JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

Abstract

Zika דנגה, chikungunya וירוסים מועברים על ידי יתושים, גורמות למחלות עם תסמינים דומים החולה. עם זאת, יש פוטנציאל שידור שונות-לחולה במורד הזרם והם דורשים טיפולים שונים מאוד סבלני. לפיכך, התפרצויות שאירעו לאחרונה Zika דבר דחוף לפתח את הכלים במהירות מפלים וירוסים אלה בחולים, לכוד היתושים, לבחירת הטיפול המטופל הנכון, וכדי להבין ולנהל אפידמיולוגיה שלהם בזמן אמת.

למרבה הצער, בדיקות אבחון הנוכחי, כולל אלה חירום 2016 המקבל להשתמש אישורים ואת המהירות מצב, לזהות RNA נגיפי על ידי שעתוק במהופך תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR), אשר דורשת מכשור, אימן משתמשים, ו הכנת הדוגמא ניכר. לפיכך, הם יש לשלוח למעבדות הפניה "מאושרים", הדורשים זמן. אכן, אוגוסט 2016, מרכז בקרת מחלות (CDC) שאל נשים בהריון שהיו ננשך על ידי יתוש ופיתח פריחה המציין Zika לחכות מתקבל על הדעת 2 כדי 4 שבועות לפני לימוד, בין אם הם נדבקו. אנחנו מאוד זקוקים בדיקות שניתן לעשות באתר, עם מעט משאבים, ועל -ידי צוות מיומן אך לא בהכרח מורשה.

וידאו זה מדגים וזמינותו שעונה מפרטים אלה, עבודה עם שתן או סרום (עבור חולים) או פגרי יתושים מעוכים (למעקב סביבתית), כל זאת ללא הכנת הדוגמא הרבה. יתוש הגוויות נלכדים על נייר נושאת אמוניום רבעוני קבוצות (Q-נייר) ואחריו טיפול אמוניה כדי לנהל את הנגועים. אלה מכן ישירות, ללא בידוד ה-RNA, מוכנסים לתוך צינורות assay המכיל ריאגנטים הליחה צריך שום שרשרת קירור. צורה שונה של שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים מתויגות fluorescently במטרה מייצר העתק, 30 דקות, כאות פלורסצנטיות תלת-צבעי. זה הוא מדמיין עם התקן כף-יד, המופעלים באמצעות סוללות עם מסנן כתום. זיהום קדימה נמנעת עם צינורות אטום, השימוש של אורציל thermolabile דנ א glycosylase (UDG) בנוכחות dUTP בתערובת הגברה.

Introduction

זיהומים וירוס בעקיצות יתוש, לרבות קדחת דנגה, chikungunya Zika וירוסים הם על אסטרטגיות הניהול המיידית עלייה וביקוש. קדחת דנגה וירוסים chikungunya אנדמיים כבר רבות של האזורים הטרופיים איפה Zika מתפשטת עכשיו חצי הכדור המערבי1. וירוס Zika, כמו קדחת דנגה, חבר של משפחת Flaviviridae , הוא יליד אפריקה עם אחד אסיה אפריקה שושלות גנטיות שני2. אף-על-פי זיהוי הווירוס Zika שתחילתה 1947, Zika זיהום בבני נשאר סדיר במשך מאה וחצי לפני המתעוררים באוקיינוס השקט, אמריקה. פרוץ המדווחת הראשונה Zika חום אירעה על האי של הפה, מיקרונזיה בשנת 2007, ואחריו פולינזיה הצרפתית 2013 ו- 2014. ההתפרצות הראשונה הגדולות ביבשת אמריקה אירעה בשנת 2015 בברזיל.

Zika chikungunya, קדחת דנגה וירוסים מועברים בעיקר על ידי Aedes aegypti אדס מפוספס. עם זאת, Zika בעל אפשרויות שידור נוספים אדם אל אדם במורד הזרם, צפויה להתפשט דרך מגע מיני, אינטראקציה אמא-כדי-העובר, ולא באמצעות הנקה3,4,5. קדחת Zika האמינו תחילה כדי לגרום למחלה קלה בלבד. עם זאת, זה היה אח כ הקשורים עם תסמונת גיליאן במבוגרים, microcephaly neonates, במחלות כרוניות השלד והשרירים אולי חודשים עד שנים. אבחון של מחלה Zika עשויה להיות מאתגרת, מאז הסימפטומים של זיהום Zika דומים לאלה של אחרים נגד יתושים-התפשטות וירוסים6. זיהומים נפוצים שיתוף של וירוסים אלה הפוך אבחנות יותר מאתגר7,8. לכן, זיהוי מהיר ואמין חומצות גרעין מפני Zika ווירוסים אחרים יש צורך להבין אפידמיולוגיה בזמן אמת, כדי ליזום אמצעי מניעה ובקרה, ניהול הטיפול בחולה9.

בדיקות אבחון הנוכחי עבור וירוסים אלה כוללים בדיקות סרולוגית, בידוד וירוס, וירוס רצף הפוכה-תמלול PCR (RT-PCR). גישות סרולוגית רגיל סובלים לעתים קרובות רגישות לקוי, תוצאות יכול להיות מסובך אשיג בחולים שנדבקו בעבר על ידי אחרים flaviviruses.

לכן, בדיקות חומצות גרעין נשאר הדרך האמינה ביותר ויוכל להבדיל וירוסים אלה. זיהוי של Zika ווירוסים אחרים בעקיצות יתושים מתבצעת בדרך כלל באמצעות RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR במגוון הביולוגי נוזלים, כמו סרום, השתן, רוק, זרע, חלב ו- נוזל מוחי10,11. דגימות שתן ורוק עדיפים בדרך כלל על דם, מאחר שהם מייצגים פחות PCR-עיכוב, מטענים נגיפי גבוה יותר, נוכחות וירוס עבור תקופות זמן ארוכות יותר וקלות מוגברת של איסוף וטיפול12,13. RT-PCR מבוססי בדיקות אבחון, עם זאת, מהווים צעדים הכנה דגימה נרחבת, ציוד רכיבה על אופניים תרמי יקר, עושה את זה פחות אופטימלי בשלב של הטיפול.

שעתוק במהופך בתיווך לופ הגברה איזותרמי (RT-המנורה) התפתחה בתור חלופה RT-PCR חזק בשל רגישות גבוהה שלה ירידה לפרטים14, שלה עמידות לחומרים מעכבות בביולוגית דגימות15, ו מבצע על טמפרטורה יחיד, אשר באופן משמעותי assay מפחית את המורכבות ואת עלויות, שהופך אותו מתאים לסביבות משאבים נמוכה. RT-המנורה, כמו זה מיושם באופן קלאסי, מונה שישה צבעי יסוד זה לאגד שמונה אזורים הנבדלים זה מזה בטווח המטרה RNA. זה פועל בטמפרטורות מתמדת בין 60 ° C ו- 70 מעלות צלזיוס, ומשתמש של רוורס טרנסקריפטאז, של ה-DNA פולימראז עם חוט חזק ועקרו מבתיהם פעילות.

במהלך בשלבים ההתחלתיים של RT-המנורה, קדימה ואחורה פנימי תחל (FIP, ביפ, איור 1A) יחד עם תחל קדימה ואחורה החיצוני (F3 ו- B3) יוצרות מבנה המשקולת, מבנה הזרע הגברה המנורה מעריכית. הגברה נוספת מואץ על ידי הלולאה קדימה ואחורה תחל (אם ו LB), אשר נועדו לקשור אזורים נטושים יחיד המשקולת, תוצאות על היווצרות concatemers עם חוזרים מרובים לולאות16. המנורה קלאסית מבחני בהתבסס על עכירות או הבדיקה על ידי ה-DNA intercalating צבע הוא לא לגמרי מתאים עבור זיהוי בשלב של טיפול Zika, איפה רמה מסוימת של ריבוב הרצוי17,18,19. ריבוב לא בקלות מתקבל במערכות אלו, כפי שהם נוטים ליצור שווא-תוצאות חיוביות בשל ביטול-יעד amplifications.

כדי לנהל את הסוגיות הללו, הספרות מוסיפה מרכיב חשוב נוסף בדמות "החללית ועקרו מבתיהם strand" קלאסית RT-המנורה אדריכלות20,21,22. כל בדיקה יש אזור כפול-strand רצף ספציפי, אזור חד גדילי לקרקע. החללית עם האזור חד גדילי המתויגת של 5'-fluorophore, החללית משלימים משתנה עם כ'חטיף 3'-end. בהעדר מטרה, אין קרינה פלואורסצנטית הוא ציין עקב הכלאה של גדילים משלימים בדיקה, אשר מביא את fluorophore ואת כ'חטיף לתוך קרבה. בנוכחות מטרה, החלק חד גדילי של החללית פלורסנט נקשר המשלים שלו על המטרה ולאחר מכן נמתח חוט ועקרו מבתיהם פולימראז. הארכה נוספת פולימראז מאת תחל הפוך גורם ההפרדה של סטרנד כ'חטיף מ שלה strand fluorescently שכותרתו משלימים, המאפשר פליטת קרינה פלואורסצנטית (איור 1B). עם העיצוב הזה, האות נוצר לאחר היווצרות המשקולת, להפחית את הסיכויים של אותות חיובי-false.

החלק גדילי כפול של החללית ועקרו מבתיהם סטרנד יכול להיות כל רצף, כאשר ריבוב מוחל, ניתן להשתמש באותו הרצף עם fluorophore שונים-כ'חטיף זוגות. זו ארכיטקטורה, השתן נגוע וירוסים, סרום או יתוש דגימות זחלים וחרקים על נייר הוכנסו ישירות הבדיקה ללא הכנת הדוגמא. הקריאות תלת-צבעי זריחה גלויים לעין האנושית נוצרו בתוך 30-45 דקות, אותות היו דמיינו ידי תיבה תצפית מודפס 3D משתמש LED כחול של מסנן כתום. ליופיליזציה ריאגנטים RT-המנורה איפשרה פריסה של הקיט הזה כדי להוריד את הגדרות משאבים ללא צורך קירור.

Protocol

הערה: יתושים היו החיות היחידות ישירות השתמשו במחקר זה. ההליכים כדי לנהל את התרנגולות, של מי הדם שימש כדי להאכיל את היתושים נגוע, אושר כפי IACUC פרוטוקול #201507682 על ידי התפשטות טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פלורידה, שימוש Committee.Virus והיו מחקרים זיהום יתוש המבוצעת במתקן BSL-3 של המעבדה לאנטומולוגיה רפואית פלורידה ב סיינט פיטרסברג, קומה RT-המנורה הניסויים בוצעו במעבדה BSL-2 משותף FfAME, ציפור האש למערכות ביולוגיות מדעי LLC ב אלצ'ואה, קומה

1. תכנון תחל סטרנד ועקרו מבתיהם הגששים

  1. לחלץ רצפים ויראלי דנגה 1 מתוך מסד הנתונים ' במכון '23; רצפי Zika ו- chikungunya מ מסד הנתונים הפתוגן NIAID וירוס ומשאבים ניתוח24.
    1. ליצור מספר רצף במערכים (שימי) עבור רצפי עניין באמצעות תוכנה שריר v3.8.3125. שימי שנוצר כדי לחפש המנורה ערכות תחל בתוך אזור ההכפלה של היעד, והימנע מטרות שאינן רלוונטיות או לא מכוונות, כגון הבחנות בין תתי סוגים של מטרה.
  2. בצע את כללי עיצוב המנורה תחל כפי שמתואר באינטרנט (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), לאפשר שימוש מעורב בסיסים ב תחל לכסות דיברגנץ וירוס26. כדי להימנע אשיג של ערכות פריימר, להשוות תחל המנורה שנוצר מסד הנתונים וירוס NCBI RNA באמצעות פיצוץ NCBI27. השווה בין כל ערכת לחסל תחל זה dimerize ב וזמינותו מרובבת באמצעות פיצוץ NCBI גם כן.
  3. מסך החלק גדילי כפול של החללית ועקרו מבתיהם סטרנד נגד כל רצף הגנום הנגיפי, רצף גנומית יתושים. שנה 5'-הקצוות של היעד מחייב בדיקה עם fluorescein amidite (FAM), צבע הקסדצימאלי 5-carboxytetramethylrhodamine (טמרה) צבע עבור Zika, chikungunya 1 דנגה, בהתאמה.
    1. פריימר בקרה חיובית עבור בדיקות שתן כוללות. עיצוב המנורה תחל למטרה דנ א מיטוכונדריאלי אנושי. תווית ועקרו מבתיהם סטרנד בדיקה עם ט' 5'-קצה. תווית כ'חטיף הגששים כי הם משלימים חלקית לכל fluorescently תוויות בדיקה עם כ'חטיף (למשל, איווה שחור-בזה) בקצה 3'-(טבלה 1).

2. וירוס מבודד ולא נגוע דגימות יתוש

  1. שימוש מבודד של Zika וירוס (זן פוארטו ריקו), וירוס Chikungunya (זן לה ראוניון או איי הבתולה הבריטיים), וירוס דנגה-serotype-1 (Key West זן). לקבוע titers ויראלי באמצעות שלט assay28 או RT-PCR כמותי29. תמצית RNAs ויראלי באמצעות ערכות חילוץ RNA זמינים מסחרית.
    הערה: בטבלה 2 מייצג את titers ויראלי של בידוד כל וירוס השתמשו במחקר זה.
  2. בצע את המאמר פורסם על ידי Yaren et al. . עבור פרוטוקול מפורט אודות הזיהום של Ae. aegypti נקבות עם וירוסים Zika ו- chikungunya20. ראה בטבלה 2 כייל ויראלי של המדגם יתוש נגוע בווירוס Zika.

3. RT-המנורה יחד עם אורציל Thermolabile דנ א Glycosylase

  1. 10 X הכנה מערבבים פריימר.
    1. להכין 100 מיקרומטר פתרון מניות של כל פריימר, בדיקה (ראו שלב 1) על-ידי הוספת נוקלאז מים חינם. מערבולת טוב וחנות ב-20 ° C עד השימוש.
    2. עבור 10 מיקס פריימר X עבור כל µL מיקס 16 Zika, קדחת דנגה 1 או היעד דנ א מיטוכונדריאלי, של FIP, 16 µL ביפ, 2 µL של F3, 2 µL של B3, 5 µL של אם, µL 2 של ליברות, 3 µL של LB-פלורסנט שכותרתו הגישוש, µL 4 של בדיקה כ'חטיף , ו- 50 µL של מים נטולי נוקלאז לתת סך של 100 µL נפח.
    3. עבור 10 פריימר X mix עבור Chikungunya, לערבב µL 16 של FIP, 16 µL ביפ, 2 µL של F3, 2 µL של B3, 5 µL של ק ג, 2 µL של אם, µL 3 של אם-פלורסנט בתווית בדיקה µL 4 של בדיקה כ'חטיף, µL 50 ללא נוקלאז מים לתת סך של 100 µL נפח.
      הערה: בדיקה הריכוז שתוארו לעיל שימושים 300 nM של החללית פלורסנט הסופי ואת 400 nM של בדיקה כ'חטיף. לחלופין, השתמש 80 nM של החללית fluorescently שכותרתו ואת 200 ננומטר של החללית שלו כ'חטיף לניתוח בזמן אמת.
  2. להוסיף 5 µL של 10 X מיקס פריימר (עבור 3-plex, להוסיף 5 µL של כל 10 X מיקס פריימר), 5 µL של 10 X הגברה איזותרמי מאגר (1 X מאגר הרכב: 20 מ מ טריס-HCl מאגר pH 8.8, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ (NH4)2אז4, 8 מ"מ MgSO4 0.1% Tween-20, 1 מ"מ DTT), µL 7 של תערובת dNTP (10 מ מ dATP, dCTP, dGTP; 5 מ מ של dTTP ו dUTP), 16 יחידות של ה-DNA פולימראז, 15 יחידות של רוורס טרנסקריפטאז, 80 יחידות ריבונוקלאז רקומביננטי, 2 יחידות של UDG thermolabile, µL 1-2 של כמויות משתנות של השישי ral RNAs ומים להביא את הנפח הכולל עד 50 µL 0.25 mL PCR צינור (ראה טבלה של חומרים).
  3. כוללים מבחני בקרה שלילית בשלב זה על-ידי החלפת נגיפי RNA נפח המים. דגירה בדגימות בין 65-68 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות ל- 1 h ולאחר מכן לנתח על-ידי הפעלת 5 µL של כל דגימה על 2.5% agarose ג'ל במאגר X TBE 1 המכיל אתידיום ברומיד (0.4 µg/mL). להשתמש 25 bp או 50 bp סולם הדנ א כמו סמן על הג'ל.
    הערה: תוספת של תבנית ספציפית-יעד היא אופציונלית.
  4. כדי לזהות הנוכחות של RNA פתוגניים, לבדוק כל ערכת פריימר ואת השליטה שלה לא-תבנית על-ידי משתנה ריכוז טמפרטורה ו/או מגנזיום, מאז כל ערכת פריימר RT-המנורה תוכנן לעבוד בטמפרטורות שונות (65 ° C עד 68 מעלות צלזיוס) או מגנזיום ריכוזי (6 עד 10 מ מ הסופי). הכינו את הניסויים בטמפרטורת החדר.

4. RT-המנורה באמצעות השתן עלה-RNA נגיפי

  1. לבחון RT-המנורה תחל משתנה ריכוז סופי של שתן (0%, 10%, 20% ו- 50%) ב- 50 µL של התגובה הכולל אמצעי אחסון. 10% ריכוז השתן הסופי, להוסיף 1 µL של RNA נגיפי µL 5 של שתן. עבור 20% ריכוז השתן הסופי, להוסיף 1 µL של RNA נגיפי µL 10 של שתן. עבור 50% ריכוז השתן הסופי, להוסיף 1 µL של RNA נגיפי 25 µL של שתן.
  2. ניטור בזמן אמת של RT-המנורה ב 10% של שתן, להשתמש מכשיר PCR בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים) עם מסנני fluorophore שונים.
    1. לקרוא אותות זריחה amplicons התווית על-ידי FAM עבור Zika, השתמש במסנן ועד 483 533 ננומטר; עבור התווית על-ידי הקס amplicons עבור chikungunya, השתמש במסנן ועד 523 568 ננומטר; עבור התווית על-ידי טמרה amplicons דנגה 1, השתמש במסנן ועד 558 610 nm; עבור התווית על-ידי ט amplicons של דנ א מיטוכונדריאלי, השתמש במסנן ועד 523 568 ננומטר.
      הערה: אחי יש maxima עירור, פליטה של 495 ננומטר, 520 nm, בהתאמה. HEX יש maxima עירור, פליטה של 538 nm ו 555 nm, בהתאמה. טמרה יש maxima עירור, פליטה של 559 nm ו 583 nm, בהתאמה. ט יש maxima עירור, פליטה של 522 nm ו 539 nm, בהתאמה.
  3. שימוש 96-ובכן צלחות חותם לצלחת עם סדין פלסטיק שקוף, דגירה בדגימות ב 65-68 מעלות צלזיוס למשך 60-90 דקות ואז להקליט קרינה פלואורסצנטית כל 30 s באמצעות הצנטרפוגה אור. בתחילה להשתמש 80 nM של הגששים fluorescently עם תוויות ולאחר מכן nM מבחן ה-300 של הגששים שכותרתו fluorescently.
    1. לקבוע גבול של גילוי עבור כל מטרה על-ידי הוספת באופן סדרתי מדולל RNAs ויראלי בריכוז השתן הסופי של 10%.
      הערה: השתמש בזמן אמת RT-מנורה כדי לקבוע טמפרטורה אופטימלית, מגנזיום, בדיקה fluorescently שכותרתו ריכוז לריכוז זמן התגובה.
  4. כדי להמחיש את קרינה פלואורסצנטית שנוצר על ידי סטרנד הגששים טרומי לחלוקה ניידים לפי העין, השתמש מקור אור LED כחולה מ הצנטרפוגה אור עם עירור-470 nm (כל קופסה ג'ל אלקטרופורזה עם מובנה מקור אור כחול לעבוד, עיין בטבלה של חומרים,) ולהקליט את התמונה עם מצלמה של טלפון סלולרי בטמפרטורת החדר בחושך.
    הערה: שימוש 300 nM של הגששים fluorescently שכותרתו, כאשר נדרשת הדמיה של כל שלושת הצבעים לפי העין באמצעות נורית כחולה.

5. RT-המנורה על זיהוי של יתושים הנגועים Zika באמצעות טכנולוגיית Q-נייר

  1. להכין רבעוני אמוניום-לאחרונה נייר סינון (Q-נייר), על-פי שיטות שפורסמו בעבר עם שינויים קלים30.
    1. לטבול 1g של עיגולים נייר סינון תאית (ראה טבלה של חומרים) עם קטרים של 3.5 ס"מ 50 מ של 1.8% תמיסה מימית NaOH למשך 15 דקות להפעלה.
    2. לאסוף עיגולים נייר מופעל על-ידי סינון אבק, ואז לטבול אותם 40 מ ל תמיסה מימית של כלוריד (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium (0.28 g) ללילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: לשמור על יחס המוני של כלוריד trimethylammonium (2, 3-epoxypropyl) נייר סינון-0.28 ל- 1.
    3. לאסוף את הנייר cationic הנוצרת על ידי סינון אבק, לנטרל עם 50 מ של 1% של חומצה אצטית.
    4. לשטוף את הנייר שלוש פעמים עם אתנול, מילה נהדרת. ברדס עם זרימת אוויר קבועה.
  2. חותכים גליונות נייר Q למלבנים קטנים (3 מ מ x 4 מ מ) באמצעות ניקוב נייר או מספריים. למחוץ יתושים הנשי Ae. aegypti שעשויות להיות נגוע Zika על כל נייר עם כבעלי מיקרו.
  3. להוסיף כל נייר µL 20 של 1 מ' אמוניה מימית פתרון (pH ≈ 12) והמתן 5 דקות. לאחר מכן לשטוף כל נייר פעם אחת עם 20 µL 50% EtOH ופעם µL 20 של נוקלאז ללא מים. מילה נהדרת את הנייר BSL-2 אבטחה ארון לשעה בערך.
    הערה: בשלב זה, דוגמאות ניתן לאחסן ב-20 ° C בלילה עד השימוש.
  4. באמצעות פינצטה, למקם את כל נייר ב- 100 µL תערובת התגובה RT-המנורה, דגירה ב 65-68 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות וודא כי מלא להטביע את העיתון בהפתרון; זה לא צריך צפים. לקרוא ולהקליט את קרינה פלואורסצנטית הנובעים וירוס Zika באמצעות מקור אור LED כחול ומסנן כתומה או צהובה.

6. lyophilization של RT-המנורה ריאגנטים עבור 100 µL של התגובה האחסון

  1. להכין תערובת פריימר X מנורה 10 לפי סעיף 3.1 והכן dNTP תערובת המכילה dUTP לפי סעיף 3.2. לאחסן פריימר תערובת dNTPs ב-20 ° C עד השימוש.
  2. הכינו 10 מ ל אנזים מאגר דיאליזה כדי להסיר גליצרול, על ידי ערבוב µL 100 של 1 מ' טריס-HCl pH 7.5, 500 µL של 1 מ' אשלגן כלורי, 2 µL של 0.5 M EDTA, 100 µL של 10% טריטון X-100, 100 µL של 0.1 M DTT, מ 9.198 ל נוקלאז ללא מים. חנות המאגר דיאליזה ב 4 º C.
    הערה: ודא לסינון (0.2-מיקרו פילטרים) מאגר כל ריאגנט הפתרונות מוקדמת להשתמש ולאחסן אותם ב 4 º C.
    1. שימוש של קרום אולטראפילטרציה עם מגבלת 10 של ניתוק kDa (ראה טבלה של חומרים). במקום 350 µL מאגר דיאליזה, 4 µL של 32 יחידות של ה-DNA פולימראז, 2 µL של 30 יחידות של רוורס טרנסקריפטאז ו 2 µL של 80 יחידות של מעכב RNase לתוך קרום אולטראפילטרציה צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    2. להוסיף עוד µL 350 דיאליזה מאגר אולטראפילטרציה ממברנה, צנטריפוגה (14,000 x g) עבור עוד 5 דק ריק הצינור אוסף, חזור על שלב זה, לאחר מכן צנטריפוגה (14,000 x g) למשך 3 דקות.
    3. עבור • תנאי, היפוך הקרום ומניחים בשפופרת אוסף חדש. ספין-1000 g x עבור 2 דק אמצעי האחסון • תנאי; אם פחות מ 8 µL, להביא את אמצעי האחסון עד 8 µL על-ידי הוספת המאגר דיאליזה. לאחסן את • תנאי ב 4 ° C, ומיד להמשיך לשלב הבא.
      הערה: פרוטוקול זה היא צינור יחיד lyophilization, אבל להכין טורפדו התגובה לפחות 10 בכל פעם באמצעות קרום אולטראפילטרציה אותו ולהשתמש כמות זהה של מאגר דיאליזה.
  3. לערבב µL 10 של 10 פריימר X מנורה אם singleplex (עבור 3-plex, להוסיף 10 µL של כל 10 X מיקס פריימר,) 14 µL תערובת dNTP, 8 µL של אנזים דיאליזה מיקס, 2 µL של 2 יחידות של thermolabile UDG ו µL 66 של נוקלאז ללא מים (עבור 3-פלקס להשתמש 46 µL) צינור microcentrifuge 0.5 mL, להשאיר פתח המכסה. במקום זאת, הוסף עוד המכסה ניקב עם מחט כדי לאפשר אדי לברוח.
  4. מיד להקפיא את הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, lyophilize צינור 4 h כיסוי תא lyophilization ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור. כאשר ריאגנטים עוברות ייבוש, להסיר את המכסים מנוקבת, סגור את המכסה המקורי, ולאחסן את הצינורות עם ריאגנטים lyophilized ב 4 ° C בחושך.
    הערה: ריאגנטים יכול להיות lyophilized בן לילה, במידת הצורך.

7. בדיקות Lyophilized RT-המנורה ריאגנטים על שתן ודוגמאות יתושים המכיל Zika

  1. השתמש בפריטים הבאים הערכה (ראה את הטבלה של חומרים) עבור Zika: קופסה התבוננות מודפס 3D עם מסנן כתום (מסנן לעבור זמן רב, גזור-און ~ 540 nm), 2 סוללות AAA להתבוננות תיבת, lyophilized התגובה צינורות בתווית ZV לגילוי Zika, ו 1.1 X התייבשות מאגר 1.5 mL מתברג צינורות.
  2. הכנת 50 מ של 1.1 X התייבשות מאגר על ידי ערבוב 5.5 mL של 10 X מאגר הגברה איזותרמי המגיע יחד עם ה-DNA פולימראז (ראה את הטבלה של חומרים), 3.3 מ ל 100 מ מ MgSO4, µL של 0.5 M DTT 110 ו מ 41.09 ל נוקלאז ללא מים. מערבבים היטב, aliquot 1 מ"ל של פתרון זה כדי 1.5 mL מתברג צינורות, ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  3. להוסיף 90 µL 1.1 X התייבשות מאגר כל שפופרת התגובה (0.5 מ"ל). ודא כי הנוזל ממלא את החלק התחתון של הצינור המכיל את ריאגנטים lyophilized (להמיס אותם עם ערבוב ע י ניעור, אז בקצרה ספין למטה (1,000 x g)). להוסיף 10 µL של דגימת שתן עם נגיפי RNA ל הצינורות התגובה (עיין בסעיף 4.1 לפרטים).
    1. אם בדיקות יתושים, להוסיף מלבן של Q-נייר מחזיק יתושים הגוויות (כפי שהוכנו בשלבים שמתואר בסעיפים 5.2 ו 5.3), יחד עם 10 µL לטהר מים במקום בדיקות שתן.
      הערה: לחלופין, להוסיף 10 µL של דגימות רוק או סרום במקום שתן. אם הדגימות שחולצו DNA או RNA, להוסיף 2-5 µL של המדגם לתערובת ולמיומנות ולהשלים במים נטולי נוקלאז µL 10 נפח דגימה הסופי.
  4. . סגור את המכסה של הצינורות התגובה למקם אותם חום בלוק/אמבטיה (או חממה) שנקבע מראש ב- 65-68 מעלות צלזיוס. דגירה למשך 30-45 דקות, אך לא יותר מ 1 h. לאחר דגירה, הסר את הצינור החום. כדי למנוע זיהום של מבחני בעתיד, להבטיח כי הצינורות האלה יישארו סגורים.
  5. המקום צינורות התגובה בתיבה התבוננות; הטמפרטורה ייפול לידי את טמפרטורת הסביבה (ועדיף 25 ° C). להפעיל את המתג של תיבת ההתבוננות. להתבונן מדגם דרך המסנן כתום וללכוד את התמונה על-ידי מצלמת טלפון סלולרי אשר מתקיים במרחק שבו התמונה ממלא 80% של שדה הראייה.
    הערה: כדי שתראי טוב יותר מושגת סביבות אור נמוכה.
  6. לאחר השלמת ויזואליזציה, לכבות את המתג. מאחסנים צינורות אטום בחושך, רצוי עם קירור, אם ויזואליזציה מאוחר יותר יש צורך.

תוצאות

בתחילה, ההופעות של כל פריימר RT-המנורה (טבלה 1) עם המצע המתאים RNA נגיפי שלה, כמו גם שליליות פקדים היו מוערך על ידי אלקטרופורזה בג'ל. RT-המנורה תחל תוכננו אזור NS5 היעד (תלויי-RNA RNA פולימראז) Zika ו- 1 דנגה, ואזור nsP2 (חלבון שאינן מבניות P2) עבור Chikungunya. תבניות היו RNA הכולל מופק מני...

Discussion

בעקיצות יתוש וירוסים כולל Zika, chikungunya דנגה מאיימים בריאות הציבור והאר האחרונות Zika התפרצויות הצורך חלופות בעלות נמוכה בשלב של טיפול הזיהוי אבחון המטופל, כמו גם עבור יתושים מעקב. הגברה איזותרמי שיטות פותחו חלופות במחיר סביר במערכות מבוססות-PCR כמו. במיוחד, RT-המנורה מבוססי פלטפורמות הוחלו לאית?...

Disclosures

מספר המחברים ומוסדות שלהם הבעלים של קניין רוחני המשויך זה וזמינותו.

Acknowledgements

העבודה נתמך בחלקה על ידי FDOH-7ZK15, NIAID 1R21AI128188-01. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך בחלקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, ובחלק מאת ביו מחקר תוכנית של פלורידה משרד הבריאות. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של NIH או משרד הבריאות של פלורידה. LLC כימיה קומבינטורית דינמי הוא הודה על תמיכתם תרומה לפרוייקט זה.

וירוס דנגה 1 (זן בול-KW010) היה בחביבות שסופקו על-ידי פלורידה המחלקה של בריאות הלשכה של מעבדות. Zika וירוס ולא את שושלת היוחסין אסיה של וירוס chikungunya נמסרו באדיבות על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. שושלת היוחסין של האוקיינוס ההודי של וירוס chikungunya סופק באדיבות על ידי רוברט טש (הפניה למרכז עולמי המתעוררים וירוסים, Arboviruses, דרך הסניף הרפואה באוניברסיטת טקסס, בגאלבסטון, טקסס) כדי UF-FMEL. אנו מודים ס בלאמי B. Eastmond, ס' אורטיז, ד ולז, ק' ויגינס, ZimLer רבי, ק' זירבל לקבלת סיוע עם המחקרים זיהום. אנו מודים גם מ ס קים למתן Q-נייר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Gel electrophoresis
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Applied Science05 015 278 001Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membraneMillipore SigmaUFC501096ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C CentrifugeMarshall ScientificEP-5417Ccentrifuge
Myblock Mini DrybathBenchmark ScientificBSH200drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry SystemLabconco7934020lyophilizer
all priers and probesIDTcustomRT-LAMP primers and probes
dNTP setBiolineBIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)PromegaU1191
Bst 2.0 WarmStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0538Lenzyme
WarmStart RTx Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0380Lenzyme
RNase Inhibitor, MurineNew England BiolabsM0314Lenzyme
Antarctic Thermolabile UDGNew England BiolabsM0372Lenzyme
50bp DNA Step LadderPromegaG4521marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche Applied Science4729692001real-time RT-LAMP analysis

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133Zikaread outRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved