在大肠杆菌中生成特异的乙酰蛋白的简易协议

摘要

基因编码扩展是研究广泛的生物过程, 包括蛋白质乙酰化的有力工具。在这里, 我们演示了一个轻便的协议, 利用这种技术, 在特定的地点, 在大肠杆菌细胞生成均匀乙酰蛋白。

摘要

在蛋白质的特定位置发生的后平移修饰被证明在多种细胞过程中发挥重要作用。其中, 可逆赖氨酸乙酰化是最广泛分布在生活的所有领域之一。尽管已经进行了大量的质谱 acetylome 研究, 但对这些假定的乙酰化靶点的进一步定性是有限的。一个可能的原因是, 它是很难产生纯乙酰蛋白质在理想的位置, 大多数经典的生物化学方法。为了克服这一挑战, 基因编码扩展技术已被应用于使用一对工程 pyrrolysyl tRNA 合成酶变种, 其同源 tRNA 从Methanosarcinaceae物种, 以指导 cotranslational 公司成立acetyllysine 在特定的地点的蛋白质的利益。在首次应用于组蛋白乙酰化的研究中, 这种方法促进了对各种蛋白质的乙酰化研究。在这项工作中, 我们展示了一个简便的协议, 以生产现场特定的乙酰蛋白, 使用模型细菌大肠埃希菌作为宿主。以苹果酸脱氢酶为例。

引言

转录后的修饰 (PTMs) 的蛋白质发生后, 翻译过程, 并产生了共价键增加功能基团的氨基酸残留, 在几乎所有的生物过程中扮演重要的角色, 包括基因转录, 应激反应, 细胞分化和新陈代谢^1,2,3。到目前为止, 已确定了大约400独特的 PTMs⁴。基因组和蛋白质的复杂性在很大程度上被蛋白质 PTMs, 因为它们调节蛋白质活性和定位, 并影响与其他分子的相互作用, 如蛋白质、核酸、血脂和因子⁵。

在过去二十年中, 蛋白质乙酰化一直处于 PTMs 研究的前沿^{6、7、8、9、10、11、12}。在组蛋白中首次发现的赖氨酸乙酰化超过50年前的^13,14, 已被仔细检查, 并已知存在于超过80转录因子、调节器和各种蛋白质¹⁵中^{, 16,17}。对蛋白质乙酰化的研究不仅为我们提供了对其调节机制的更深的了解, 而且也为一些因功能失调而引起的疾病进行了指导治疗^{18,19,20,21,22,23}. 据认为, 赖氨酸乙酰化只发生在真核生物, 但最近的研究表明, 蛋白质乙酰化也发挥关键作用的细菌生理学, 包括趋化性, 耐酸, 活化, 稳定致病性岛屿及其他毒力相关蛋白^{24,25,26,27,28,29}。

一种常用的方法来生化的特点赖氨酸乙酰化是使用定点诱变。谷氨酰胺被用作 acetyllysine 的模拟, 因为它的大小和极性相似。精氨酸被用作非乙酰赖氨酸的模拟, 因为它在生理条件下保留了正电荷, 但不能乙酰。但是, 这两种模拟都不是真正的 isosteres, 并且并不总能产生预期的结果³⁰。最严谨的方法是在特定的赖氨酸残留物中生成均匀的乙酰蛋白, 这对于大多数经典方法来说是困难或不可能的, 因为在自然界中, 赖氨酸乙酰化的低化学计量性^7,11。这一挑战已被解开的遗传代码扩展战略, 采用了工程 pyrrolysyl-tRNA 合成酶变种从Methanosarcinaceae物种的收费 tRNA^Pyl与 acetyllysine, 利用主机用于抑制 mRNA 中的 UAG 停止密码子的平移机械, 并指示在目标蛋白³¹的设计位置中合并 acetyllysine。最近, 我们优化了这个系统, 改进了 EF Tu 绑定 tRNA³²和升级后的 acetyllysyl-tRNA 合成酶³³。此外, 我们在苹果酸脱氢酶³⁴和氨-tRNA 合成酶³⁵的乙酰化研究中应用了这种增强的并网系统。本文以苹果酸脱氢酶 (MDH) 为例, 研究了从分子克隆到生物化学鉴定的纯乙酰蛋白的生成方法, 并以此作为演示的例证。

研究方案

1. 靶基因的定点诱变

注意: MDH 在pCDF-1向量中以CloDF13原点和20到 40³⁴的副本号表示在 T7 启动子下。

1. 介绍了琥珀色停止密码在该基因的位置140的引物 (向前底漆: GGTGTTTATGAC标记AACAAACTGTTCGGCG 和反向底漆: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), 按照指示的网站定向诱变试剂盒。
2. 放大含有野生型苹果脱水基因的模板质粒, 通过聚合酶链反应 (PCR) 反应, 插入停止密码子突变。在反应混合物中, 包括12.5 µL 的 2X DNA 聚合酶组合物, 1.25 µL 10 µM 前引物, 1.25 µL 10 µM 反转底漆, 1 µL 模板 DNA (20 ng/µL) (pCDF-1质粒含有野生型 MDH 的基因), 9 µL 无核酸水。
   1. 使用 PCR 反应参数如下: 三十年代初变性在98° c;25周期十年代在98° c, 三十年代在55° c 和 3 min 在72° c;最后的引伸在72° c 为 3 min。PCR 后, 将放大的材料直接添加到激酶-连接-DpnI 酶混合从试剂盒1小时的室温 circularization 和模板去除。
      注: 反应混合物含有1µL PCR 产物, 5 µL 2X 反应缓冲, 1 µL 10X 激酶连接 DpnI 酶混合, 3 µL 无核酸水。
3. 添加5µL 的反应混合物的管25µL 解冻合格的大肠杆菌DH5α细胞从试剂盒。小心地弹管混合, 并将混合物放在冰上30分钟. 热冲击混合物在42° c 为三十年代和地方在冰为另外的5分钟。
   1. 吸管600µL 室温超优化汤与物抑制 (SOC) 介质从试剂盒到混合物, 孵育在37° c 为60分钟与晃动在 250 rpm, 传播100µL 到性肉汤 (LB) 琼脂板与相应的抗生素, 在37° c 的夜间孵育, 以 250 rpm 摇动。
4. 选择4-6 个单一的殖民地到6毫升新鲜 LB 培养基与相应的抗生素, 并孵化在37° c 过夜与晃动 250 rpm。通过质粒纯化试剂盒从每一夜培养物中提取粒细胞, 按照制造商手册, 然后根据服务提供商的协议发送基因组进行 DNA 测序, 以确认停止密码子在正确位置的突变。
5. 通过混合1毫升过夜培养和300µL 100% 亚砜, 在-80 ° c 下将应变存储在正确的顺序上。

2. 乙酰蛋白的表达

1. 插入优化的 acetyllysyl-tRNA 合成酶³³的基因, 并优化 tRNA^{Pyl 32}到pTech质粒。将 tRNA 合成酶基因置于本构lpp启动子下。将 tRNA 基因置于本构普罗克启动子³⁴下。
   1. 将含有苹果酸脱氢酶的突变标记基因的表达载体³⁴和包含优化的 acetyllysine 合并系统的质粒, 转化为25µL 解冻的合格的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞热休克在42° c 为十年代和地方在冰为另外5分钟。
   2. 吸管600µL 室温 SOC 介质进入混合物, 孵育在37° c 为60分钟, 晃动在 275 rpm, 传播100µL 到一个板块与100µg/毫升链霉素和50µg/毫升氯霉素, 和孵化过夜在37° c 与晃动在 275 rpm。
2. 拿起一个单一的殖民地从板块, 并接种到15毫升新鲜 LB 培养基与100µg/毫升链霉素和50µg/毫升氯霉素在50毫升管夜间在37° c 与晃动的速度为 250 rpm。在1升烧瓶中用抗生素将15毫升过夜培养到300毫升新鲜 LB 培养基, 在37° c 下孵育, 在 250 rpm 时晃动。
3. 用清水溶解 acetyllysine, 使100毫米库存溶液, 贮存在4° c。添加5毫米 acetyllysine 和20毫米烟酰胺 (抑制剂乙酰) 的增长媒体时, 吸光度达到 0.5, 在 600 nm。
   1. 在37° c 下增加1小时的细胞, 摇动 250 rpm, 然后增加0.5 毫米 IPTG 蛋白表达, 并在25° c 的夜间生长细胞, 以 180 rpm 摇动。
      注意:表达条件可能需要对不同的蛋白质进行优化。
4. 收集细胞的离心在 3000 x g 在4° c 的15分钟, 丢弃上清液, 用磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 缓冲洗涤细胞小球 (10 毫米 Na₂HPO₄, 1.8 mm,₂PO₄, 137 毫米氯化钠, 2.7 mm 氯化钾)。收集洗涤的细胞在 1万 x g 在4° c 为5分钟, 放弃上清, 并且存放细胞小球在-80 ° c。

3. 乙酰蛋白的纯化

1. 解冻冰冻细胞在冰上的颗粒并重新悬挂15毫升的裂解缓冲液 (50 毫米三 (羟甲基) 氨基 (三) pH 7.8, 300 毫米氯化钠, 20 毫米咪唑, 20 毫米烟酰胺), 5 µL β-基和1µL Benzonase 核酸 (250 单位)。
2. 打破细胞由40赫超声在70% 功率输出与10周期的十年代短脉冲, 其次是三十年代的时间间隔, 冷却形成原油提取物。离心机粗提取物在 2万 x g 为25分钟在4° c。用0.45 µm 膜过滤器过滤上清液, 并将1毫升的镍三酸 (镍-NTA) 树脂平衡和20毫升的水和20毫升的裂解缓冲物载入一列。
   注意:如果超声不可用, 也可以用温和的洗涤剂打破细胞。
3. 用20毫升洗涤缓冲液 (50 mm ph 7.8, 300 毫米氯化钠, 50 毫米咪唑和20毫米烟酰胺) 冲洗柱, 然后洗与2毫升洗脱缓冲液 (50 毫米三 ph 7.8, 300 毫米氯化钠, 150 毫米咪唑, 和20毫米烟酰胺)。
4. 淡化的洗脱馏分与脱盐缓冲 (25 毫米三 pH 7.8 和10毫米氯化钠) 的 PD-10 柱, 按照制造商的手册。按照布拉德福德蛋白测定试剂的指示, 测定洗蛋白的浓度。盐水蛋白为进一步的实验做好了准备。
   注意:使50% 的甘油库存的蛋白质, 并保持在-80 ° c 存储。

4. 乙酰蛋白的生化特性

1. SDS-页和质谱分析。
   1. 变性蛋白质与十二烷基硫酸钠 (sds) 样品缓冲 (5 µL 蛋白质样品与2µL 4X sds 样品缓冲) 在2毫升管子在105° c 为 5 min, 离心混合物在 2000 x g 为十年代, 装载到4-20% 钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶 electrophoresis (SDS 页) 凝胶, 并运行在200伏30分钟。
   2. 用蒸馏水清洗凝胶, 轻轻摇动5分钟, 重复过程3次。将水丢弃, 用马斯亮的蓝色污渍将凝胶沾上1小时, 并轻轻摇动。用蒸馏水把凝胶弄脏, 轻轻摇动30分钟, 重复这个 de 污点3次。
   3. 削减 33 kDa 在马斯亮蓝染色的 SDS 页凝胶带, 并发送到质谱仪设施或公司, 以确认 acetyllysine 被纳入设计的立场。
      注: 质谱分析的协议在上一次实验之前³⁴。
2. 西部印迹
   1. 在步骤4.1 中使用相同的协议运行 SDS 页凝胶。在凝胶奔跑以后, 浸泡胶凝体与转移缓冲 (25 毫米三, 192 毫米甘氨酸, pH 8.3 和20% 甲醇) 为 15 min。
   2. 激活一个0.2 µm, 7 厘米 x 8.5 厘米的聚偏氟 (PVDF) 膜与甲醇为1分钟, 并在准备转移三明治前用转移缓冲液冲洗。
      注意:甲醇是危险的情况下, 皮肤接触, 眼睛接触, 摄入, 或吸入。严重过度暴露会导致死亡。
   3. 使从阴极到阳极 (海绵, 滤纸, SDS 页凝胶, PVDF 膜, 滤纸, 海绵) 的转移三明治。将栈放入转印罐中, 在350毫安的恒定电流下运行45分钟。
      注意:传输时间可能需要优化。
   4. 用25毫升三缓冲盐水冲洗 PVDF 膜, 0.1% 吐温 20 (TBST) (137 毫米氯化钠, 20 毫米三, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 缓冲液为5分钟, 轻柔摇动。在室温下, 用5% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 TBST 缓冲膜中阻挡1小时。
   5. 用 HRP 结合的 acetyllysine 抗体孵育膜, 最终浓度为1µg/毫升稀释, 在 TBST ° c 的情况下, 一夜之间用 5% BSA 进行温和摇动。
      注意:为了更快的结果, 这一步可以在室温下执行1小时。抗体的稀释可能需要优化。
   6. 用20毫升 TBST 缓冲液冲洗膜, 5 分钟, 轻轻摇动, 重复步骤4次。按照制造商的指示, 将化学发光基板应用到膜上。用电荷耦合器件 (CCD) 相机为基础的成像器捕捉信号。

结果

乙酰 MDH 蛋白的产量为每 1 l 培养15毫克, 而野生型 MDH 为31毫克, 每 1 l 培养。用 SDS-页分析纯化蛋白, 如图 1所示。使用野生类型的 MDH 作为正控制³⁴。从细胞中纯化的 acetyllysine (AcK) 合并系统和突变的mdh基因, 但在生长培养基中没有 AcK, 被用作阴性对照。用 acetyllysine 抗体检测纯化蛋白的赖氨酸乙酰化, 如图 2

讨论

非氨基酸 (ncAAs) 的基因合并是基于对一个被分配的密码子的镇压, 主要琥珀色的中止密码子 UAG^36,37,38,39, 由 ncAA 充电 tRNA包含相应的子。众所周知, UAG 密码子是公认的释放 factor-1 (RF1) 的细菌, 它也可以抑制附近同源转运从主机的标准氨基酸 (cAAs), 如赖氨酸和酪氨酸^40,

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking