların içerir ve P7 hücreleri CD38 ile ilgili olarak iki uç arasında çoğu olun ifade (şekil 1 d).
3. CD34 + 38-(P6) CD90 ve CD45RA ifade (şekil 1F) kullanarak sözde LSC HSC ayrı Geçitli hücreler.
   Not: HSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90 + CD45RA- ve multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38 tanımlanan-CD90 - CD45RA-. Sözde LSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90dimCD45RA + ve daha olgunlaşmamış aşağı akım nüfus CD34 + CD38 tanımlanan lenfoid astarlanmalıdır ataları (LMPP) vardır-CD90-CD45RA +.

6. MRD RT-PCR ile izleme

1. MRD düzeyleri tarafından RT-PCR¹⁴daha önce açıklandığı gibi izlemek.

Sonuçlar

Burada yaratıcı nüfus normal ve kötü huylu insan kemik iliği örneklerinde belirlemek için bir yöntem mevcut. Kemik iliği ve dalak başarılı bir PDX toplanan ve multiparametric Akış Sitometresi yukarıda açıklandığı gibi yapılır. Biz birkaç blast hücreler arasında tanı hasta örnek ve karşılık gelen PDX ve özellikle, CD34 + CD38 progenitör yuvası, özellikle sözde LSC zenginleştirilmiş altgrupları göre. Biz CD34 + CD38-şok kesir PDX tanılama hasta örnek (%3,48 %0,53,

Tartışmalar

Enstrüman ayarlarını her gün optik uyum, sıvı sistemi, optik duyarlılık ve standardizasyon işlevlerin doğru için doğrulanır membran veya Akış Sitometresi tarafından sitoplazmik işaretleri doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi gerektirir kalibrasyon boncuk kullanarak.

CD90 ve CD45RA göre çok parametrik Akış Sitometresi Analizi kullanarak AML blast hücre popülasyonlarının tespiti nispeten basit ve güvenilir bir yöntemdir. Bu analizi kritik bir adımda doğru CD3...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551