بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Summary

التوسع في الشفرة الجينية بمثابة أداة قوية لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك أسيتيليشن البروتين. هنا نظهر بروتوكول سهلة لاستغلال هذه التقنية لتوليد البلوتينيوم أسيتيلاتيد البروتينات في مواقع معينة في خلايا الإشريكيّة القولونية .

Abstract

بوستترانسلاشونال التعديلات التي تحدث في مواقع محددة من البروتينات قد ثبت أن تلعب أدواراً هامة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. فيما بينها، أسيتيليشن يسين عكسها واحد لتوزيعها على نطاق واسع في جميع مجالات الحياة. على الرغم من أن تم إجراء العديد من الدراسات أسيتيلومي الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي، كذلك وصف هذه الأهداف acetylation المفترضة كانت محدودة. أحد الأسباب المحتملة هو أن من الصعب لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة في المواقف المطلوبة بمعظم النهج البيوكيميائية الكلاسيكية. للتغلب على هذا التحدي، تم تطبيق تقنية توسيع الشفرة الجينية لاستخدام الزوج من متغير سينثاتيز المهندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال، والمشابهة لها الحمض الريبي النووي النقال من أنواع ميثانوسارسيناسيي ، وتوجيه إدماج كوترانسلاشونال من أسيتيليسيني في موقع محدد في بروتين الفائدة. بعد التطبيق الأول في الدراسة من acetylation هستون، سهلت هذا النهج acetylation دراسات بشأن مجموعة متنوعة من البروتينات. في هذا العمل، أثبتنا بروتوكول السطحية لإنتاج البروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد باستخدام نموذج بكتيريا الإشريكيّة القولونية كالمضيف. مالات نازعة كمثال مظاهرة في هذا العمل.

Introduction

تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) من البروتينات التي تحدث بعد عملية الترجمة، وتنشأ عن إضافة المجموعات الوظيفية التساهمية لمخلفات الأحماض الأمينية، تضطلع بأدوار هامة في تقريبا جميع العمليات البيولوجية، بما في ذلك الجينات النسخ واستجابة الإجهاد والتمايز الخلوي والتمثيل الغذائي^1،،من²³. وحتى الآن، حوالي 400 مميزة قد بتمس المحددة⁴. المعضلة من الجينوم والبروتين يتم تضخيمه إلى حد كبير من قبل بتمس البروتين، كما أنها تنظم نشاط البروتين والتعريب، وتؤثر على التفاعل مع جزيئات أخرى مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون والعوامل المساعدة⁵.

وقد أسيتيليشن البروتين في طليعة الدراسات بتمس في آخر عقدين^6،،من^{78،9،10،11،12}. أسيتيليشن يسين كان أول من اكتشف في هيستونيس منذ أكثر من 50 عاماً^13،14، قد تم التدقيق جيدا، ومن المعروف أن توجد في أكثر من 80 من عوامل النسخ، والمنظمين، ومختلف البروتينات^{15، ،}من ¹⁶¹⁷. دراسات في أسيتيليشن البروتين قد وفر لنا فهما أعمق لآلياتها التنظيمية، بل يسترشد أيضا علاجات لعدد من الأمراض الناجمة عن اختلال أسيتيليشن^{18،19، 20 , 21 , 22 , 23}-وكان يعتقد أن acetylation يسين يحدث فقط في حقيقيات النوى، ولكن الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن acetylation البروتين كما تلعب أدواراً رئيسية في فسيولوجيا البكتيريا، بما في ذلك إنزيمية ومقاومة الأحماض والتنشيط وتحقيق الاستقرار في جزر الإمراضية وضراوة الأخرى المتعلقة بالبروتينات^24،25،،من^2627،،من²⁸²⁹.

باستخدام طريقة شائعة المتحلل تميز acetylation يسين الطفرات الموجهة من الموقع. الجلوتامين كتقليد أسيتيليسيني بسبب حجمها وقطبية مماثلة. ويستخدم ارجينين كتقليد يسين غير أسيتيلاتيد، نظراً لأنه يحتفظ تهمة إيجابية في ظل الظروف الفسيولوجية ولكن لا يمكن أن يكون أسيتيلاتيد. ومع ذلك، كلا يقلد ليست إيسوستيريس حقيقية ولا تسفر دائماً عن النتائج المتوقعة³⁰. النهج الأكثر صرامة لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد البلوتينيوم في المخلفات يسين محددة، التي من الصعب أو المستحيل على الأساليب الأكثر كلاسيكية بسبب ستويتشيوميتري منخفض من acetylation يسين في الطبيعة^7،11. وقد تم متدهور هذا التحدي في استراتيجية التوسع في الشفرة الجينية، التي توظف هندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز البديل من الأنواع ميثانوسارسيناسيي لشحن الحمض الريبي النووي النقال^{برونتوسوروس} مع أسيتيليسيني، يستخدم المضيف الآلات متعدية لقمع الفريق الاستشاري وقف كودون في مرناً، ويوجه إدماج أسيتيليسيني في موقف مصممة ل البروتين المستهدف³¹. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل هذا النظام مع الإنكليزية والفرنسية-تو-ملزمة الحمض الريبي النووي النقال تحسين³² ورفع مستوى أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز³³. وعلاوة على ذلك، نحن طبقت هذا النظام إدماج تعزيز الدراسات acetylation مالات نازعة³⁴ وتيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز³⁵. هنا، علينا أن نظهر البروتوكول من أجل توليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة من الاستنساخ الجزيئي لتحديد الهوية الكيميائية الحيوية باستخدام نازعة مالات (MDH)، الذي درسناه على نطاق واسع كمثال تتضح.

Protocol

1-موقع الموجه الطفرات الجينات المستهدفة

ملاحظة: يتم التعبير عن MDH تحت T7 المروج في ناقل ثنائي بنزوفيوران متعدد الكلور-1 مع مصدر CloDF13 وعدد نسخة من 20 إلى 40³⁴.

1. إدخال كودون وقف العنبر في موقف 140 في الجينات بالاشعال (الأمام التمهيدي: جتجتتاتجاكعلامةآكااكتجتتكجكج وعكس التمهيدي: جكتتتتتكاجكاكتكاجكاجكاتجك)، بناء على تعليمات الطقم الطفرات الموجهة من الموقع.
2. تضخيم بلازميد القالب الذي يحتوي على الجين من مالات البرية من نوع ديهيدراتاسي، وإدراج طفرة كودون التوقف عن البلمرة (PCR) سلسلة من ردود الفعل. في خليط رد فعل، تشمل 12.5 ميليلتر من مزيج إنزيم بوليميريز الحمض الخلوي الصبغي X 2، ميليلتر 1.25 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام، ميليلتر 1.25 من 10 ميكرون عكس التمهيدي، 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر) (بلازميدثنائي بنزوفيوران متعدد الكلور-1 التي تحتوي على الجينات البرية من نوع MDH)، و 9 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
   1. استخدام معلمات تفاعل PCR كما يلي: الأولى تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 25 من 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 ثانية على 55 درجة مئوية، و 3 دقيقة في 72 درجة مئوية؛ التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد بكر، إضافة مواد تضخيم مباشرة إلى هذا المزيج إنزيم كيناز-ليجاسى-دبني من الطقم ح 1 لإزالة قالب وعلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الخليط رد يحتوي على 1 ميليلتر المنتج بكر، 5 ميليلتر من 2 × رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 10 X كيناز-ليجاسى-دبني إنزيم ميكس وميليلتر 3 من المياه خالية من نوكلاس.
3. إضافة 5 ميليلتر من مزيج رد فعل للأنبوب من 25 ميليلتر مذاب المختصة كولاي الخلايا DH5α من الطقم. عناية نفض الغبار على أنبوب لمزيج، ووضع الخليط على الجليد ل 30 دقيقة صدمة الحرارة المخلوط في 42 درجة مئوية 30 ثانية، ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
   1. "الماصة؛" 600 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة مرق "سوبر الأمثل" مع وسائل الإعلام في القمع (شركة نفط الجنوب) كاتابوليتي من المجموعة في المخلوط، واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الهز 250 لفة في الدقيقة، وانتشر 100 ميليلتر على صفيحة ليسوجيني أجار مرق (رطل) مع المضادات الحيوية المقابلة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
4. اختيار المستعمرات واحدة 4-6 إلى 6 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية المقابلة، واحتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز 250 لفة في الدقيقة. استخراج البلازميدات من كل ثقافة بين عشية وضحاها بأدوات تنقية بلازميد، عقب دليل الشركة المصنعة، ثم إرسال والبلازميدات لتسلسل الحمض النووي وفقا لبروتوكول مزود الخدمة للتأكد من أن الطفرة كودون التوقف في المواضع الصحيحة.
5. تخزين السلالة مع التسلسل الصحيح في-80 درجة مئوية عن طريق خلط الثقافة بين عشية وضحاها 1 مل و 300 ميليلتر 100% [دمس].

2-التعبير عن البروتين أسيتيلاتيد

1. إدخال جينات محسن أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز³³ والأمثل الحمض الريبي النووي النقال^{برونتوسوروس 32} إلى بلازميد تك . مكان الجينات الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز تحت المروج التأسيسي الطب الخاص المحدود . مكان الجينات الحمض الريبي النووي النقال تحت المروج التأسيسي proK ³⁴.
   1. شارك تحويل ناقلات التعبير³⁴ تحتوي على الجينات التي تحتوي على العلامة المتحولة من نازعة مالات، وبلازميد إيواء النظام إدراج أسيتيليسيني الأمثل، إلى 25 ميليلتر المختصة المذابة كولاي BL21(DE3) الخلايا التي صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية 10 s، ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
   2. "الماصة؛" 600 ميليلتر لوسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب درجة حرارة الغرفة إلى الخليط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الهز 275 لفة في الدقيقة، وانتشر 100 ميليلتر على طبق من ذهب مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 50 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 275 لفة في الدقيقة.
2. التقاط مستعمرة واحدة من اللوحة، وتطعيم في 15 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين والكلورامفينيكول 50 ميكروغرام/مل في أنبوب 50 مل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع تهتز بسرعة 250 لفة في الدقيقة. نقل الثقافة بين عشية وضحاها 15 مل إلى 300 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية في قارورة ل 1، واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
3. حل أسيتيليسيني بالماء لجعل الحل الأسهم 100 مم، تخزين في 4 درجات مئوية. إضافة أسيتيليسيني 5 مم و 20 مم نيكوتيناميد (مثبطات ديسيتيلاسيس) إلى وسائط النمو عندما يصل امتصاص 0.5 في 600 نانومتر.
   1. تنمو خلايا ح 1 إضافية عند 37 درجة مئوية، تهز 250 لفة في الدقيقة، ثم إضافة 0.5 مم إيبتج للتعبير البروتين، وتنمو الخلايا عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها، مع الهز 180 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى شروط التعبير الأمثل للبروتينات المختلفة.
4. جمع الخلايا من سينتريفوجينج في س 3,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتجاهل المادة طافية، وتغسل الكريات الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) المخزن المؤقت (10 مم نا₂هبو₄، 1.8 مم خ₂ص₄، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل). جمع الخلايا غسلها في س 10,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وتخزين خلايا الكريات في-80 درجة مئوية.

3-تنقية البروتين أسيتيلاتيد

1. ذوبان الجليد الكريات خلية مجمدة في الجليد، وإعادة تعليق مع 15 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) الأس الهيدروجيني 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 مم، ونيكوتيناميد 20 مم)، 5 ميليلتر β-ميركابتوثانول ونوكلياسي بينزوناسي ميليلتر 1 (250 وحدة).
2. كسر الخلايا من سونيكيشن 40 كيلو هرتز في 70% طاقة الإنتاج مع دورات 10 من 10 s رشقات نارية قصيرة، تليها فترات 30 ثانية للتبريد لاستخراج النفط الخام شكل. استخراج النفط الخام من أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية المادة طافية مع عامل تصفية غشاء 0.45 ميكرومتر، وتحميل في عمود يحتوي على 1 مل من النيكل-نيتروتراياكتيك الراتنج (ني-جاتا) حمض اكويليبراتيد مع 20 مل من المياه و 20 مل من تحلل المخزن المؤقت.
   ملاحظة: يمكن أيضا كسر الخلايا من المنظفات معتدل، إذا لم يتوفر sonication.
3. أغسل العمود مع 20 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (50 مم تريس pH 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم وايميدازول 50 مم 20 مم نيكوتيناميد)، ومن ثم الوت مع 2 مل من المخزن المؤقت شطف (50 مم تريس pH 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 150 مم، و 20 مم نيكوتيناميد).
4. تحلية الكسر شطف مع الملحي العازلة (25 مم تريس pH 7.8 و 10 مم كلوريد الصوديوم) حسب العمود PD-10، عقب الدليل الخاص بالشركة المصنعة. قياس تركيز البروتين التيد باتباع تعليمات الكاشف مقايسة البروتين برادفورد. البروتين ديسالتيد على استعداد لإجراء مزيد من التجارب.
   ملاحظة: جعل الأسهم والغليسيرول 50 في المائة من البروتين، وتبقى في-80 درجة مئوية للتخزين.

4-الكيمياء الحيوية توصيف البروتين أسيتيلاتيد

1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وكتلة التحليلات قياس الطيف الكتلي.
   1. تؤذي البروتينات مع الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة المخزن المؤقت (5 ميليلتر البروتين عينة، مع 2 ميليلتر 4 × العازلة عينة الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 2 مل في 105 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والطرد المركزي المخلوط في 2000 غ س ل 10 ق، التحميل على 4-20% الصوديوم دوديسيل كبريتات جل بولياكريلاميدي اليكتروف هلام أوريسيس (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وتشغيل 200 الخامس لمدة 30 دقيقة.
   2. أغسل الهلام مع الماء المقطر وهزه برفق لمدة 5 دقائق، تكرار العملية 3 مرات. تجاهل الماء، ووصمة عار للهلام مع أخذ الأزرق وصمة عار ح 1 مع الهز لطيف. إزالة وصمة عار للهلام مع الماء المقطر، هزة بلطف و 30 دقيقة، وكرر هذا إزالة وصمة عار 3 مرات.
   3. قص الفرقة في كاتشين 33 في هلام أخذ الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة باللون الأزرق، وإرسالها إلى مرافق الكتلي أو شركات لتأكيد تأسست في أسيتيليسيني في وضع تصميم.
      ملاحظة: بروتوكول تحليل الطيف الكتلي عقب التجربة السابقة³⁴.
2. النشاف الغربية
   1. تشغيل هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع البروتوكول نفسه في الخطوة 4، 1. بعد الجل تشغيل، نقع الهلام مع نقل المخزن المؤقت (25 مم تريس و 192 مم جليكاين، الأس الهيدروجيني 8.3 و 20% ميثانول) لمدة 15 دقيقة.
   2. تنشيط من 0.2 ميكرومتر، 7 سم × 8.5 سم غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع الميثانول لمدة 1 دقيقة، وشطف مع نقل المخزن المؤقت قبل إعداد ساندويتش نقل.
      ملاحظة: الميثانول الخطرة في حالة تماس الجلد أو العين الاتصال، وابتلاع أو استنشاق. شديدة التعرض المفرط يمكن أن يؤدي إلى الوفاة.
   3. جعل ساندويتش نقل من الكاثود إلى اﻷنود (الأسفنج ورق الترشيح، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام، PVDF غشاء، تصفية والورق والإسفنج). وضع المكدس في خزان نقل، تشغيل في التيار المستمر من 350 mA لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى نقل الوقت الأمثل.
   4. يغسل الغشاء PVDF 25 مل تريس مخزنة المالحة، 0.1% توين 20 (تبسة) (137 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس، 0.1% 20 توين، ودرجة الحموضة 7.6) المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف. كتلة الغشاء مع 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في المخزن المؤقت تبسة ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
   5. احتضان الغشاء بجسم أسيتيليسيني HRP مترافق مع تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل المخفف مع جيش صرب البوسنة 5% في تبسة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الهز لطيف.
      ملاحظة: للحصول على نتائج أسرع، ويمكن تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة ح 1. التخفيف من الأجسام المضادة قد تحتاج إلى التحسين.
   6. يغسل الغشاء مع 20 مل تبست المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف، تكرار الخطوة 4 مرات. تطبيق الركيزة تشيميلومينيسسينسي للغشاء باتباع إرشادات الشركة المصنعة. التقاط الإشارات مع جهاز اقتران (CCD) المستندة إلى كاميرا التصوير الصوتي.

النتائج

عائد البروتين MDH أسيتيلاتيد كان 15 ملغ في الثقافة 1 لتر، بينما من البرية من نوع MDH 31 ملغ في الثقافة 1 لتر. تم تحليل البروتينات المنقاة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كما هو مبين في الشكل 1. MDH البرية من نوع كمراقبة إيجابية³⁴. البروتين تنقيته من الخ?...

Discussion

ويستند إدراج الوراثية للأحماض الأمينية نونكانونيكال (ncAAs) قمع كودون المعينة، معظمهم إيقاف العنبر كودون الفريق الاستشاري^{36،37،38،39}، بالحمض الريبي النووي النقال المشحون نكا تحتوي على أنتيكودون المقابلة. وكما هو معروف، كو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking