Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Zusammenfassung

Erweiterung des genetischen Codes dient als ein mächtiges Werkzeug für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich Protein Acetylierung zu studieren. Hier zeigen wir, dass eine einfache Protokoll nutzen diese Technik zur Erzeugung von homogen Proteine an bestimmten Standorten in Escherichia coli Zellen acetyliert.

Zusammenfassung

Post-translationalen Modifikationen, die an bestimmten Positionen von Proteinen entstehen nachweislich in einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Unter ihnen ist eines der am weitesten verbreitete reversible Lysin Acetylierung in allen Bereichen des Lebens. Obwohl zahlreiche Massenspektrometrie-basierte Acetylome Studien durchgeführt worden, weitere wurde Charakterisierung dieser vermeintlichen Acetylierung Ziele beschränkt. Ein möglicher Grund ist, dass es schwierig ist, rein Schimmelpilzschäden Proteine an den gewünschten Positionen durch die meisten klassischen biochemischen Ansätzen zu generieren. Um diese Herausforderung zu meistern, hat die genetischen Code Ausbau Technik angewendet, um das Paar ein veränderter Pyrrolysyl-tRNA Synthestase Variante und seine Verwandten tRNA von Methanosarcinaceae Arten verwenden, um die cotranslational Aufnahme leiten der Acetyllysine auf der Website des Proteins des Interesses. Nach der ersten Anwendung in der Studie von Histon Acetylierung hat dieser Ansatz Acetylierung Studien auf einer Vielzahl von Proteinen erleichtert. In dieser Arbeit haben wir eine einfache Protokoll zur ortspezifisch Schimmelpilzschäden Proteine zu produzieren, mit dem Modell Bakterium Escherichia coli als Gastgeber gezeigt. Malat-Dehydrogenase diente als ein Demo-Beispiel in diesem Werk.

Einleitung

Post-translationalen Modifikationen (PTMs) von Proteinen auftreten, nachdem Sie den Übersetzungsprozess und entstehen durch kovalente Zugabe von funktionellen Gruppen zu Aminosäurereste, spielen eine wichtige Rolle in fast allen biologischen Prozessen, einschließlich gen Transkription, Stress-Reaktion, Zelldifferenzierung und Stoffwechsel^1,2,3. Bis heute wurden etwa 400 unverwechselbaren wurden PTMs identifizierten⁴. Die Komplexität des Genoms und die Proteome wird zu einem großen Teil durch Protein PTMs verstärkt, wie sie Proteinaktivität und Lokalisierung zu regulieren, und die Interaktion mit anderen Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden Cofaktoren^{5 beeinflussen}.

Protein-Acetylierung wurde an der Spitze der PTMs Studien in den letzten zwei Jahrzehnten^{6,7,8,9,10,11,12}. Lysin Acetylierung wurde zuerst in Histone vor mehr als 50 Jahren entdeckt,^13,14, wurde auch geprüft, und ist bekannt in mehr als 80 Transkriptionsfaktoren, Regulatoren und verschiedene Proteine^{15vorhanden sein, 16,17}. Studien über Protein Acetylierung haben nicht nur uns ein tieferes Verständnis für seine Regulationsmechanismen zur Verfügung gestellt, aber auch Behandlungen für eine Reihe von Krankheiten, die durch dysfunktionalen Acetylierung^18,19, geführt ^{20 , 21 , 22 , 23}. glaubte man, dass Lysin Acetylierung nur in Eukaryoten geschieht, aber neuere Studien gezeigt haben, dass Protein Acetylierung spielt auch Schlüsselrollen in der bakteriellen Physiologie einschließlich Chemotaxis, Säurebeständigkeit, Aktivierung und Stabilisierung der im Zusammenhang mit Proteinen^{24,25,26,27,28,29}, Pathogenitätsinseln und andere Virulenz.

Eine häufig verwendete Methode, biochemisch Lysin Acetylierung zu charakterisieren ist Site-verwiesene Mutagenese verwendet. Glutamin dient als eine Imitation des Acetyllysine wegen der ähnlichen Größe und Polarität. Arginin wird als ein nicht acetyliert Lysin Mimic genutzt, da es seine positiven Ladung unter physiologischen Bedingungen bewahrt aber kann nicht acetyliert. Jedoch beide Mimik sind nicht real Isosteres und nicht immer die erwarteten Ergebnisse³⁰Ausbeute. Der strengste Ansatz soll homogen Schimmelpilzschäden Proteine an bestimmten Lysin Rückstände zu generieren, das ist schwierig oder unmöglich für die meisten klassischen Methoden aufgrund der niedrigen Stöchiometrie von Lysin Acetylierung in Natur^7,11. Diese Herausforderung hat durch den genetischen Code Expansionsstrategie, die ein veränderter Pyrrolysyl-tRNA Synthestase beschäftigt entwirrt worden Variante von Methanosarcinaceae Arten tRNA aufladen^Pyl mit Acetyllysine, nutzt den Host Translationale Maschinen zu unterdrücken, die UAG Codon in der mRNA zu stoppen und leitet die Einbeziehung von Acetyllysine in der gestalteten Position der Ziel-Protein-³¹. Vor kurzem haben wir dieses System mit einer verbesserten EF-Tu-Bindung tRNA-³² und eine verbesserte Acetyllysyl-tRNA Synthestase³³optimiert. Darüber hinaus haben wir dieses System verbesserte Einbindung in Acetylierung Studien Malate Dehydrogenase³⁴ und Tyrosyl-tRNA Synthestase³⁵angewandt. Hier zeigen wir das Protokoll zur Erzeugung von rein Schimmelpilzschäden Proteine aus der molekularen Klonen biochemische Identifizierung mithilfe von Malat-Dehydrogenase (MDH), die wir als demonstratives Beispiel ausgiebig studiert haben.

Protokoll

1. Site-verwiesene Mutagenese des Zielgens

Hinweis: MDH drückt sich unter T7 Promotor im pCDF-1 Vektor mit den CloDF13 Ursprung und Ausfertigung von 20 bis 40³⁴eine eigene Nummer.

1. Einführung der Bernstein Stopcodon an der Position 140 im gen durch Primer (Grundierung weiterleiten: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG und reverse Primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), entsprechend den Anweisungen des Site-verwiesene Mutagenese Kit.
2. Verstärken Sie die Vorlage Plasmid enthält das gen der Wildtyp Malat Dehydratase zu, und legen Sie die Stopp-Codon-Mutation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Reaktion. Im Reaktionsgemisch, gehören 12,5 µL 2 X DNA-Polymerase-Enzym-Mix, 1,25 µL 10 µM Forward Primer, 1,25 µL 10 µM-rückwärts-Primer, 1 µL DNA-Vorlage (20 ng/µL) (pCDF-1 Plasmid enthält das gen der Wildtyp MDH), und 9 µL Nuklease-freies Wasser.
   1. PCR-Reaktion-Parameter wie folgt zu verwenden: initiale Denaturierung bei 98 ° C für 30 s; 25 Zyklen von 10 s bei 98 ° C, 30 s bei 55 ° C und 3 min bei 72 ° C; letzte Verlängerung bei 72 ° C für 3 Minuten. Fügen Sie nach PCR die verstärkte Material direkt an die Kinase-Ligase-DpnI Enzym-Mix aus dem Kit für 1 h bei Raumtemperatur Circularization und Vorlage zu entfernen.
      Hinweis: Das Reaktionsgemisch enthält 1 µL des PCR-Produkt, 5 µL 2 X Reaktion Puffer 1 µL 10 X Kinase-Ligase-DpnI Enzym-Mix und 3 µL Nuklease-freies Wasser.
3. Fügen Sie 5 µL der Reaktion Mischung in das Röhrchen von 25 µL aufgetaut kompetente E. Coli DH5α Zellen aus dem Kit. Vorsichtig streichen Sie das Rohr zu mischen, und legen Sie die Mischung auf dem Eis für 30 min. Hitzeschock die Mischung bei 42 ° C für 30 s und Platz für weitere 5 min auf Eis.
   1. Pipette 600 µL der Raumtemperatur Optimal Super Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien aus dem Kit in die Mischung, mit Schütteln bei 250 u/min bei 37 ° C für 60 min inkubieren, 100 µL auf ein Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum zu verbreiten , und über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min inkubieren.
4. Wählen Sie 4-6 einzelne Kolonien in 6 mL frisches LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum und Inkubation bei 37 ° C über Nacht mit 250 u/min schütteln. Extrahieren Sie Plasmide aus jede Nacht Kultur durch das Plasmid-Reinigung-Kit, nach Anleitung des Herstellers, dann senden Plasmide für DNA-Sequenzierung nach dem Protokoll des Service-providers, die Stopp-Codon Mutation an den richtigen Positionen zu bestätigen.
5. Speichern Sie die Belastung mit der richtigen Reihenfolge bei-80 ° C durch das Mischen von 1 mL über Nacht Kultur und 300 µL 100 % DMSO.

(2) Ausdruck des Proteins Schimmelpilzschäden

1. Legen Sie die Gene des optimierten Acetyllysyl-tRNA Synthestase³³ und optimiert tRNA^{Pyl 32} in der weder Plasmid. Legen Sie die tRNA Synthestase gen unter der konstitutiven Lpp -Promoter. Legen Sie die tRNA-gen unter die konstitutive ProK Promotor³⁴.
   1. Co der Ausdruck Vektor³⁴ mit TAG-haltigen mutierten Gens Malat-Dehydrogenase zu verwandeln, und das Plasmid beherbergen das optimierte Acetyllysine Aufnahme-System, in 25 µL aufgetauten kompetente E. Coli BL21(DE3) Zellen durch Hitzeschock bei 42 ° C für 10 s und Platz für weitere 5 min auf Eis.
   2. Pipette 600 µL Raumtemperatur SOC Medien in die Mischung, Inkubation bei 37 ° C für 60 min mit Schütteln bei 275 u/min, 100 µL auf einen Teller mit 100 µg/mL Streptomycin und 50 µg/mL Chloramphenicol zu verbreiten und über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 275 u/min inkubieren.
2. Nehmen Sie eine einzige Kolonie von der Platte, und in 15 mL frisches LB-Medium mit 100 µg/mL Streptomycin und 50 µg/mL Chloramphenicol in einer 50 mL-Tube über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln mit der Geschwindigkeit von 250 u/min zu impfen. Die 15 mL über Nacht Kultur auf 300 mL frisches LB Medien mit Antibiotika in eine 1 L Flasche übertragen und unter Schütteln bei 250 u/min bei 37 ° C inkubieren.
3. Auflösen von Acetyllysine mit Wasser zu 100 mM Stammlösung, bei 4 ° c lagern Hinzufügen Acetyllysine 5 mM und 20 mM Nicotinamid (Hemmer der Deacetylases) die Wachstumsmedien erreicht Extinktion 0,5 bei 600 nm.
   1. Wachsen Sie Zellen für weitere 1 h bei 37 ° C, bei 250 u/min, schütteln dann fügen Sie 0,5 mM IPTG für Protein-Expression hinzu, und wachsen Sie Zellen bei 25 ° C über Nacht, mit 180 u/min schütteln.
      Hinweis: Der Ausdruck Bedingungen ggf. Optimierung für verschiedene Proteine.
4. Sammeln Sie Zellen von 3.000 x g bei 4 ° C für 15 min Zentrifugieren, verwerfen Sie überstand und waschen Sie Zelle Pellets mit dem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer (10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Sammeln Sie gewaschene Zellen bei 10.000 x g bei 4 ° C für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und speichern Sie Zelle Pellets bei-80 ° C.

3. Reinigung von Schimmelpilzschäden Protein

1. Tauen Sie die gefrorenen Zellen Pellets auf Eis, und wieder mit 15 mL Lyse-Puffer (50 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol und Nicotinamid 20 mM), aussetzen Sie 5 µL des β-Mercaptoethanol und 1 µL Benzonase Nuklease (250 Einheiten).
2. Zellen zu brechen, indem 40 kHz Beschallung bei 70 % Leistung mit 10 Zyklen von 10 s kurze Bursts, gefolgt von Abständen von 30 s für Abkühlung auf Rohöl Extrakt Form. Zentrifuge Roh extrahieren bei 20.000 x g für 25 min bei 4 ° C. Filtern des Überstands mit 0,45 µm Membranfilter, und laden Sie in eine Spalte mit 1 mL der Nickel-Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA) Harz mit 20 mL Wasser und 20 mL Lyse Puffer equilibriert.
   Hinweis: Zellen können auch durch milde Reinigungsmittel, gebrochen werden, wenn Beschallung nicht verfügbar ist.
3. Waschen Sie die Spalte mit 20 mL Waschpuffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol und 20 mM Nicotinamid), und dann mit 2 mL Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazol und 20 mM Nicotinamid) eluieren.
4. Entsalzen Sie den Elution Bruch mit Entsalzung Puffer (25 mM Tris pH 7,8 und 10 mM NaCl) die Spalte "PD-10", nach Anleitung des Herstellers. Messen Sie die Konzentration der eluierten Proteins durch entsprechend den Anweisungen des Bradford Protein Assay Reagenz. Das entsalzte Protein ist bereit für weitere Experimente.
   Hinweis: 50 % Glycerin Lager des Proteins, und bei-80 ° C für die Lagerung.

(4) biochemische Charakterisierung des Schimmelpilzschäden Proteins

1. SDS-PAGE und Mass Spectrometry Analysen.
   1. Denaturieren Proteine mit dem Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Probenpuffer (5 µL Protein Probe mit 2 µL 4 X SDS-Probenpuffer) in eine 2 mL-Tube bei 105 ° C für 5 min, Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 2000 X g für 10 s, Last auf die 4-20 % Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel Electroph Oresis (SDS-PAGE) Gel und Lauf bei 200 V für 30 Minuten.
   2. Waschen Sie das Gel mit destilliertem Wasser und schütteln Sie sanft für 5 min, wiederholt den Vorgang 3 Mal. Entsorgen Sie das Wasser, und färben Sie das Gel mit Coomassie blaue Fleck für 1 h mit sanft schütteln. De-Fleck das Gel mit destilliertem Wasser, schütteln Sie sie leicht für 30 Minuten, und wiederholen Sie dies 3 Mal de-Fleck.
   3. Schneiden Sie die Band an 33 kDa auf dem Coomassie Blau gefärbten SDS-PAGE Gel, und senden Sie es an Massenspektrometrie Einrichtungen oder Unternehmen, um zu bestätigen, dass die Acetyllysine an der gestalteten Position aufgenommen wurde.
      Hinweis: Das Protokoll der Massenspektrometrie Analyse folgte der früheren Experiment³⁴.
2. Westliche Beflecken
   1. Führen Sie die SDS-PAGE-Gel mit dem gleichen Protokoll im Schritt 4.1. Genießen Sie nach dem Gel laufen das Gel mit dem Transfer-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin pH 8,3 und 20 % Methanol) für 15 Minuten.
   2. Aktivieren Sie einer 0,2 µm, 7 x 8,5 cm Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit Methanol für 1 min, und spülen Sie mit Transfer Puffer vor der Vorbereitung der Übertragung-Sandwich.
      Hinweis: Methanol ist gefährlich bei Hautkontakt, Blickkontakt, verschlucken oder einatmen. Schweren Überbelichtung kann zu Tod führen.
   3. Die Transfer-Sandwich von Kathode zu Anode (Schwamm, Filterpapier, SDS-PAGE Gel, PVDF Membran, Filterpapier und Schwamm) zu machen. Legen Sie den Stapel in den Transfer-Tank, laufen mit konstanter Strom von 350 mA für 45 Minuten.
      Hinweis: Der Transfer kann Optimierung benötigen.
   4. Waschen Sie die PVDF-Membran mit 25 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1 % Tween-20, pH 7.6) Puffer für 5 min mit sanft schütteln. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) im TBST Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.
   5. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugierten Acetyllysine-Antikörper mit einer Endkonzentration von 1 µg/mL verdünnt mit 5 % BSA in TBST bei 4 ° C über Nacht mit sanft schütteln.
      Hinweis: Für schnellere Ergebnisse könnte dieser Schritt in 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Verdünnung der Antikörper kann Optimierung benötigen.
   6. Waschen Sie die Membran mit 20 mL TBST Puffer für 5 min mit sanft schütteln, wiederholen die Schritt 4 Mal. Gelten der Chemilumineszenz-Substrat für die Membran durch Anweisungen des Herstellers. Erfassen Sie das Signal mit einem Ladegerät – gekoppelt (CCD) Kamera-basierte Imager.

Ergebnisse

Die Ausbeute an Schimmelpilzschäden MDH Protein war 15 mg pro 1 L Kultur, während das Wildtyp MDH 31 mg pro 1 L Kultur war. Gereinigten Proteine wurden von SDS-PAGE analysiert, wie in Abbildung 1dargestellt. Der Wildtyp MDH diente als eine Positivkontrolle³⁴. Das Protein gereinigt von Zellen beherbergen das Acetyllysine (AcK)-Aufnahme-System und das mutierte Mdh -gen, aber ohne AcK im Wachstumsmedium, diente als Negativkontr...

Diskussion

Die genetische Einbeziehung der noncanonical Aminosäuren (NcAAs) basiert auf der Unterdrückung der einen zugewiesenen Codon, meist die Bernstein Stopp-Codon UAG^36,37,38,39, von der ncAA aufgeladen tRNA enthält die entsprechenden Anticodon. Wie bekannt ist, ist das UAG-Codon von den Release Faktor-1 (RF1) in Bakterien erkannt, und es kann auch unterdrückt werden, indem in der Nähe von cogna...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking