JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.

Abstract

زيكا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا الفيروسات تنتقل عن طريق البعوض، تسبب الأمراض مع أعراض المريض مشابهة. ومع ذلك، لديها إمكانات نقل مريض للمتلقين للمعلومات المختلفة، وتتطلب علاجات المريض مختلفة جداً. وهكذا، تفشي Zika مؤخرا تجعل من الملح على تطوير الأدوات التي تميز سرعة هذه الفيروسات في المرضى والمحاصرين البعوض، لتحديد علاج المريض الصحيح، وفهم وإدارة تلك الأوبئة في الوقت الحقيقي.

للأسف، الاختبارات التشخيصية الحالية، بما في ذلك تلك الطوارئ 2016 المستقبلة استخدام أذون والسريع حالة، كشف الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR)، الأمر الذي يتطلب أجهزة القياس، تدريب المستخدمين، و إعداد عينة كبيرة. وهكذا، يجب أن ترسل إلى مختبرات مرجعية "المعتمدة"، التي تحتاج إلى وقت. وفي الواقع، في آب/أغسطس عام 2016، المركز لمراقبة الأمراض كان يسأل النساء الحوامل الذين كان عضات البعوض ووضع طفح جلدي تشير إلى Zika الانتظار أمر غير مقبول من 2 إلى 4 أسابيع قبل التعلم ما إذا كانوا مصابين. نحن بحاجة إلى الاختبارات التي يمكن القيام به في الموقع، مع القليل من الموارد والأفراد المدربين ولكن ليس بالضرورة مرخصة كثيرا جداً.

ويوضح هذا الفيديو مقايسة يفي بتلك المواصفات، وتعمل مع البول أو المصل (بالنسبة للمرضى) أو ذبائح سحق البعوض (للمراقبة البيئية)، كل ذلك دون إعداد عينة كثيرا. يتم التقاط جثث البعوض على ورقة تحمل رباعي الأمونيوم المجموعات (س-الورق) تليها المعاملة الأمونيا لإدارة ندركها. هذه بعد ذلك مباشرة، دون عزل الحمض النووي الريبي، توضع في أنابيب المقايسة تتضمن المعصوفه الكواشف التي تحتاج إلى لا سلسلة التبريد. وتنتج صيغة معدلة من النسخ العكسي بوساطة حلقة التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة فلوريسسينتلي كلمات محددة الهدف قراءات، في 30 دقيقة، كإشارة fluorescence ألوان. وهذا هو تصور مع جهاز محمول باليد، والبطارية مع عامل تصفية اللون برتقالي. يتم منع التلوث إلى الأمام مع أنابيب مختومة، واستعمال اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA glycosylase (UDG) حضور dUTP في خليط التضخيم.

Introduction

إصابات الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وفيروسات Zika على استراتيجيات الإدارة الفورية الارتفاع والطلب. فيروسات حمى الضنك وداء شيكونغونيا بالفعل المستوطنة في كثير من المناطق المدارية حيث ينتشر الآن Zika في نصف الكرة الغربي1. فيروس زكى، مثل حمى الضنك، أحد أفراد عائلة فيروسات مصفرة والأصلية لأفريقيا مع آسيا واحد واثنين من السلالات الجينية الأفريقية2. على الرغم من أن تحديد هوية الفيروس Zika يعود تاريخها إلى عام 1947، ما زالت العدوى Zika في البشر متفرقة لنصف قرن قبل الناشئة في منطقة المحيط الهادئ والأمريكتين. أول اندلاع المبلغ عنها من Zika حمى وقع في جزيرة ياب في ولايات ميكرونيزيا الموحدة في عام 2007، تليها بولينيزيا الفرنسية في عام 2013 و 2014. حدث اندلاع الرئيسية الأولى في الأمريكتين بحلول عام 2015 في البرازيل.

فيروسات زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تنتقل أساسا Aedes albopictusو بعوض الزاعجة المصرية . ومع ذلك، قد Zika إمكانيات إضافية انتقال البشر إلى المصب، المحتمل أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي، وتفاعل الأم إلى الجنين، وعن طريق الرضاعة الطبيعية3،،من45. ويعتقد حمى زيكا أولاً تسبب المرض خفيفة فقط. بيد أنه في وقت لاحق المرتبطة بمتلازمة غيلان باريه في البالغين، وصغر الرأس في المواليد الجدد، والأمراض العضلية الهيكلية المزمنة التي قد الأشهر الأخيرة لسنوات. يمكن أن يكون تحديا تشخيص المرض Zika، نظراً لأعراض عدوى Zika مماثلة لتلك التي ل انتشار البعوض فيروسات أخرى6. الالتهابات المشارك المشتركة من هذه الفيروسات تجعل تشخيص تفاضلية أكثر تحديا7،8. ولذلك، مطلوب الكشف السريع والموثوق بها من الأحماض النووية من Zika وغيره من الفيروسات لفهم وبائيات في الوقت الحقيقي، والشروع في المراقبة، والتدابير الوقائية، وإدارة رعاية المرضى9.

وتشمل الاختبارات التشخيصية الحالية لهذه الفيروسات PCR النسخ العكسي (RT-PCR) وتسلسل الفيروس، الاختبارات المصلية وعزل الفيروس. النهج المصلية القياسية غالباً ما يعانون من حساسية غير كافية والنتائج يمكن أن تكون تعقدت ه في المرضى الذين أصيبوا سابقا بأخرى فلافيفيروسيس.

ولذلك، اختبار الحمض النووي يظل الطريقة الأكثر موثوقية لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات. عادة ما يتم إجراء الكشف عن زيكا وغيره من الفيروسات المنقولة بالبعوض باستخدام الرايت-بكر أو RT-PCR الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية، مثل مصل الدم والبول واللعاب، السائل المنوي، وحليب الثدي و السائل الدماغي10،11. عينات البول واللعاب المفضل عموما عبر الدم، حيث أنها تظهر أقل PCR-تثبيط، أعلى الأحمال الفيروسية، وجود الفيروس لفترات أطول من الوقت، وزيادة سهولة جمع ومعالجة12،13. ومع ذلك، تشمل الرايت-بكر-تعتمد الاختبارات التشخيصية، خطوات إعداد عينة واسعة ومكلفة معدات الدراجات الحرارية، يجعلها أقل الأمثل للنقطة من الرعاية.

عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) برز كبديل RT-PCR قوية نظراً لحساسية عالية وخصوصية14، التسامح للمواد المثبطة في البيولوجية عينات15، و العملية في درجة حرارة واحدة، والتي إلى حد كبير يخفض الاعتداء التعقيد والتكاليف المرتبطة بها، يجعلها مناسبة للبيئات قليلة الموارد. RT-مصباح، كما أنه ينفذ تقليديا، تضم ستة أجهزة الإشعال التي تربط إلى ثماني مناطق متميزة ضمن هدف الجيش الملكي النيبالي. أنه يعمل في درجات حرارة ثابتة بين 60 و 70 درجة مئوية، ويستخدم المنتسخة العكسية وبوليميراز الدنا مع حبلا قويا مما أدى إلى تشريد النشاط.

أثناء المراحل الأولية من مصباح RT، الإشعال الداخلية إلى الأمام والخلف (FIP والمقاضاة، الشكل 1A) جنبا إلى جنب مع الإشعال إلى الأمام والخلف الخارجي (F3 و B3) تشكيل هيكل دمبل، هيكل البذور من الأسى مصباح التضخيم. التضخيم هو كذلك عجلت بها حلقة إلى الأمام والخلف الإشعال (LF ورطل)، التي تهدف إلى ربط مناطق واحد الذين تقطعت بهم السبل الدمبل، والنتائج في تشكيل كونكاتيميرس مع تكرار متعددة الحلقات16. مصباح الكلاسيكية فحوصات التعكر على أساس أو قراءات من الحمض النووي إينتيركالاتينج الأصباغ ليست ملائمة تماما للكشف عن نقطة من الرعاية من زكى، حيث يكون مستوى معين من الإرسال المتعدد المطلوب17،18،19. الإرسال المتعدد هو عدم الحصول عليها بسهولة في هذه النظم، كما أنها عرضه لتوليد إيجابيات كاذبة بسبب إيضاحات مسهبة خارج الهدف.

لإدارة هذه المسائل، يضيف الأدب عنصر إضافي في شكل "المسبار مما أدى إلى تشريد حبلا" إلى الكلاسيكية RT-مصباح العمارة20،،من2122. كل مسبار بمنطقة ستراند المزدوجة الخاصة بتسلسل ومنطقة فتيلة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل. هو معلم التحقيق مع منطقة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل مع 5 '--فلوروفوري، وهو تعديل التحقيق التكميلية مع يحتوي 3' في نهاية. نظراً لغياب الهدف، يلاحظ لا الأسفار بسبب تهجين خيوط التحقيق التكميلي، الذي يجمع فلوروفوري وتقضي إلى مقربة. حضور هدفا، جزء واحد-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق الفلورسنت يربط إلى مجموعتها على الهدف، ومن ثم مددت حبلا مما أدى إلى تشريد بوليميريز. تمديد بوليميريز بعكس كبسولة تفجير يسبب فصل حبلا يحتوي من به حبلا المسمى فلوريسسينتلي تكميلية، السماح لانبعاثات الأسفار (1B الشكل). مع هذا التصميم، يتم إنشاء الإشارة بعد تشكيل الدمبل، تقليل فرص إشارات إيجابية كاذبة.

يمكن جزء مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق مما أدى إلى تشريد حبلا أي تسلسل، وعندما يتم تطبيق الإرسال المتعدد، يمكن استخدام نفس تسلسل مع أزواج يحتوي فلوروفوري مختلفة. مع هذا الهندسة المعمارية أو البول الملوث بالفيروس أو المصل أو البعوض أدخلت عينات مسحوق على الورق مباشرة للمقايسة دون تحضير العينة. Read-outs fluorescence ألوان مرئياً للعين البشرية تم إنشاؤها ضمن 30-45 دقيقة، وكانت تصور إشارات بمربع طباعة 3D مراقبة التي تستخدم الصمام أزرق وعامل تصفية اللون برتقالي. التجميد الكواشف RT-مصباح تمكين نشر هذه المجموعة على خفض إعدادات المورد دون حاجة للتبريد.

Protocol

ملاحظة: البعوض كانت الحيوانات فقط مباشرة المستخدمة في هذه الدراسة. وافق الإجراءات لإدارة الدجاج، والدم التي تستخدم لتغذية البعوض المصاب، كبروتوكول إياكوك #201507682 نشر مؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة فلوريدا، واستخدام Committee.Virus وكانت دراسات عدوى البعوض المنجزة في مرفق BSL-3 من "مختبر علم الحشرات الطبية في فلوريدا" في فيرو بيتش، أجريت تجارب سائلة RT-مصباح في مختبر BSL-2 المشتركة فام وفايربيرد LLC العلوم الجزيئية البيولوجية في الاتشوا، فلوريدا.

1-تصميم أجهزة الإشعال وحبلا مما أدى إلى تشريد المسابر

  1. استخراج تسلسل الفيروسية للضنك 1 من قاعدة بيانات معهد واسع23؛ تسلسل زكى وداء شيكونغونيا من نييد الفيروس الممرض قاعدة البيانات وتحليل الموارد24.
    1. قم بإنشاء عدة تسلسل التحالفات (MSAs) لمتواليات من اهتمام باستخدام برمجيات العضلات v3.8.3125. استخدام اتفاقات الخدمات الإدارية التي تم إنشاؤها للبحث عن مجموعات الإشعال المصباح داخل منطقة مصانة من الهدف، وتجنب الأهداف غير ذات صلة أو غير المقصودة، مثل التمييز بين الأنواع الفرعية لهدف.
  2. اتباع قواعد التصميم للإشعال المصباح كما هو موضح على الإنترنت (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/)، والسماح باستخدام القواعد المختلطة في كبسولة تفجير لتغطية اختلاف الفيروس26. لتجنب ه مجموعات التمهيدي، قارن الإشعال المصباح الذي تم إنشاؤه لقاعدة بيانات الفيروسات "رنا نكبي" استخدام "الانفجار نكبي"27. قارن بين كل مجموعة للقضاء على الإشعال التي سوف ديميريزي في مقايسة متعدد باستخدام "الانفجار نكبي" كذلك.
  3. الشاشة جزء مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق مما أدى إلى تشريد حبلا ضد أي تسلسل الجينوم الفيروسي وتسلسل الجينوم البعوض. تعديل 5 '-ينتهي تحقيق ملزم الهدف مع فلوريسسين أميديتي (الاتحاد الماليزي) وصبغ HEX وصبغ 5-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) Zika والشيكونغونيا وحمى الضنك 1، على التوالي.
    1. وتشمل تمهيدي مراقبة إيجابية لعينات البول. تصميم الإشعال المصباح لاستهداف الحمض النووي البشري. التسمية مما أدى إلى تشريد حبلا التحقيق مع تيت في 5 '--نهاية. المسمى تسمية يحتوي المسابير التي تكمل جزئيا لكل فلوريسسينتلي التحقيق مع (مثلاً، آيوا الأسود-الرمزية) يحتوي على 3 '-نهاية (الجدول 1).

2-فيروس يعزل وإصابة عينات البعوض

  1. استخدام يعزل الفيروس Zika (سلالة بورتوريكو)، وفيروس الشيكونغونيا (La Réunion أو جزر فرجن البريطانية السلالة) وفيروس حمى الدنج النمط المصلي المسيطر-1 (السلالة الغربية الرئيسية). تحديد التتر الفيروسية باستخدام اللوحة المقايسة28 أو الكمية RT-PCR29. استخراج الكشف الفيروسية باستخدام معدات استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياً.
    ملاحظة: يمثل الجدول 2 التتر الفيروسية لكل عزل الفيروس المستخدمة في هذه الدراسة.
  2. اتبع مقالة نشرتها يارن et al. لبروتوكول مفصلة حول عدوى الإناث Ae-مصرية مع فيروسات Zika وشيكونغونيا20. انظر الجدول 2 لعيار الفيروسية العينة البعوض مصابة بفيروس زكى.

3-يقترن اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA Glycosylase RT مصباح

  1. 10 × إعداد ميكس التمهيدي.
    1. إعداد 100 ميكرومتر الأسهم حل كل التمهيدي والتحقيق (راجع الخطوة 1) عن طريق إضافة nuclease المياه مجاناً. دوامة جيدا ومخزن في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. ميكس التمهيدي X 10 لكل ميليلتر ميكس 16 Zika أو حمى الضنك 1 الميتوكوندريا الحمض النووي المستهدف، من FIP، 16 ميليلتر المقاضاة، المسمى 2 ميليلتر من F3، 2 ميليلتر من B3، 5 ميليلتر من المجلة، 2 ميليلتر من رطل، 3 ميليلتر من الفلورسنت رطل المسبار، 4 ميليلتر من مسبار يحتوي ، و 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لتقديم ما مجموعة 100 ميليلتر الحجم.
    3. لمزيج ميكس التمهيدي X 10 لداء شيكونغونيا، 16 ميليلتر من FIP، 16 ميليلتر المقاضاة، 2 ميليلتر من F3، 2 ميليلتر من B3، 5 ميليلتر من رطل، 2 ميليلتر من المجلة، 3 ميليلتر من الفلورسنت LF المسمى مسبار و 4 ميليلتر من مسبار يحتوي 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لإعطاء إجمالي حجم 100 ميليلتر.
      ملاحظة: أن تركيز التحقيق المذكورة أعلاه يستخدم 300 نيوتن متر من المسبار الفلورسنت النهائي و 400 نانومتر يحتوي المسبار. وبدلاً من ذلك، استخدام 80 نيوتن متر من المسبار المسمى فلوريسسينتلي و 200 نيوتن متر تحقيقاتها تقضي للتحليل في الوقت الحقيقي.
  2. إضافة 5 ميليلتر من 10 X ميكس التمهيدي (3-من نوع plex، لإضافة 5 ميليلتر من كل 10 X ميكس التمهيدي)، 5 ميليلتر من 10 × التضخيم متحاور المخزن المؤقت (1 X تكوين المخزن المؤقت: 20 مم تريس-HCl المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 8.8، 50 مم بوكل، 10 مم (NH4)2هكذا4، 8 مم MgSO4 ، 0.1% توين-20، 1 مم DTT)، ميليلتر 7 من خليط دنتب (10 مم داتب ودكتب ودجتب؛ 5 مم دتتب و dUTP)، 16 وحدة من دنا بوليميريز، 15 وحدة المنتسخة العكسية، 80 وحدة من مثبط ribonuclease المؤتلف، ووحدتين من ثيرمولابيلي UDG، 1-2 ميليلتر من كميات مختلفة من السادس راؤول الكشف، والماء لجلب إجمالي حجم ما يصل إلى 50 ميليلتر 0.25 مل PCR أنبوب (انظر الجدول للمواد).
  3. وتشمل فحوصات المراقبة السلبية في هذه المرحلة بالاستعاضة عن حجم الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بالمياه. احتضان عينات بين 65-68 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ح 1، ثم تحليل عن طريق تشغيل 5 ميليلتر لكل عينة على 2.5% [اغروس] هلام في مخزن X TBE 1 يحتوي على اثيديوم بروميد (0.4 ميكروغرام/مل). استخدام 25 bp أو سلم الحمض النووي bp 50 كعلامة على الجل.
    ملاحظة: إضافة قالب معين غير المستهدفة اختيارية.
  4. للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي المسببة للأمراض، اختبار كل مجموعة التمهيدي وسيطرتها لا-قالب باختلاف تركيز درجة الحرارة و/أو المغنيسيوم، حيث كل مجموعة التمهيدي RT-مصباح تم تصميمه للعمل في درجات حرارة متفاوتة (65 درجة مئوية، إلى 68 درجة مئوية) أو المغنسيوم تركيزات (6 إلى 10 مم النهائي). إعداد التجارب في درجة حرارة الغرفة.

4-استخدام البول ارتفعت الرنا الفيروسي RT مصباح

  1. اختبار الإشعال RT-مصباح في مختلف التركيزات النهائية للبول (0% و 10%، 20% و 50%) في 50 ميليلتر من رد فعل مجموع حجم. لتركيز البول النهائي 10 ٪، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 5 ميليلتر من البول. لتركيز البول النهائي 20%، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 10 ميليلتر من البول. لتركيز البول النهائي 50%، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية إلى 25 ميليلتر من البول.
  2. للرصد في الوقت الحقيقي RT-مصباح في 10% بول، استخدم أداة PCR الوقت الحقيقي (انظر الجدول للمواد) مع مرشحات فلوروفوري مختلفة.
    1. قراءة إشارات الأسفار من أمبليكونس المسمى الاتحاد الماليزي زيكا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 483 إلى 533 نانومتر؛ لعرافة المسمى أمبليكونس لداء شيكونغونيا، استخدم عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 نانومتر؛ لطمره المسمى أمبليكونس للضنك 1، استخدم عامل تصفية تتراوح بين 558 610 نانومتر؛ وبالنسبة للمسمى تيت أمبليكونس للحمض النووي، استخدام عامل تصفية بدءاً من 523 إلى 568 شمال البحر الأبيض المتوسط.
      ملاحظة: الاتحاد الماليزي على ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 495 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. عرافة قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 538 نانومتر و 555 نانومتر، على التوالي. طمره قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 559 نانومتر و 583 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. تيت، ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 522 نانومتر و 539 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.
  3. لوحات استخدام 96-جيدا وختم اللوحة مع ورقة بلاستيك الشفاف، ثم احتضان عينات في 65-68 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة وسجل الأسفار كل 30 ثانية باستخدام cycler الخفيفة. في البداية استخدم 80 نيوتن متر المسابر المسمى فلوريسسينتلي، ومن ثم اختبار 300 نانومتر من المسابر المسمى فلوريسسينتلي.
    1. تحديد الحد الأقصى للكشف عن كل هدف بإضافة متسلسل المخفف الكشف الفيروسية في تركيز البول النهائي بنسبة 10%.
      ملاحظة: استخدام مصباح RT في الوقت الحقيقي لتحديد تركيز المغنيسيوم وتركيز التحقيق المسمى فلوريسسينتلي، ودرجة الحرارة المثلى ووقت رد الفعل.
  4. تصور الأسفار التي تولدها حبلا المسابير منقولة بالعين، استخدام مصدر ضوء LED زرقاء من cycler خفيفة مع الإثارة في 470 نانومتر (أي مربع التفريد هلام مع مصدر الضوء الأزرق المدمج سوف العمل، انظر الجدول للمواد)، وسجل في الصورة مع كاميرا هاتف الخليوي في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: استخدام 300 نانومتر من المسابر المسمى فلوريسسينتلي، عند الحاجة إلى التصور من كافة الألوان الثلاثة بالعين باستخدام الصمام الأزرق.

5-RT-مصباح على الكشف عن البعوض المصابة Zika استخدام التكنولوجيا ف ورقة

  1. إعداد رباعي الأمونيوم تعديل عامل تصفية ورقة (س-الورق)، وفقا لأساليب نشرها مسبقاً مع تعديلات طفيفة30.
    1. تزج ز 1 السليولوز دوائر ورق الترشيح (انظر الجدول للمواد) مع أقطار 3.5 سم في 50 مل من 1.8 في المائة محلول مائي من هيدروكسيد الصوديوم لمدة 15 دقيقة للتنشيط.
    2. جمع الدوائر ورقة المنشط عن طريق الترشيح الفراغ وثم تزج لهم في 40 مل محلول مائي من كلوريد تريميثيلامونيوم (2، 3-ابوكسيبروبيل) (0.28 ز) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الحفاظ على نسبة كتلة من كلوريد تريميثيلامونيوم (2، 3-ابوكسيبروبيل) لتصفية الورق في 0.28 إلى 1.
    3. جمع الورقة الموجبة الناتجة عن طريق الترشيح فراغ، وتحييد مع 50 مل من 1% حمض الخليك.
    4. يغسل الورق ثلاث مرات مع الإيثانول وأيردري تحت غطاء محرك السيارة مع استمرار تدفق الهواء.
  2. قص أوراق Q-الورقة إلى مستطيلات صغيرة (3 مم × 4 مم) استخدام لكمه ورقة أو المقص. سحق البعوض Ae. مصرية الإناث يحتمل أن المصابين مع Zika على كل ورقة مدقة الصغرى.
  3. إضافة إلى كل ميليلتر 20 ورقة من محلول الأمونيا المائية 1 م (الرقم الهيدروجيني ≈ 12) وانتظر لمدة 5 دقائق. ثم تغسل كل ورقة مرة واحدة مع 20 ميليلتر من 50% EtOH ومرة مع 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. أيردري الورقة في مجال السلامة الأحيائية BSL-2 مجلس الوزراء لحوالي 1 ساعة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، عينات يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها حتى الاستخدام.
  4. استخدام الملقط، وضع كل ورقة في 100 ميليلتر من خليط رد فعل RT-مصباح واحتضان في 65-68 درجة مئوية عن 45 دقيقة تجعل بالتأكيد إلى غمر كامل الورقة في الحل؛ وينبغي أن لا تكون عائمة. قراءة وتسجيل الأسفار الناجمة عن الفيروس Zika باستخدام مصدر ضوء LED زرقاء وتصفية اللون البرتقالي أو الأصفر.

6-ليوفيليزيشن كواشف RT-مصباح ل 100 ميليلتر من حجم رد الفعل

  1. إعداد الخليط التمهيدي مصباح X 10 وفقا للقسم 3.1، وإعداد خليط دنتب المحتوية على dUTP وفقا للمادة 3، 2. تخزين خليط التمهيدي ودنتبس في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد 10 مل من إنزيم الغسيل الكلوي العازلة لإزالة الجلسرين، بخلط 100 ميليلتر من 1 م تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، ميليلتر 500 1 م بوكل، 2 ميليلتر يدتا 0.5 متر، 100 ميليلتر من 10% X-100 تريتون، 100 ميليلتر من 0.1 م DTT ومل 9.198 المياه خالية من نوكلاس. تخزين في المخزن المؤقت للغسيل الكلوي في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تأكد من لتصفية (0.2 ميكرون المرشحات) جميع الحلول كاشف المخزن المؤقت قبل استخدامها وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    1. استخدام غشاء أولترافيلتريشن مع حد الوقف كاتشين 10 (انظر الجدول للمواد). ضع 350 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي وميليلتر 4 وحدات 32 من بوليميريز الحمض النووي، 2 ميليلتر من 30 وحدة من المنتسخة العكسية و 2 ميليلتر من 80 وحدة من مثبط رناسي في غشاء أولترافيلتريشن وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. إضافة آخر ميليلتر 350 من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي لغشاء أولترافيلتريشن وجهاز الطرد المركزي (14,000 س ز) لإفراغ أنبوب جمع آخر 5 دقيقة وكرر هذه الخطوة ثم الطرد المركزي (14,000 س ز) لمدة 3 دقائق.
    3. شطف، عكس الغشاء ووضعه في أنبوب مجموعة جديدة. تدور في 1,000 س ز 2 دقيقة قياس حجم شطف؛ إذا كان أقل من 8 ميليلتر، إحضار وحدة التخزين حتى 8 ميليلتر بإضافة المخزن المؤقت للغسيل الكلوي. تخزين شطف في 4 درجات مئوية، وتشرع فورا في الخطوة التالية.
      ملاحظة: هذا البروتوكول lyophilization أنبوب واحد، ولكن إعداد 10 على الأقل رد فعل أنابيب في وقت باستخدام نفس الغشاء أولترافيلتراتيون واستخدام نفس الكمية من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي.
  3. مزيج ميليلتر 10 من 10 X مصباح التمهيدي إذا سينجليبليكس (3-من نوع plex، لإضافة 10 ميليلتر من كل 10 X ميكس التمهيدي)، 14 ميليلتر من خليط دنتب ميليلتر 8 من مزيج الإنزيم دياليزيد، 2 ميليلتر من وحدتين من UDG ثيرمولابيلي وميليلتر 66 من نوكلاس مجانية المياه (3-من نوع plex ، استخدم ميليلتر 46) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل وإجازة فتح الغطاء. بدلاً من ذلك، قم بإضافة غطاء آخر ثقب بإبرة للسماح للبخار للهروب.
  4. فورا تجميد هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية ح 2، وليوفيليزي الأنبوبة ل h. 4 تغطية قاعة lyophilization مع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. عندما يتم المجففة الكواشف، إزالة الأغطية ثقب وإغلاق الغطاء الأصلي وتخزين الأنابيب مع الكواشف المجففة بالتبريد عند 4 درجة مئوية في الظلام.
    ملاحظة: الكواشف يمكن أن ليوفيليزيد بين ليلة وضحاها، إذا لزم الأمر.

7-اختبار المجففة بالتبريد الكواشف RT-مصباح في البول وعينات البعوض التي تحتوي على زكى

  1. استخدام العناصر التالية من المجموعة (انظر الجدول للمواد) ل Zika: المجففة بالتبريد مربع مراقبة طباعة 3D مع البرتقال (عامل تصفية تمرير طويل، قص على ~ 540 نانومتر)، 2 أأأ البطاريات لمراقبة مربع أنابيب رد فعل يسمى ZV للكشف عن زكى، و 1.1 X الإماهة المخزن المؤقت في أنابيب 1.5 مل رأس المسمار.
  2. إعداد 50 مل 1.1 X العازلة الإماهة عن طريق خلط مل 5.5 من 10 × التضخيم متحاور العازلة التي تأتي جنبا إلى جنب مع بوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، 3.3 مل من 100 مم MgSO4، 110 ميليلتر من 0.5 م DTT، ومل 41.09 المياه خالية من نوكلاس. مزيج جيد، الكوة 1 مل هذا الحل إلى 1.5 مل المسمار أعلى الأنابيب، وتخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. إضافة ميليلتر 90 X 1.1 الإماهة المخزن المؤقت لكل أنبوبة رد فعل (0.5 مل). التأكد من أن السائل يملأ الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على الكواشف المجففة بالتبريد (حل لهم بالاختلاط بالهز، ثم بإيجاز تدور إلى أسفل (س 1,000 ز)). إضافة 10 ميكروليتر من عينة البول ارتفعت مع الجيش الملكي النيبالي الفيروسية لأنابيب رد فعل (انظر الفرع 4-1 لمزيد من التفاصيل).
    1. إذا كان اختبار البعوض، إضافة مستطيل Q-ورقة عقد البعوض الذبائح (كما أعدت في الخطوات الموصوفة في المقاطع 5.2 و 5.3)، جنبا إلى جنب مع 10 ميليلتر تنقية المياه بدلاً من عينات البول.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، أضف 10 ميليلتر من عينات اللعاب أو المصل بدلاً من البول. إذا كانت العينات المستخرجة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، إضافة 2-5 ميليلتر من العينة في خليط امهاء وكاملة مع المياه خالية من نوكلاس إلى 10 ميليلتر من حجم العينة النهائي.
  4. أغلق غطاء الأنابيب رد فعل. مكان لهم في كتلة/حمام الحرارة (أو حاضنة) المحددة مسبقاً في 65-68 درجة مئوية. احتضان لمدة 30-45 دقيقة، ولكن لا يزيد عن 1 ح. بعد الحضانة، إزالة الأنبوب من الحرارة. لمنع التلوث لفحوصات المقبلة، ضمان أن هذه الأنابيب لا تزال مغلقة.
  5. وضع أنابيب رد فعل في مربع الرصد؛ درجة الحرارة ستنخفض إلى درجة الحرارة المحيطة (يفضل أن تكون 25 درجة مئوية). تشغيل التبديل على الجزء الخلفي مربع الرصد. ملاحظة عينة من خلال تصفية البرتقال والتقاط الصورة بواسطة كاميرا هاتف الخليوي الذي يقام على مسافة حيث يملأ الصورة 80% من مجال الرؤية.
    ملاحظة: يتحقق التصور أفضل في بيئات منخفضة الضوء.
  6. بعد اكتمال التصور، إيقاف تشغيل التبديل. تخزين أنابيب مختومة في الظلام، ويفضل أن يكون ذلك بالنسبة للتبريد إذا لزم التصور لاحقاً.

النتائج

في البداية، تم تقييم أداء كل مصباح RT التمهيدي (الجدول 1) مع الركازة الرنا الفيروسي المقابلة، فضلا عن عناصر سلبية قبل التفريد هلام. صممت الإشعال RT-مصباح NS5 المنطقة المستهدفة (المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا) Zika وحمى الضنك 1، ومنطقة nsP2 (بروتين غير ال...

Discussion

الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تهدد الصحة العامة وتسليط الضوء على حالات تفشي Zika الأخيرة الحاجة إلى بدائل منخفضة التكلفة نقطة العناية بالكشف لتشخيص المريض، فضلا عن مراقبة البعوض. وقد وضعت أساليب التضخيم متحاور كبدائل ميسورة للأنظمة المستندة إلى PCR. ?...

Disclosures

العديد من المؤلفين ومؤسساتها الخاصة الملكية الفكرية المرتبطة بهذا الفحص.

Acknowledgements

وأيد العمل في جزء 7ZK15 فدوة ونييد 1R21AI128188-01. كان يؤيد البحث عنها في هذا المنشور في الجزء "المعاهد الوطنية للحساسية" و "الأمراض المعدية"، وجزئياً "الطب الحيوي البحث البرنامج من فلوريدا وزارة الصحة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الصحة ولاية فلوريدا. شركة الكيمياء التوافيقيه دينامية المسلم لدعمها ومساهمتها في هذا المشروع.

وكان فيروس حمى الضنك 1 (سلالة BOL-KW010) يرجى المقدمة "إدارة ولاية فلوريدا من مكتب الصحة" المختبرات. فيروس Zika وسلالته الآسيوية من فيروس الشيكونغونيا قدمت مشكورا المراكز للسيطرة على الأمراض والوقاية. يرجى قدم النسب المحيط الهندي من فيروس الشيكونغونيا روبرت تيش (مركز الإحالة العالم بحثاً عن الفيروسات الناشئة وسيتناقش، من خلال فرع جامعة تكساس الطبية في غالفيستون، تكساس) إلى الجبهة المتحدة-فميل. ونشكر س. بيلامي، ابستموند ب، س. أورتيز، فيليز دال، يغينز ك.، زيملير ر. وزيربيل ك. للمساعدة في دراسات عدوى. ونشكر أيضا م. س. كيم لتقديم الورقة Q.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Gel electrophoresis
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Applied Science05 015 278 001Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membraneMillipore SigmaUFC501096ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C CentrifugeMarshall ScientificEP-5417Ccentrifuge
Myblock Mini DrybathBenchmark ScientificBSH200drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry SystemLabconco7934020lyophilizer
all priers and probesIDTcustomRT-LAMP primers and probes
dNTP setBiolineBIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)PromegaU1191
Bst 2.0 WarmStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0538Lenzyme
WarmStart RTx Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0380Lenzyme
RNase Inhibitor, MurineNew England BiolabsM0314Lenzyme
Antarctic Thermolabile UDGNew England BiolabsM0372Lenzyme
50bp DNA Step LadderPromegaG4521marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche Applied Science4729692001real-time RT-LAMP analysis

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 Zika

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved