大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

要約

遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。

要約

ポスト翻訳の修正蛋白質の特定の位置で発生するさまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たすに示されています。その中で、リバーシブルのリジンのアセチル化の一つです最も広く分散の生活のすべての領域でさらに多くの acetylome の質量分析を用いた研究が行われているが、これらの推定のアセチル化ターゲットの特性は制限されています。1 つの可能な理由はほとんどの古典的な生化学的アプローチによって目的の位置でアセチル化された純粋なタンパク質を生成する難しさ。この課題を克服するために遺伝コードの拡張手法が適用されて翻訳共役の設立を指示するペア組み換えピロリジル tRNA 合成酵素バリアント、およびMethanosarcinaceae種からの同種の tRNA を使用するには興味の蛋白質の特定のサイトで acetyllysine のヒストンのアセチル化の研究では、最初のアプリケーションの後、このアプローチは、様々 なタンパク質のアセチル化研究を促進しています。この作品では、ホストとしてモデル細菌エシェリヒア属大腸菌を用いた site-specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコルを示した。リンゴ酸脱水素酵素は、この作品での実証例として使用されました。

概要

タンパク質の翻訳後修飾 (Ptm)、翻訳プロセスの後、遺伝子を含むほぼすべての生物学的プロセスに重要な役割を果たすアミノ酸残基を官能基の共有結合の付加から発生します。転写、ストレス応答、細胞分化、代謝^1,2,3。までに、約 400 の特徴的な Ptm は識別された⁴をされています。ゲノム、プロテオームの複雑さとローカライズ、およびタンパク質の活性を調節する蛋白質、核酸、脂質、補因子⁵など他の分子との相互作用に影響を与えるタンパク質 Ptm によってかなりの程度まで増幅されています。

タンパク質アセチル化は最後の二十年^{6,7,8,9,10、11,12}Ptm 研究の最前線にされています。リジンのアセチル化最初発見されたヒストンで 50 年以上前¹³¹⁴,^,も精査されている、80 以上の転写因子、規制当局、および様々 なタンパク質^{15に存在する知られています。 16,17}。タンパク質アセチル化に関する研究だけでなく、その規制メカニズムのより深い理解を提供してくれました、またガイド数機能不全のアセチル化^18,19,によって引き起こされる病気のための治療^20,21,22,23. リジンのアセチル化は、真核生物でのみ発生が、最近の調査示したタンパク質アセチル化はまた細菌の生理学、走化性、耐酸性、活性化、安定化など重要な役割を果たしていると考えられていた病原性島と他の病原性関連蛋白質^{24,25,26,27,28,29}。

サイト指示された突然変異誘発にリジンのアセチル化の生化学的特徴を一般的に使用されるメソッドで使用します。グルタミンは、同様の大きさと極性のため acetyllysine の模倣として使用されます。それは生理学的な条件の下で、正の電荷を保持がアセチル化されることができないので、アルギニンがリジンのアセチル化非模倣として活用されています。ただし、両方の模倣は実際ジペプチドイソ スターではない、常に³⁰の期待どおりの結果を得られない。最も厳密なアプローチは、困難または不可能自然^7,11にリジンのアセチル化の低い化学量論のための最も古典的な方法である特定リジン残基のアセチル化均一蛋白質を生成することです。この挑戦は組み換えピロリジル tRNA 合成酵素を採用し遺伝コードの拡大戦略で解明されてしている tRNA を充電するMethanosarcinaceae種からバリアントと acetyllysine、^Pyl利用ホスト並進機械、UAG を抑制するため、mRNA のコドンを停止し、ターゲット蛋白質³¹の設計位置に acetyllysine の設立を指示します。最近、我々 はこのシステム改善の EF-Tu 結合 tRNA³²とアップグレードされた acetyllysyl tRNA 合成酵素³³を最適化してきました。さらに、リンゴ酸脱水素酵素³⁴とチロシル tRNA 合成酵素³⁵のアセチル化研究のこの強化された定款システムを適用しました。ここで、実証例として広く検討したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (MDH) を使用して、生化学的同定分子クローニングから純粋なアセチル化タンパク質を生成するためのプロトコルを示す.

プロトコル

1 ターゲット遺伝子のサイト指示された突然変異誘発

注: MDH は T7 プロモーター CloDF13起源とコピー数 20 に 40³⁴ pCDF 1ベクトルで表されます。

1. プライマーによって遺伝子の位置 140 黄色停止コドンを導入 (プライマーを転送: GGTGTTTATGACタグAACAAACTGTTCGGCG、逆プライマー: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC)、サイト指示された突然変異誘発キットの指示に従います。
2. 野生型リンゴ酸脱水酵素の遺伝子を含んでいるテンプレート プラスミドを増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 反応による停止コドンの変異を挿入します。反応混合物で 2 X DNA ポリメラーゼ酵素ミックス 12.5 μ、10 μ M 前方プライマー、10 μ M 逆プライマーの 1.25 μ、1 μ L テンプレート DNA の 1.25 μ L なども (20 ng/μ L) (pCDF 1プラスミドの野生型 MDH 遺伝子を含んでいる)、ヌクレアーゼ フリー水の 9 μ L。
   1. PCR 反応パラメーターを使用して、次のように: 30 98 ° C で変性の初期 s;10 の 25 サイクル 98 ° c、30 秒 55 の ° C および 72 ° C、3 分で s72 ° C、3 分で最後の拡張。PCR 後環状とテンプレートの除去の部屋の温度で 1 時間キットからキナーゼ リガーゼ DpnI 酵素ミックスに直接増幅された材料を追加します。
      注: 反応混合物には、1 μ L PCR、ヌクレアーゼ フリー水の 3 μ L、1 μ L の 10 X キナーゼ-リガーゼ-DpnI 酵素ミックス、5 μ L 反応バッファー X 2 の製品にはが含まれています。
3. 25 μ L のチューブに反作用の組合せの 5 μ L 解凍有能なエシェリヒア属大腸菌を追加キットから DH5α 細胞。慎重にミックスするチューブをフリックし、氷上で 30 分ヒート ショック 42 ° C、30 秒と場所追加 5 分間氷の上で混合物の混合物を配置します。
   1. 混合物に室温カタボライト抑制 (SOC) メディア キットからスーパー最適スープ 600 μ L をピペット, 250 rpm で振とうしながら 37 ° C, 60 分インキュベート, 対応する抗生物質ホストゲノム スープ (LB) 寒天プレート上に 100 μ L を広める、250 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートし、。
4. 対応する抗生物質を 6 mL の新鮮な LB メディアに 4-6 シングル コロニーをピックアップし、250 rpm で振とうしながら一晩を 37 ° C で孵化させなさい。製造元のマニュアル、後正しい位置で停止コドンの変異を確認するサービス プロバイダーのプロトコルによると DNA の塩基配列に送信プラスミド プラスミド精製キットで各一晩文化からプラスミドを抽出します。
5. 1 mL オーバー文化 300 μ L 100 %dmso を混合することによって-80 ° C で正しいシーケンスのひずみを格納します。

2. アセチル化タンパク質の発現

1. ³³最適化された acetyllysyl tRNA 合成酵素の遺伝子を挿入し、tRNA を最適化された^{Pyl 32} pTechプラスミドに。構成lppプロモーター tRNA 合成酵素遺伝子を配置します。構成proKプロモーター³⁴tRNA 遺伝子を配置します。
   1. 共同式ベクトル³⁴リンゴ酸脱水素酵素の変異タグを含む遺伝子を含むを変換し、による細胞解凍有能なエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) 25 μ L に最適化された acetyllysine 設立システムを有するプラスミド、10 s、およびさらに 5 分の氷の上の場所のための 42 ° C で熱ショック。
   2. 混合物に室温 SOC のメディアの 600 μ L をピペット、275 rpm で振とうしながら 37 ° C, 60 分インキュベート、100 μ g/mL ストレプトマイシンと 50 μ G/ml のクロラムフェニ コール、プレート上に 100 μ L を広める、275 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートします。
2. 板から単一コロニーをピックアップし、100 μ g/mL ストレプトマイシンと回転数が 250 rpm で振とうしながら一晩 37 ° C で 50 mL のチューブで 50 μ g/mL クロラムフェニ コール 15 ミリリットル新鮮な LB 媒体に接種します。15 mL 一晩かけて培養を 1 L フラスコで抗生物質で 300 mL の新鮮な LB メディアに転送し、250 rpm で振とうしながら, 37 ° C で。
3. 原液の 100 mM 4 ° C で保存をするために水の acetyllysine を溶解します。吸光度 600 0.5 に達すると成長媒体に 5 mM acetyllysine と 20 mM ニコチンアミド (脱アセチル化酵素の阻害剤) を追加 nm。
   1. 250 rpm で揺れ、37 ° C でさらに 1 時間のための細胞を成長し、蛋白質の表現のための 0.5 mM IPTG を追加 180 rpm で振とうしながら一晩中、25 ° C で細胞を成長します。
      注:式の条件は異なった蛋白質のための最適化を必要があります。
4. 4 ° C 15 分で 3,000 × g で遠心分離によって細胞を収集、上澄みを廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファー (10 mM ナ₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM の NaCl、KCl 2.7 mM) 細胞ペレットを洗浄します。10,000 x g で 5 分の 4 ° C で洗浄の細胞を収集、上澄みを廃棄し、細胞ペレット-80 ° C で保存

3. アセチル化タンパク質の精製

1. 氷の上の凍結細胞ペレットを解凍し、再 15 mL の換散バッファー (50 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) pH 7.8, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) を持つ β-メルカプトエタノール、1 μ Benzonase ヌクレアーゼ (250 単位) の 5 μ L を中断します。
2. 30 の間隔で続いて 10 の s 短いバーストの 10 サイクル 70% 出力で 40 kHz 超音波処理によって細胞を壊す形粗抽出物を冷却するための s。4 ° C で 25 分 20,000 × g で遠心分離機原油を抽出します。0.45 μ m メンブレン フィルターで上清をフィルターし、ニッケル ニトリロ三酸 (Ni NTA) 樹脂 20 mL の水と 20 mL の溶解バッファーで平衡の 1 mL を含む列に読み込みます。
   注:超音波が利用できない場合、穏やかな洗剤によって細胞を壊さもでした。
3. 20 mL の洗浄バッファー (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM の NaCl、50 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) の列を洗浄し、2 ml の溶出バッファー (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM の NaCl、150 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) の溶出します。
4. PD 10 列、次の製造元のマニュアルでバッファー (25 mM Tris pH 7.8 と 10 mM NaCl) を脱塩溶出画分塩分を除きます。ブラッドフォード蛋白質の試金の試薬の命令に従うことによって溶離されたタンパク質の濃度を測定します。脱塩のタンパク質はさらに実験の準備ができて。
   注:蛋白質の 50% グリセロール ストックを行いストレージ-80 ° C で維持します。

4. アセチル化タンパクの生化学

1. SDS ページ/質量分析法による分析。
   1. 5 分の 105 ° C で 2 mL チューブにナトリウムの dodecyl 硫酸塩 (SDS) サンプル バッファー (5 μ L タンパク質サンプル 2 μ L 4 X SDS サンプルバッファーで) が付いている蛋白質を変性、10 2000 x g で混合物を遠心分離機 s、4-20% ナトリウム dodecyl 硫酸塩電気泳動法 electroph の負荷oresis (SDS-PAGE) ゲルし 30 分間 200 V で実行します。
   2. 蒸留水でゲルを洗浄し、5 分、3 回繰り返すため軽く振る。水を捨て、Coomassie 青い汚れ穏やかな揺れで 1 時間でゲルを染色します。解除蒸留水でゲルを染色、振盪 30 分し、これは重複染色 3 回繰り返します。
   3. Coomassie 青いステンド SDS-PAGE ゲル 33 kDa のバンドをカットし、それを質量分析施設や企業、acetyllysine が設計された位置に組み込まれたことを確認するに送信します。
      注: 質量分析のプロトコルは続いて前実験³⁴です。
2. 西部にしみが付くこと
   1. SDS ページのゲルを実行手順 4.1 で同じプロトコルを使用します。ゲルを実行後、15 分の転送バッファー (25 mM トリス、192 mM グリシン、pH 8.3、20% メタノール) とゲルを浸します。
   2. 0.2 μ m は、1 分のメタノール 7 × 8.5 cm ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜をアクティブにし、転送バッファー転送サンドイッチを準備する前にすすぎ。
      注:メタノールは、皮膚への接触、眼との接触、摂取、または吸入した場合有害。深刻な露出過度は、死に至ることができます。
   3. (スポンジ、フィルター ペーパー、SDS-PAGE ゲル、PVDF 膜、フィルター ペーパー、スポンジ) 陽極に陰極から転送サンドイッチを作る。350 の定電流で実行転送タンクのスタックを入れて 45 分 mA。
      注:転送時間は、最適化を必要があります。
   4. 25 mL 含有トリス緩衝生理食塩水、0.1% と PVDF 膜を洗浄するトゥイーン 20 (TBST) (137 mM NaCl、20 mM トリス、0.1 のトゥイーン 20%, pH 7.6) 穏やかな揺れと 5 分のためのバッファー。室温で 1 時間 TBST バッファーで 5% ウシ血清アルブミン (BSA) で膜をブロックします。
   5. 最終濃度 1 μ G/ml の穏やかな揺れで一晩 4 ° c と 5% BSA TBST 希釈の HRP 共役 acetyllysine 抗体を用いた膜を孵化させなさい。
      注:高速な結果を得るには、1 時間室温でこの手順を実行することができます。抗体の希釈には、最適化を必要があります。
   6. 手順を 4 回繰り返して、穏やかな揺れで 5 分 20 mL TBST バッファーを持つ膜を洗浄します。製造元の指示に従い、化学発光基質を膜に適用します。電荷結合素子 (CCD) カメラ ベースのイメージャで信号をキャプチャします。

結果

アセチル化 MDH タンパク質の収量野生型 MDH のあった 1 L 文化あたり 31 mg 1 L 文化あたり 15 mg であった。図 1に示すように、浄化された蛋白質は SDS のページによって分析されました。野生型 MDH は³⁴の肯定的な制御として使用されました。成長媒体の細胞の acetyllysine (AcK) 設立システムと変異mdh遺伝子から、AcK を返さずを?...

ディスカッション

NcAA 充電 tRNA によって割り当てられたコドン、ほとんど黄色停止コドン UAG^36,37,38,39, の抑制をに基づいて遺伝的非カノニカル アミノ酸 (ncAAs) 定款対応するアンチコドンを含みます。UAG コドンはリリース要因-1 (RF1) 細菌の認識として知られている、それも抑制できる標準的なアミノ酸 (cAAs) によっ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking