Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Zusammenfassung

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Zusammenfassung

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist eine heterogene, und wenn Sie nicht behandelt, tödliche Krankheit. Es ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit bei Erwachsenen. AML ist zunächst eine Erkrankung des blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Ansammlung der Leukämiezellen Blast, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von Leukämie-Stammzellen (LSC), mit dieser dynamischen Zelle Fach weiterentwickelt wird, um verschiedene Auswahl-Druck zu überwinden während Leukämie Progression und Behandlung auferlegt. Um die LSC-Bevölkerung weiter zu definieren, ermöglicht das Hinzufügen von CD90 und CD45RA die Diskriminierung von normalen HSCs und multipotenten Vorläuferzellen innerhalb der CD34 + CD38 Zellkompartiment. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck mehrere vermeintliche LSC-Marker (CD34, CD38, CD45RA, CD90) zu erkennen am primären Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Durchflusszytometrie. Darüber hinaus zeigen wir, wie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate. Diese Methode zur Erkennung und Quantifizierung von vermeintlichen LSC für die klinische Weiterbehandlung der Chemotherapie Antwort verwendet werden (zB., minimaler Resterkrankung), als passives LSC AML Rückfall verursachen.

Einleitung

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit. AML ist zunächst eine klonale Erkrankung der blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Anhäufung von Blasten, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Vor kurzem wurde klonale Heterogenität der Explosion Zellpopulation im Wesentlichen durch die Verwendung der nächsten Generation Sequencing (NGS) Strategien und zeigen die Existenz der Intra klonale Evolution von Tumor-Zellen¹gegründet.

Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von leukämischen Stammzellen (LSC). Es wird vermutet, die diese dynamische Zellkompartiment entwickelt, um verschiedene Auswahl Druck auferlegt bei Leukämie Progression und Behandlung zu überwinden. Daher LSC sollen resistent gegenüber aktuellen chemotherapeutischen Therapien und Krankheit Rückfall mit profunden klinischen Implikationen²zu vermitteln. Verschiedene Marker wurden zur Charakterisierung von LSC wie CD123³, CLL-1⁴, CD97⁵ oder TIM-3⁶beschrieben. CD34 + CD38-Abteil des Blastenzellen gilt für LSC⁷ angereichert werden aber auch normale HSC. CD90 und CD45RA Ausdruck angewendet, die CD34 + CD38-Fach (P6) (Abbildung 1) ermöglicht es, um mehrere Stufen von normalen und malignen hämatopoetischen Vorläufer⁸zu trennen. Speziell, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent Vorfahre (MPP) wie CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-Zellen und CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP) Zellen, in der Mehrzahl der AML ermittelt werden Fälle^{8 ,9}. Der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD38 ist besonders wichtig, innerhalb der CD34 + Zellkompartiment berücksichtigt werden. Da CD38 Intensität drei neue Zelle Fächer davon definiert: CD38 negativ (P6), CD38 Dim (P7) und CD38 hell (P8) (Abbildung 1). Die MFI CD38 kann entweder Hematogones und/oder Plasmazellen als interne positive Kontrolle mit, wie diese Zellen stark CD38 ausdrücken bestimmt werden.

Die immungeschwächte NOD/SCID/IL2Rγc^null (NSG) Maus-Modell ist weit verbreitet für Engraftment des normalen und bösartigen Menschen hämatopoetischen Zellen^10,11. Serielle Xenotransplantation Assays werden verwendet, um experimentell LSC oder HSC-Funktion überprüfen. Diese Studien wurden weitgehend durch groß angelegte Sequenzierung Ansätze analysiert. Dennoch ist weniger über die LSC und HSC Immunophenotype AML Explosion Bevölkerung pfropfte in NSG-Mäuse im Vergleich zu seiner primären AML (Abbildung 2) bekannt.

Die Zahl der LSC sind somit von Natur aus niedrigen, Identifizierung und Quantifizierung der LSC sind anspruchsvoll und die hier beschriebene Methode verwendet werden als ein Fluss durchflusszytometrischen Assay zum Zeitpunkt der Diagnose und bei klinischen Folgen bis Chemotherapie Antwort bewerten (wie passives LSC kann verursachen Sie AML Rückfall). Das Vorhandensein von LSC möglicherweise positiven minimalen Resterkrankung (MRD). Bis dato MRD Überwachung in AML meist verlassen Sie sich auf molekulare Methoden (d.h., RT-PCR, NGS)^10,12. Jedoch in diesem Protokoll erkennen wir gleichzeitige Protein-Expression von mehreren HSC/LSC-Markern (CD34, CD38, CD45RA, CD90) auf primäre Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Flow Cytometry^2,8,9. Diese Kombination von Antikörpern kann in jedem standard Flow Cytometry Labor angewendet werden und dieser Fluss-MRD-Assay ist besonders interessant, wenn MRD durch Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nicht möglich ist, d. h., wenn Leukämie spezifische molekulare Marker sind nicht in die Diagnose AML Probe nachweisbar. Darüber hinaus ist dieses Protokolls komplementär zu empfindlicheren molekularen MRD-Verfahren, da es darum geht zu erkennen und zu quantifizieren, die abnorme hämatopoetischen Vorläuferzellen die repräsentiert einer funktionelle Zelle-Eigenschaft (Abbildung 3).

Wir zeigen, wie Sie drei hämatopoetischen Vorläuferzellen Populationen und die vermeintliche LSC-Fach mit unterschiedlichen Grad der Reifung durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern zur Verfügung, in der Mehrzahl der klinischen Labors zu quantifizieren. Darüber hinaus wir bestätigte das Vorhandensein dieser Zelle Abteilungen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate (PDX) und bei der Behandlung verfolgen.

Protokoll

Wir folgen Europäische Normen für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission (#3097-2015120414583482v3) genehmigt.

1. die Probenvorbereitung

1. Knochenmark (2 mL) von de Novo AML in Röhrchen mit Antikoagulanzien Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in einer Konzentration von 1,8 mg / mL Knochenmark zu sammeln.
2. Durchzuführen Sie Ficoll Trennung, eine Steigung Dichtetrennung Mononukleäre Zellen von Erythrozyten und Granulozyten, zu isolieren, wie folgt. Verdünnen Sie Knochenmark in 3 Bänden von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS: NaCl 137 mM, KCl-2,7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 1,8 mM). 1 Volumen von Ficoll mit 1 Volumen von verdünnten Knochenmark sorgfältig zu überlagern. 30 Minuten bei 300 X g ohne Bremse zu spinnen. Übertragen Sie die weißen buffy Coat Schicht Mononucleated Zellen in ein neues steriles Röhrchen.
3. Waschen Sie Zellen zweimal in 10 mL PBS) und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min um kontaminierende Serumkomponenten zu entfernen.

2. lyse der Erythrozyten (RBC)

1. Hinzufügen von 2 mL Lyse-Puffer (Ammoniumchlorid 0,8 %) für die Zelle Pellets, Wirbel sanft und in 5 min. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   Hinweis: Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt.
2. Wie zuvor beschriebenen Wash Zellen mit PBS-Puffer (1.3.).

3. Patienten abgeleitet Xenotransplantate.

1. Blast-Zellen aus dem Knochenmark nach Ficoll Trennung erhalten und nach Erschöpfung der Lymphozyten mit Immunomagnetic negative Auswahl (CD3 für t- und CD20 für B-Lymphozyten). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
2. 5 x 10⁶ AML Blasten in die Rute Vene unbedingte NSG Mäuse zu injizieren. Verwenden Sie eine Haltevorrichtung Schweif Vene Injektion zu erleichtern. Halten Sie Mäuse unter herkömmlichen Bedingungen und vor allem unter spezifischen-Pathogen-freies Bedingungen überhaupt, Zeiten, indem einzelne belüftete Käfige und Manipulation unter Laminar-Flow-Haube. Nehmen Sie alle zwei Wochen 60 µL Blut durch die submandibulären Sammlung-Methode mit einem Hämatokrit Kapillaren. Ort der Kapillare in 5 mL Runde Unterrohr. Stoppen Sie die Blutung durch sanften Druck mit einem kleinen sterilen Tupfer. Ausspülung Blut mit einer sauberen Spritze.
3. Fügen Sie 1ml Lyse-Puffer und 5min inkubieren. Dann für 5 Minuten bei 300 X g für 5min. Waschen mit PBS und Centrifugre bei 300 X g zentrifugieren. Entfernen Sie überstand, Add 100 µL PBS mit 10 % Rinderserumalbumin (BSA) Fleck mit 3 µL Anti-Human CD45-FITC und 1 µL Anti-Murine CD45-APC und 30 Minuten bei 4 ° C inkubieren.
4. Waschen Sie Zelle Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
5. Aliquoten bis zu 1 x 10⁶ Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.
6. Umfrage Engraftment alle zwei Wochen durch Chimerism Analyse von CD45 Ausdruck (menschliche gegen murine) mittels Durchflusszytometrie (Abb. 2A und B).
7. Unter Opfern (periphere Explosion Count größer als 70 % oder schweren klinischen Anzeichen der Krankheit), sammeln Sie mononukleären Blasten aus zerkleinerten Milz und Knochenmark durch Spülung Tibien und Oberschenkelknochen mit PBS wie oben beschrieben¹³. Einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation nach internationalen Richtlinien.
8. Wenn Zelle Pellet RBC enthält, führen Sie lyse der roten Blutkörperchen mit Lyse Puffer (Schritt 2.1).
9. Waschen Sie Zellen Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
10. Sammeln Sie Zellen und aliquoten bis zu 1 x 10⁶ Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.

(4) Färbung

1. Fügen Sie konjugierten Antikörpern (siehe Schritt 4.2) und Wirbel. Inkubieren Sie Zellen für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
2. Verwenden Sie das folgende Panel für menschliche Grund- oder PDX Proben bestehend aus 10 µL Anti-CD36-FITC, 5 µL des Anti-CD19-ECD, 5 µL Anti-CD33-PC5.5, 5 µL Anti-CD90-APC, 5 µL Anti-CD34-AA700, 5 µL Anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL Anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL Anti-CD123-PC7 und 2,5 µL Anti-CD45-KO.
3. Ungebundenen Antikörper durch die Zellen in 2 mL PBS durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min waschen zu entfernen.
4. Wieder aussetzen Sie Zellen in 450 µL PBS für endgültige durchflusszytometrischen Analyse.

5. gating Strategie für Flow-Zytometrie-Analyse

1. Durchführen Sie Datenerfassung (mindestens 500.000 Zellen) auf einem Durchflusszytometer ausgestattet mit roten, blauen und violetten Lasern. Überprüfen Sie die Einstellungen der Cytometer täglich für 1) optische Ausrichtung, 2) fluidische System und (3) optische Empfindlichkeit 4) Standardisierung mit fluorospheres
2. Folgen Sie der sequentiellen gating Strategie definieren CD38 Ausdruck (Abbildung 1).
   1. Verwenden Sie Zellen von normalen Knochenmarkproben zur Definition Hematogones oder Plasma-Zellen dienen als Positivkontrolle für CD38 Ausdruck.
      Hinweis: dieses Tor ist vor allem wichtig zu beurteilen, da seine Definition anschließenden vermeintlichen LSC Bevölkerung abhängen.
   2. CD45dim/SSC (Side Scatter) geringe Bevölkerungsdichte Kriterien (Abbildung 1A) physiologische Vorläufer Zellen (normale Blasten) eingrenzen. Innerhalb dieser Population Explosion definieren Hematogones, die eine CD38 anzeigen ++ CD19 + Phänotyp (Abbildung 1 b) und schließlich CD36 und CD33 Ausdruck verwenden, um Myeloblasts, Monoblasts und Erythroblasts (Abbildung 1) zu definieren. CD34 Ausdruck auf Hematogones zu bestimmen, wie in (Abbildung 1E) dargestellt. Bewerten Sie mehrere Subpopulationen von Vorstufen innerhalb der Blasten definiert als P6-P10 (Abbildung 1). Trennen Sie das CD34-Fach von Blasten in P6, P7, P8 Stammvater Subpopulationen basierend auf vordefinierten CD38 Tore. Sicherstellen Sie, dass die P8-Fach die Blasten, die die gleiche CD38 Intensität wie die Hematogones enthält, dass P6 Zellen enthält die CD38-basierend auf die CD38 Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrolle und P7 Zellen zwischen den beiden extremen hinsichtlich CD38 sind Ausdruck (Abbildung 1).
3. Die CD34 + 38-(P6) trennen geschlossene Zellen HSC aus vermeintlichen LSC mit CD90 und CD45RA Ausdruck (Abb. 1F).
   Hinweis: der HSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- und die multipotent Vorfahre (MPP) sind definiert als CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Der vermeintliche LSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + und mehr unreife nachgelagerten Bevölkerung sind die lymphatischen grundiert Vorfahre (LMPP) definiert als CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.

(6) MRD Überwachung durch RT-PCR

1. Überwachen Sie durch RT-PCR, wie zuvor beschrieben¹⁴MRD.

Ergebnisse

Hier präsentieren wir eine Methode zum Stammvater Populationen in normalen und bösartigen menschlichen Knochenmarkproben zu bestimmen. Wir sammelten Knochenmark und Milz von einer erfolgreichen PDX und multiparametric Durchflusszytometrie durchgeführt, wie oben beschrieben. Wir verglichen mehrere Subpopulationen von Blasten zwischen der diagnostischen Patientenprobe und die entsprechenden PDX und insbesondere das CD34 + CD38-Vorläuferzellen Fach, vor allem in vermeintlichen LSC bereichert. Wir haben festgestellt, das...

Diskussion

Eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Membran oder zytoplasmatischen Marker durch Durchflusszytometrie erfordert, dass Geräteeinstellungen für optische Ausrichtung, das ordnungsgemäße Funktionieren der fluidische System, optische Empfindlichkeit und Standardisierung täglich überprüft werden unter Verwendung der Kalibrierung Korne.

Nachweis von Blast Zell-Populationen in AML mit CD90 und CD45RA durch multiparametrischen Flow-Zytometrie-Analyse ist eine relativ einfache und zuve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551