Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Zusammenfassung

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Zusammenfassung

Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren werden durch Mücken, übertragen Krankheiten mit ähnlichen Symptomen der Patienten verursachen. Jedoch haben andere nachgeschaltete Patient zu Patient Übertragung Potentiale, und erfordern sehr unterschiedliche Patienten Behandlungen. So Zika Ausbrüchen machen es dringend notwendig, Werkzeuge zu entwickeln, die diese Viren bei Patienten schnell zu diskriminieren und Mücken, um die richtige Behandlung von Patienten, wählen und verstehen und verwalten ihre Epidemiologie in Echtzeit gefangen.

Leider aktuellen diagnostischen Tests, einschließlich die empfangende 2016 Notfall verwenden Berechtigungen und Fast-Track-Status, virale RNA durch reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Instrumentierung erfordert, geschulte Benutzer, zu erkennen und beträchtliche Probenvorbereitung. So müssen sie "genehmigt" Referenzlaboratorien, die Zeit gesendet werden. In der Tat im August 2016, das Center for Disease Control (CDC) fragte schwangere Frauen gewesen, die von einer Mücke gebissen und entwickelte einen Zika-Angabe Hautausschlag, eine inakzeptable 2 bis 4 Wochen vor dem Lernen zu warten, ob sie infiziert sind. Wir brauchen sehr viel Tests, die vor Ort, mit wenigen Mitteln und durch ausgebildete, aber nicht notwendigerweise lizenzierte Personal erfolgen können.

Dieses Video zeigt einen Test, der diese Spezifikationen, arbeiten mit Urin oder Serum (für Patienten) oder zerdrückten Mücken Kadaver (für Umweltüberwachung), alles ohne viel Vorbereitung der Probe. Mosquito Schlachtkörper werden auf Papier mit quaternären Ammonium Gruppen (Q-Papier) gefolgt von Ammoniak Behandlung um Biogefährdung verwalten erfasst. Diese sind dann direkt, ohne eine RNA-Isolierung, legen in Assay-Röhrchen mit gefriergetrockneten Reagenzien, die keine Kette der Kühlung benötigen. Eine modifizierte Form der reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Eindringmittel tagged verschieblich Sonden produziert auslesen, in 30 min, als eine dreifarbige Fluoreszenzsignal. Dies ist mit einem handheld, batteriebetriebenes Gerät mit einen Orangefilter visualisiert. Nach vorne Kontamination wird mit versiegelten Röhren und die Verwendung von thermolabilen Uracil DNA Glycosylase (UDG) in Anwesenheit von dUTP in der Verstärkung Mischung verhindert.

Einleitung

Moskitos übertragene Virus-Infektionen, einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika Viren sind auf den Aufstieg und Nachfrage sofortige Managementstrategien. Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren sind bereits in vielen tropischen Regionen denen Zika jetzt in der westlichen Hemisphäre¹verbreitet ist endemisch. Zika-Virus, wie Dengue-Fieber, ist ein Mitglied der Familie Flaviviridae und stammt aus Afrika mit einem asiatischen und zwei afrikanische genetische Linien². Obwohl die Identifizierung des Virus Zika bis 1947 zurückgeht, blieb Zika-Infektion beim Menschen sporadisch für ein halbes Jahrhundert vor der Schwellenländer in den Pazifik und Amerika. Der erste gemeldete Ausbruch der Zika-Fieber auf der Insel Yap in den Föderierten Staaten von Mikronesien im Jahr 2007 trat gefolgt von Französisch-Polynesien in 2013 und 2014. Der erste große Ausbruch auf dem amerikanischen Kontinent ereignete sich im Jahr 2015 in Brasilien.

Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber-Viren sind in erster Linie von Aedes Aegypti und Aedes Albopictusübertragen. Zika hat jedoch zusätzliche nachgeschaltete Mensch-zu-Mensch-Übertragungsmöglichkeiten, wahrscheinlich, zu verbreiten, durch sexuellen Kontakt, Mutter-Fötus-Interaktion, und über^3,4,5stillen. Zika Fieber glaubte zunächst nur milde Krankheit verursachen. Jedoch wurde es später im Zusammenhang mit Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen, Mikrozephalie bei Neugeborenen und chronischen Erkrankungen des Bewegungsapparates, die letzten Monate bis Jahre. Zika Erkrankung kann schwierig sein, da die Symptome einer Zika-Infektion ähnlich denen von anderen Mücke verbreitete Viren-^{6 sind}. Allgemeine Coinfektion dieser Viren machen Differentialdiagnose noch schwieriger^7,8. Daher braucht man schnelle und zuverlässige Detektion von Nukleinsäuren von Zika und andere Viren Epidemiologie in Echtzeit, um Kontrolle und vorbeugende Maßnahmen zu initiieren und Patientenversorgung⁹verwalten zu verstehen.

Aktuelle diagnostische Tests für diese Viren sind serologische Tests, die Virusisolierung, Virus-Sequenzierung und Reverse Transkription PCR (RT-PCR). Serologische Standardansätze leiden oft unzureichende Sensitivität und Ergebnisse können durch Kreuzreaktivität bei Patienten, die zuvor von anderen Flaviviren infiziert wurden, erschwert werden.

Daher bleibt die Nukleinsäure-Tests der zuverlässigste Weg zu erkennen und diese Viren zu unterscheiden. Erkennung von Zika und andere Moskitos übertragene Viren erfolgt in der Regel mittels RT-PCR oder Real-Time RT-PCR in unterschiedlichsten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Serum, Urin, Speichel, Sperma, Muttermilch und zerebralen Fluid^10,11. Urin und Speichel Proben werden über Blut, in der Regel bevorzugt, da sie zeigen weniger PCR-Hemmung, höheren Viruslast, Virus-Präsenz für längere Zeit und erhöhte Benutzerfreundlichkeit der Sammlung und Bearbeitung von^12,13. RT-PCR-basierten diagnostischen Tests, umfassen jedoch umfangreiche Stichprobe Vorbereitungsschritte und teure thermische Rad-Ausrüstung, so dass es weniger optimal für den Point-of-Care.

Reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (RT-Lampe) als eine leistungsfähige RT-PCR-Alternative aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität^{14 entstanden}, seine Toleranz für hemmende Stoffe in biologischen Proben¹⁵, und Betrieb auf single-Temperatur deutlich senkt die Komplexität und die damit verbundenen Kosten, eignet sich für Umgebungen mit geringen Ressourcen assay. RT-Lampe, da sie klassisch umgesetzt wird, besteht aus sechs Primer, die an acht verschiedenen Regionen innerhalb der Ziel-RNA binden. Es läuft bei konstanten Temperaturen zwischen 60 ° C und 70 ° C, und verwendet eine Reverse Transkriptase und einer DNA-Polymerase mit starken Strang Aktivität verdrängen.

In der Anfangsphase des RT-Lampe bilden vorwärts und rückwärts interne Primer (FIP und BIP, Abb. 1A) zusammen mit äußeren vorwärts und rückwärts Primer (F3 und B3) eine Hantel Struktur, die Samen der exponentiellen Amplifikation der Lampe. Verstärkung wird weiter beschleunigt durch die Schleife vorwärts und rückwärts Primer (LF und LB), die entworfen sind, um die einzelnen gestrandeten Regionen der Hantel zu binden, und führt zur Bildung von Concatemers mit mehreren sich wiederholenden Schleifen¹⁶. Klassische Lampe Tests basierend auf Trübung oder Auslesen von DNA verschuppen Farbstoffe ist nicht ganz geeignet für Point-of-Care-Erkennung von Zika, wo gewisse multiplexing ist^17,18,19gewünscht. Multiplex ist nicht leicht in diesen Systemen erhalten sind anfällig für Fehlalarme durch Ziel-Vergrößerungen erzeugen.

Um diese Probleme zu verwalten, hinzugefügt die Literatur der klassischen RT-Lampe Architektur^20,21,22eine zusätzliche Komponente in Form einer "Strang verdrängen Sonde". Jede Sonde verfügt über eine Sequenz-spezifische Doppel-Strang-Region und eine einsträngige Priming-Region. Die Sonde mit der einzelsträngigen Region ist mit einer 5'-Fluorophor markiert, und die ergänzenden Sonde ist mit einem 3'-Ende Quencher modifiziert. In Ermangelung eines Ziels wird keine Fluoreszenz durch Hybridisierung der ergänzenden Sonde Stränge beobachtet bringt das Fluorophor und Durstlöscher in unmittelbarer Nähe. In Anwesenheit eines Ziels der einsträngige Teil der fluoreszierenden Sonde bindet mit seinem Komplement auf das Ziel und wird dann durch einen Strang verdrängen Polymerase verlängert. Polymerase-Erweiterung durch reverse Primer bewirkt, dass die Trennung des Teilprogramms Durstlöscher aus seine komplementäre Eindringmittel beschrifteten Strang, so dass Emission von FluoreszenzAbbildung 1 b() (). Mit diesem Design wird das Signal nach der Hantel-Bildung, wodurch die Chancen von falsch-positiven Signale generiert.

Die doppelsträngige Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen kann beliebiger Reihenfolge, und wenn Multiplexen angewendet wird, die gleiche Reihenfolge verwendet werden, mit verschiedenen Fluorophor-Quencher Paaren. Mit dieser Architektur, Virus kontaminiert Urin, Serum oder Moskito wurden Proben zerquetscht auf Papier direkt an der Assay ohne Probenvorbereitung eingeführt. Dreifarben Fluoreszenz Auslesen für menschliche Auge sichtbar waren innerhalb von 30-45 min generiert und Signale wurden durch ein 3D-gedruckten Beobachtung-Feld, das eine blaue LED und einen Orangefilter verwendet visualisiert. Gefriertrocknung die RT-Lampe Reagenzien ermöglicht Bereitstellung dieses Kits Ressourceneinstellungen ohne Kühlung zu senken.

Protokoll

Hinweis: Moskitos waren die einzigen Tiere, die direkt in dieser Studie verwendet. Die Verfahren, die Hühner, zu verwalten, deren Blut verwendet wurde, um die infizierten Mücken ernähren, wurden als IACUC Protokoll #201507682 durch die Universität von Florida institutionelle Tierpflege und Nutzung Committee.Virus Ausbreitung genehmigt und Moskito-Infektion Studien waren durchgeführt an der BSL-3-Anlage des Florida Medical Entomology Laboratory in Vero Beach, erfolgten FL. RT-Lampe Experimente im BSL-2 Labor geteilt durch FfAME und Firebird biomolekulare Wissenschaften LLC im Alachua, FL.

1. Aufbau von Primern und Strang verdrängen Sonden

1. Extrahieren Sie virale Sequenzen für Dengue-1 aus der Broad Institute Datenbank²³; Sequenzen für Zika und Chikungunya-Fieber aus dem NIAID Virendatenbank Erreger und Analyse Ressource²⁴.
   1. Erstellen Sie mehrere Ausrichtungen Sequenz (MSAs) für Sequenzen von Interesse, die mit Software Muskel v3.8.31²⁵. Generierten MSAs Primer Leuchtensets innerhalb einer konservierten Region des Ziels suchen, und vermeiden irrelevante oder unbeabsichtigte Ziele wie Unterscheidungen zwischen den Subtypen eines Ziels.
2. Folgen Sie die Design-Regeln für Lampe Primer als beschriebenen Online-(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), und ermöglichen Sie die Verwendung von gemischten Basen in Primer zur Deckung der Virus Divergenz²⁶. Zur Vermeidung von Kreuzreaktivität Grundierung Sätze vergleichen Sie generierte Lampe Primer an die NCBI RNA-Virus-Datenbank mit BLAST NCBI²⁷. Jeder Satz Zündkapseln zu beseitigen, die in einem Multiplex Assay Dimere würde mithilfe von NCBI BLAST sowie zu vergleichen.
3. Bildschirm der Doppelstrang-Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen gegen virale Genom-Sequenz und Moskito genomischen Sequenz. Ändern Sie 5'-Enden der Ziel Bindung Sonde mit Fluorescein Amidite (FAM), HEX-Farbstoff und 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) Farbstoff für Zika, Chikungunya und Dengue-1, bzw..
   1. Gehören Sie eine Positivkontrolle Grundierung für Urinproben festgelegt. Design Lampe Primer auf menschliche mitochondrische DNA abzielen. Label Strang verdrängen Sonde mit TET am 5'-Ende. Label Quencher Sonden, die Eindringmittel teilweise komplementär zueinander sind beschriftet Sonde mit Quencher (z. B.Iowa schwarz-FQ) am 3'-Ende (Tabelle 1).

(2) Virus isoliert und infizierten Mücke Proben

1. Verwendung der Zika-Virus (Puerto-Rico-Stamm), Chikungunya-Virus (La Réunion oder British Virgin Islands-Stamm) und Dengue-Virus Serotyp-1 (Key West-Stamm) isoliert. Virale Titer mit Plaque-Assay²⁸ oder quantitative RT-PCR²⁹zu bestimmen. Viralen RNAs mit handelsüblichen RNA-Extraktion-Kits zu extrahieren.
   Hinweis: Tabelle 2 stellt die virale Titer von jedem Virus isolieren, die in dieser Studie verwendet.
2. Folgen Sie den Artikel von Yaren Et Al. für ein detailliertes Protokoll über die Infektion von Ae. Aegypti Weibchen mit Zika und Chikungunya Viren²⁰veröffentlicht. Siehe Tabelle 2 für die virale Titer der Moskito-Probe mit Zika-Virus infiziert.

(3) RT-Lampe gepaart mit thermolabilen Uracil DNA Glycosylase

1. 10 x Grundierung Eismixherstellung.
   1. 100 µM-Stammlösung jede Grundierung vorzubereiten und Sonde (siehe Schritt 1) durch Zugabe von Nuklease kostenlos Wasser. Vortex gut und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung.
   2. Für 10 X Primer-Mix für jeden Zika, Dengue-Fieber 1 oder mitochondriale DNA Ziel Mix 16 µL FIP, 16 µL BIP, beschriftet 2 µL F3, 2 µL B3, 5 µL LF, 2 µL LB, 3 µL LB-fluoreszierende Sonde, 4 µL Quencher Sonde , und 50 µL Nuklease-freies Wasser, insgesamt 100 µL Volumen zu geben.
   3. Für 10 X Primer-Mix für Chikungunya-Fieber, mix 16 µL der FIP, 16 µL BIP, 2 µL F3, 2 µL B3, 5 µL LB, LF 2 µL, beschriftet 3 µL von LF-fluoreszierend Sonde, 4 µL Quencher Sonde und 50 µL Nuklease-freies Wasser, insgesamt 100 µL Volumen zu geben.
      Hinweis: Die Sonde Konzentration beschriebenen Verwendungen 300 nM endgültige fluoreszierende Sonde und 400 nM Quencher Sonde. Alternativ Nutzung 80 nM Eindringmittel markierte Sonde und 200 nM seine Quencher-Sonde für die Echtzeit-Analyse.
2. Fügen Sie 5 µL 10 X Grundierung Mix (3-Plex, fügen Sie 5 µL jedes 10 X Grundierung Mischung), 5 µL 10-fach Puffer isothermen Verstärkung (1 X Puffer Zusammensetzung: 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 8 mM MgSO₄ 0,1 % Tween-20, 1 mM DVB-t), 7 µL dNTP-Gemisch (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 5 mM dTTP und dUTP), 16 Einheiten der DNA-Polymerase, 15 Einheiten von Reverse Transkriptase, 80 Einheiten des rekombinanten Ribonuklease-Inhibitor, 2 Einheiten von thermolabilen UDG, 1-2 µL unterschiedliche Mengen an vi RAL RNAs und Wasser bringen das Gesamtvolumen bis zu 50 µL in einem 0,25 mL PCR Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
3. Enthalten Sie Negativkontrolle Assays in diesem Stadium virale RNA Volumen durch Wasser ersetzen. Inkubieren Sie Proben zwischen 65-68 ° C für 45 min bis 1 h, dann analysieren Sie, indem Sie 5 µL jeder Probe auf 2,5 % Agarosegel auf 1 X TBE-Puffer mit Interkalation Bromid (0,4 µg/mL) ausgeführt. Verwenden Sie einen 25 bp oder 50 bp DNA-Leiter als Marker auf das Gel.
   Hinweis: Zusatz einer Nichtziel-spezifische Vorlage ist optional.
4. Um das Vorhandensein von pathogenen RNA zu erkennen, testen Sie jede Grundierung-Gruppe und ihre keine-Template-Kontrolle durch Variation der Temperatur und/oder Magnesium-Konzentration, da jedes RT-Lampe-Grundierung-Set entwickelt wurde, um Arbeit in unterschiedlichen Temperaturen (65 ° C bis 68 ° C) oder magnesium Konzentrationen (letzte 6 bis 10 mM). Bereiten Sie die Experimente bei Raumtemperatur.

(4) RT-Lampe mit viralen RNA versetzt Urin

1. RT-Lampe Primer in unterschiedlichen Endkonzentrationen von Urin (0 %, 10 %, 20 % und 50 %) in 50 µL der gesamte Reaktionsvolumen zu testen. Fügen Sie für 10 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 5 µL des Urins hinzu. Fügen Sie für 20 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 10 µL des Urins hinzu. Fügen Sie für 50 % final Urinkonzentration 1 µL der viralen RNA 25 µL Urin hinzu.
2. Zur Echtzeit-Überwachung von RT-Lampe in 10 % der Urin, verwenden Sie ein Real-Time PCR-Instrument (siehe Tabelle der Materialien) mit verschiedenen Fluorophor filtern.
   1. Fluoreszenz-Signale von FAM-markierten Amplifikate für Zika zu lesen, verwenden Sie einen Filter von 483 bis 533 nm; für HEX-markierten Amplifikate für Chikungunya-Fieber, verwenden Sie einen Filter von 523 bis 568 nm; für TAMRA-markierten Amplifikate für Dengue-1, verwenden Sie einen Filter von 558 bis 610 nm; und für TET-markierten Amplifikate für mitochondriale DNA, verwenden Sie einen Filter von 523 bis 568 nm.
      Hinweis: FAM hat Anregung und Emission Maxima von 495 nm und 520 nm, beziehungsweise. HEX ist Anregung und Emission Maxima 538 nm und 555 nm, beziehungsweise. TAMRA ist Anregung und Emission Maxima von 559 nm und 583 nm, beziehungsweise. TET hat Anregung und Emission Maxima von 522 nm und 539 nm, beziehungsweise.
3. Verwendung 96-Well Platten und Dichtung der Platte mit einer klaren Plastikfolie, dann Proben bei 65-68 ° C 60-90 min inkubieren und notieren der Fluoreszenz alle 30 s mit der light Cycler. Verwenden Sie zunächst 80 nM Fluoreszent markierten Sonden und dann Test der 300 nM Fluoreszent markierten Sonden.
   1. Bestimmen Sie die Nachweisgrenze für jedes Ziel durch Zugabe von seriell virale RNA im endgültigen Urinkonzentration von 10 % verdünnt.
      Hinweis: Verwenden Sie Real-Time RT-Lampe, um optimale Temperatur, Magnesiumkonzentration, Eindringmittel markierte Sonde Konzentration und Reaktionszeit zu bestimmen.
4. Um die Fluoreszenz erzeugt durch Strang verschieblich Sonden mit dem Auge sichtbar zu machen, verwenden Sie eine blaue LED-Lichtquelle aus einem leichten Cycler mit Erregung bei 470 nm (Gel-Elektrophorese-Box mit eingebauten blaue Lichtquelle arbeiten, siehe Tabelle der Materialien), und notieren Sie das Bild mit einer Handy-Kamera bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   Hinweis: Verwendung 300 nM Fluoreszent markierten Sonden, wenn Visualisierung aller drei Farben vom Auge mit blauer LED benötigt wird.

(5) RT-Lampe auf Erkennung von Zika-infizierten Mücken mit Q-Papiertechnik

1. Quartäre Ammonium-modifizierte Filterpapier (Q-Papier), nach zuvor veröffentlichten Methoden mit leichten Modifikationen³⁰vorzubereiten.
   1. Tauchen Sie 1 g Zellulose Filterpapier Kreise (siehe Tabelle der Materialien) mit einem Durchmesser von 3,5 cm in 50 mL von 1,8 % des wässriger NaOH Lösung für 15 min für die Aktivierung.
   2. Sammeln Sie aktivierte Papier Kreise durch Vakuumfiltration und dann tauchen sie in 40 mL wässrige Lösung von (2,3-Epoxypropyl) Trimethylammonium Chlorid (0,28 g) über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Halten Sie das Massenverhältnis von (2,3-Epoxypropyl) Trimethylammonium-Chlorid auf Filterpapier auf 0,28 bis 1.
   3. Sammeln Sie die daraus resultierenden kationische Papier durch Vakuumfiltration, und mit 50 mL von 1 % Essigsäure neutralisieren.
   4. Das Papier dreimal mit Ethanol zu waschen und Trocknen unter eine Haube mit konstanter Luftstrom.
2. Q-Papierbögen in kleine Rechtecke (3 x 4 mm) mit einem Schlag Papier oder Schere zu schneiden. Zerdrücken Sie Ae. Aegypti weibliche Stechmücken potenziell infizierte Zika auf jedem Papier mit einem Mikro Stößel.
3. Jedes Papier 20 µL 1 M wässrigen Ammoniak-Lösung (pH ≈ 12) hinzufügen und 5 min warten. Dann waschen Sie jedes Papier einmal mit 20 µL 50 % EtOH und einmal mit 20 µL Nuklease-freies Wasser. Trocknen Sie das Papier in BSL-2 Biosafety Schrank für ca. 1 h an der Luft.
   Hinweis: An dieser Stelle können Proben bei-20 ° C über Nacht bis zum Gebrauch gespeichert werden.
4. Mit einer Pinzette, jedes Papier in 100 µL RT-Lampe Reaktionsgemisch und 45 min. Stellen Sie sicher, vollständig das Papier in die Lösung tauchen bei 65-68 ° C inkubieren; Es sollte nicht zu schweben. Ablesen und Aufzeichnen der Fluoreszenz aus Zika-Virus mit blauen LED-Lichtquelle und orange oder gelb-Filter.

6. die Gefriertrocknung von RT-Lampe Reagenzien für 100 µL Reaktionsvolumen

1. Bereiten Sie 10 X Lampe Grundierung Mischung gemäß Abschnitt 3.1 vor, und bereiten Sie dNTP-Gemisch mit dUTP gemäß Abschnitt 3.2. Primer-Mischung und dNTPs bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
2. Vorbereitung 10 mL der Enzym-Dialyse-Puffer, Glycerin, zu entfernen, durch das Mischen von 100 µL 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL 1 m KCl, 2 µL 0,5 M EDTA, 100 µL 10 % Triton x-100, 100 µL 0.1 M DTT und 9,198 mL Nuklease-freies Wasser. Speichern des Dialyse-Puffers bei 4 ° C.
   Hinweis: Achten Sie darauf, (0,2 µm-Filter) filtern alle Puffer Reagenzlösungen vor verwenden und bei 4 ° c lagern
   1. Verwenden Sie eine Ultrafiltration Membran mit 10 kDa-Grenzwert (siehe Tabelle der Materialien). Setzen Sie 350 µL Dialyse-Puffer, 4 µL 32 Einheiten der DNA-Polymerase, 2 µL von 30 Einheiten der reversen Transkriptase und 2 µL von 80 Einheiten der RNase-Inhibitor Ultrafiltration Membran und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei 4 ° C.
   2. Eine weitere 350 µL Dialyse-Puffer auf die Ultrafiltration Membran und Zentrifuge (14.000 x g) für eine weitere 5 min. leer das Sammelröhrchen hinzufügen und wiederholen Sie diesen Schritt, dann (14.000 x g) für 3 min zentrifugieren.
   3. Zur Elution invertieren Sie die Membran und in eine neue Kollektion-Röhre. Mit 1.000 x g für 2 min. Maßnahme die Elution Lautstärke Drehen; Wenn weniger als 8 µL, das Volumen bis zu 8 µL bringen durch Zugabe von Dialyse-Puffer. Speichern der Elution bei 4 ° C, und sofort weiter zum nächsten Schritt.
      Hinweis: Dieses Protokoll ist für einzelne Rohr Lyophilisierung, aber mindestens 10 Reaktionsgefäßen zu einem Zeitpunkt mit der gleichen Ultrafiltration Membran vorbereiten und verwenden die gleiche Menge an Dialyse-Puffer.
3. 10 µL 10 X Lampe Grundierung mischen, wenn Singleplex (3-Plex, fügen Sie 10 µL jedes 10 X Grundierung Mischung), 14 µL dNTP-Gemisch, 8 µL dialysierten Enzym-Mix und 2 µL 2 Einheiten von thermolabilen UDG 66 µL Nuklease Wasser (für 3-Plex frei Verwenden Sie 46 µL) 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch und lassen den Deckel zu öffnen. Stattdessen fügen Sie ein weiteres Deckel punktiert mit einer Nadel zu Dampf entweichen zu lassen.
4. Sofort Einfrieren der Rohre bei-80 ° C 2 h, und lyophilize dem Rohr für 4 Std. Abdeckung der Lyophilisation Kammer mit Alu-Folie zum Schutz vor Licht. Wenn Reagenzien getrocknet sind, entfernen Sie den durchlöcherten Deckel, schließen Sie original Deckel und speichern Sie die Rohre mit lyophilisierter Reagenzien bei 4 ° C im Dunkeln.
   Hinweis: Reagenzien können über Nacht, ggf. lyophilisiert werden.

7. testen lyophilisiert RT-Lampe Reagenzien auf Urin und Moskito-Proben mit Zika

1. Verwenden Sie die folgenden Elemente aus dem Kit (siehe die Tabelle der Materialien) für Zika: eine 3D-gedruckten Beobachtung Box mit Orangefilter (langen Pass Filter, Schnitt auf ~ 540 nm), 2 AAA-Batterien für die Beobachtung im Feld lyophilisiert Reaktionsgefäßen ZV für Zika-Erkennung, beschriftet und 1.1 X Rehydratation Puffer in 1,5 mL Schraubverschluss Röhren.
2. 50 mL von 1,1 X Rehydratation Puffer durch das Mischen von 5,5 mL 10 X isothermen Verstärkung Puffer, die zusammen mit DNA-Polymerase vorbereiten (siehe die Tabelle der Materialien), 3,3 mL 100 mm MgSO₄, 110 µL 0,5 M DTT und 41,09 mL Nuklease-freies Wasser. Vermischen Sie, aliquoten 1 mL dieser Lösung auf 1,5 mL Schraubverschluss Rohre, und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
3. Jedes Reaktionsgefäß (0,5 mL) 90 µL 1,1 X Rehydratation Puffer hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit den Boden des Röhrchens mit lyophilisierten Reagenzien (lösen sie füllt mit dem Mischen durch Schütteln, dann kurz nach unten (1.000 x g) drehen). Fügen Sie 10 µL der Urinprobe gespickt mit viralen RNA in die Reaktionsgefäße (siehe Abschnitt 4.1).
   1. Wenn Mücken zu testen, fügen Sie ein Rechteck von Q-Papier hält Mücken Kadaver (wie in den Schritten beschriebene in Abschnitten 5.2 und 5.3 vorbereitet), zusammen mit 10 µL gereinigtes Wasser anstelle von Urinproben.
      Hinweis: Alternativ fügen Sie 10 µL der Speichel oder Serum Proben statt Urin hinzu. Wenn die Proben extrahierte DNA oder RNA sind, fügen Sie 2 bis 5 µL der Probe in eingeweichtes Mischung und komplett mit Nuklease-freies Wasser zu 10 µL des endgültigen Probenvolumen.
4. Schließen Sie den Deckel von der Reaktionsgefäße. Legen Sie sie in eine Wärme Block/Bad (oder Inkubator) voreingestellt bei 65-68 ° C. Inkubieren Sie für 30-45 min, aber nicht mehr als 1 h. Nehmen Sie nach der Inkubation den Schlauch vom Herd. Um zukünftige Tests zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass diese Rohre geschlossen bleiben.
5. Legen Sie im Feld beobachten Reaktionsgefäßen; die Temperatur fällt auf die Umgebungstemperatur (vorzugsweise 25 ° C). Schalten Sie den Schalter auf der Rückseite des Feldes beobachten. Beobachten Sie Probe durch den orange Filter und erfassen Sie das Abbild von einer Handy-Kamera, die in einem Abstand gehalten wird, wo das Bild 80 % des Sichtfeldes füllt.
   Hinweis: Bessere Visualisierung wird bei geringen Lichtverhältnissen erzielt.
6. Nach Abschluss der Visualisierung ausschalten. Speichern Sie die versiegelten Röhren in der Dunkelheit, vorzugsweise mit Kältetechnik, ggf. später Visualisierung.

Ergebnisse

Zunächst wurden die Leistungen der einzelnen RT-Lampe Grundierung (Tabelle 1) mit ihren entsprechenden viralen RNA-Substrat sowie Negativkontrollen durch Gelelektrophorese bewertet. RT-Lampe Primer wurden entwickelt, um NS5 Zielregion (RNA-abhängige RNA-Polymerase) für Zika und Dengue-1 und nsP2 Region (nichttragenden Protein P2) für Chikungunya-Fieber. Vorlagen waren total RNA aus kultivierten virale Bestände in African Green Monkey Nierenzellen (Vero) extrahiert. I...

Diskussion

Moskitos übertragene Viren einschließlich Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber bedrohen die Gesundheit und den letzten Höhepunkt der Zika-Ausbrüche den Bedarf an kostengünstigen Point-of-Care-Erkennung Alternativen für Patienten Diagnostik sowie für Moskito-Überwachung. Isothermen Amplifikationsverfahren wurden als erschwingliche Alternativen zu PCR-basierten Systemen entwickelt. Insbesondere wurden RT-Lampe-basierten Plattformen angewendet, um eine Vielzahl von Krankheitserregern zu erkennen. Die Verwendung von i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	Gel electrophoresis
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well	Roche Applied Science	05 015 278 001	Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	Millipore Sigma	UFC501096	ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge	Marshall Scientific	EP-5417C	centrifuge
Myblock Mini Drybath	Benchmark Scientific	BSH200	drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System	Labconco	7934020	lyophilizer
all priers and probes	IDT	custom	RT-LAMP primers and probes
dNTP set	Bioline	BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)	Promega	U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0538L	enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380L	enzyme
RNase Inhibitor, Murine	New England Biolabs	M0314L	enzyme
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372L	enzyme
50bp DNA Step Ladder	Promega	G4521	marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche Applied Science	4729692001	real-time RT-LAMP analysis