פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Summary

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

Abstract

Post-translational שינויים שמתרחשים עמדות מסוימות של חלבונים הוכחו תפקיד חשוב במגוון רחב של תהליכים תאיים. ביניהם, ליזין הפיך acetylation הוא אחד הנפוצים ביותר מבוזר בכל התחומים של החיים. למרות acetylome מסה ספקטרומטר המבוסס על מחקרים רבים שנעשו, נוספות אפיון של מטרות אלה בשם acetylation הוגבלה. סיבה אפשרית אחת היא כי קשה לייצר חלבונים acetylated גרידא-עמדות הרצוי על-ידי רוב הגישות הביוכימי קלאסי. כדי להתגבר על האתגר הזה, הטכניקה הרחבת הקוד הגנטי הוחל להשתמש הזוג של variant המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA, שלה tRNA cognate ממינים Methanosarcinaceae , לכוון שיתוף cotranslational של acetyllysine באתר ספציפי בהחלבון של עניין. לאחר היישום הראשון במחקר של acetylation היסטון, גישה זו הנחתה את acetylation מחקרים על מגוון רחב של חלבונים. בעבודה זאת, הפגנו פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים site-specifically acetylated באמצעות החיידק דגם Escherichia coli כמארח. בנויים דהידרוגנאז שימש דוגמה הפגנה בעבודה זו.

Introduction

שינויים post-translational (PTMs) של חלבונים להתרחש לאחר תהליך התרגום, נובעים קוולנטיות תוספת של קבוצות פונקציונליות כדי שאריות חומצה אמינית, משחק תפקידים חשובים כמעט כל התהליכים הביולוגיים, כולל גנים תמלול תגובת המתח, התמיינות, חילוף החומרים^1,2,3. נכון להיום, כ 400 ייחודי PTMs היה מזוהה⁴. הפרטים. של הגנום, את פרוטאום מוגבר במידה רבה על ידי חלבון PTMs, כפי שהם לווסת את פעילות החלבון ולוקליזציה, משפיע על האינטראקציה עם מולקולות אחרות כגון חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, cofactors⁵.

חלבון acetylation כבר בחוד החנית של מחקרים PTMs האחרון שני עשורים^{6,7,8,9,10,11,12}. ליזין acetylation התגלה לראשונה בשינויים היסטוניים לפני יותר מ 50 שנה^13,14, בחן היטב, וידוע להתקיים יותר מ-80 גורמי שעתוק regulators, חלבונים שונים^{15, 16,17}. מחקרים על חלבון acetylation יש לא רק סיפק לנו הבנה עמוקה יותר של מנגנוני רגולציה שלה, אלא מונחה גם טיפולים עבור מספר מחלות שנגרמות על ידי לקוי acetylation^{18,19, 20 , 21 , 22 , 23}. האמינו ליזין acetylation מסרטים פרוקריוטים, אך מחקרים שנעשו לאחרונה הראו acetylation חלבון זה גם ממלא את תפקידי המפתח בפיזיולוגיה חיידקיים, כולל כימוטקסיס, התנגדות חומצה, הפעלה של ייצוב פתוגניות ואיי התקפה אלימה אחרים הקשורים חלבונים^{24,25,26,27,28,29}.

שיטה נפוץ לאפיין מבחינה ביוכימית ליזין acetylation משתמש מוטגנזה. גלוטמין משמש חיקוי של acetyllysine בשל גודל דומה קוטביות. ארגינין הוא מנוצל כמו חיקוי ליזין שאינם acetylated, מאז זה משמר את מטען חיובי בתנאים פיזיולוגיים אבל לא יכול להיות acetylated. עם זאת, שניהם מחקה אינם isosteres האמיתי, לא תמיד יניבו את התוצאות הצפויות³⁰. הגישה קפדני ביותר היא לייצר חלבונים homogeneously acetylated-שאריות ליזין ספציפי, וזה קשה או בלתי אפשרי עבור שיטות הכי קלאסי בשל סטויכיומטריה נמוכה של ליזין acetylation הטבע^7,11. האתגר הזה יש כבר נפתר על ידי האסטרטגיה הרחבת הקוד הגנטי, אשר מעסיקה של המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA variant ממינים Methanosarcinaceae לחייב tRNA^Pyl עם acetyllysine, מנצל את המארח מכונות translational לדכא את UAG קודון סיום ב- mRNA, ומביאה שילוב של acetyllysine במצב מעוצב של חלבון המטרה³¹. לאחרונה, אנו יש אופטימיזציה מערכת זו של tRNA EF-Tu-איגוד משופרת³² , של acetyllysyl משודרג-סינתזת המעביר³³. יתר על כן, אנו החלת מערכת זו התאגדות משופרת במחקרים acetylation של בנויים דהידרוגנאז³⁴ / tyrosyl-סינתזת המעביר³⁵. במסמך זה, נדגים את הפרוטוקול ליצירת חלבונים acetylated גרידא של שיבוט מולקולרי כדי זיהוי הביוכימי באמצעות בנויים דהידרוגנאז (MDH), אשר אנו חקרו בהרחבה כדוגמה כינוי רמז.

Protocol

1. מוטגנזה של הגן היעד

הערה: MDH מבוטא תחת T7 יזם ב וקטור pCDF-1 עם המקור CloDF13 ומספר עותק של 20-40³⁴.

1. להציג את אמבר stop codon במיקום 140 בגן מאת תחל (קדימה פריימר: GGTGTTTATGACתגAACAAACTGTTCGGCG הפוכה פריימר: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), בעקבות ההוראה של ערכת מוטגנזה.
2. להגביר את פלסמיד תבנית המכילה את הגן של dehydratase פראי-סוג בנויים והוסף את המוטציה stop codon מאת התגובה פולימראז תגובת שרשרת (PCR). בתערובת התגובה, כוללים µL 12.5 של 2 X DNA פולימראז אנזים מיקס, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר לפנים, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, µL 1 של תבנית ה-DNA (20 ng/µL) (המכילים את הגן של פראי-סוג MDH פלסמידpCDF-1 ), ו- µL 9 של נוקלאז ללא מים.
   1. השתמש בפרמטרים התגובה PCR כדלקמן: Îàé דנטורציה ב 98 ° C ל 30 s; 25 מחזורי 10 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C ו- 3 דקות ב-72 מעלות; הרחבה הסופי ב-72 מעלות למשך 3 דקות. לאחר PCR, הוסף את החומר מוגבר ישירות לתערובת אנזימים קינאז-ליגאז-DpnI הערכה לשעה בטמפרטורת החדר במשך circularization והסרת תבנית.
      הערה: תערובת התגובה מכילה 1 µL של PCR המוצר, 5 µL 2 X תגובת מאגר, µL 1 של 10 מיקס אנזים X קינאז-ליגאז-DpnI 3 µL של נוקלאז ללא מים.
3. להוסיף 5 µL של המיקס התגובה על הצינור של 25 µL הקרת המוסמכת e. coli DH5α תאים הערכה. בזהירות קפיצי צינור כדי לערבב, מניחים את התערובת על קרח דק 30 הלם חום התערובת ב 42 ° C s 30, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
   1. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר מרק סופר אופטימלית עם Catabolite מדיה הדיכוי (SOC) הערכה לתוך התערובת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-250 סל"ד, להפיץ µL 100 על צלחת אגר lysogeny מרק (ליברות) עם האנטיביוטיקה המתאימה , דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
4. לבחור 4-6 מושבות יחיד לתוך המדיה LB טרי 6 מ עם האנטיביוטיקה המתאימה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ברעידות-250 סל"ד. לחלץ פלסמידים מתרבות כל לילה על-ידי ערכת טיהור פלסמיד, בעקבות המדריך של היצרן ולאחר מכן שלח פלסמידים עבור רצפי DNA לפי הפרוטוקול של ספק השירות כדי לאשר את המוטציה stop codon על העמדות הנכונות.
5. לאחסן את המתח עם הרצף הנכון ב-80 מעלות צלזיוס על ידי ערבוב µL 300-100% דימתיל סולפוקסיד ותרבות לילה 1 מ"ל.

2. הביטוי של החלבון Acetylated

1. הוסף את הגנים של acetyllysyl אופטימיזציה-סינתזת המעביר³³ וממוטב tRNA^{Pyl 32} לתוך פלסמיד pTech . למקם את הגן המעביר tRNA תחת האמרגן מכוננת ל"י/נ . למקם את הגן tRNA תחת יזם קונסטיטוטיביות proK ³⁴.
   1. שיתוף להפוך את וקטור ביטוי³⁴ המכיל גן המכיל תגית מוטציה בנויים דהידרוגנאז, ו פלסמיד מחסה מערכת ההתאגדות acetyllysine ממוטבת, לתוך 25 µL המוסמכת המופשרים e. coli BL21(DE3) תאים על-ידי הלם החום 42 ° C s 10, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
   2. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר SOC מדיה לתוך התערובת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-סל ד 275, להפיץ µL 100 לצלחת עם סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL כלורמפניקול, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-275 סל ד.
2. לאסוף את מושבה בודדת מהצלחת, לחסן לתוך המדיה LB טריים 15 מ"ל עם 100 סטרפטומיצין µg/mL ו µg 50/mL כלורמפניקול 50 מ ל צינור לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות במהירות של 250 סל"ד. העברת התרבות לילה 15 מ"ל למדיה LB טריים 300 מ עם אנטיביוטיקה בבקבוקון 1 ליטר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
3. להמיס acetyllysine עם מים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ, לאחסן ב 4 º C. להוסיף acetyllysine 5 מ מ, 20 מ מ nicotinamide (מעכב של deacetylases) למדיה צמיחה ספיגת מגיע ל 0.5 על 600 ננומטר.
   1. לגדל תאים עבור h 1 נוספים 37 ° C, רועדת-250 סל"ד, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ מ IPTG ביטוי חלבון, ולגדול תאים 25 ° c בן לילה, ברעידות-180 סל ד.
      הערה: התנאים ביטוי ייתכן שיהיה עליך אופטימיזציה עבור חלבונים שונים.
4. איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב x 3000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף תא כדורי עם פוספט באגירה מלוחים (PBS) המאגר (10 מ מ נה₂HPO₄, מ מ 1.8 ח'₂PO₄, מ מ 137 NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי). איסוף תאים שטף ב g 10,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ואחסן תא כדורי ב- 80 ° c

3. טיהור של החלבון Acetylated

1. להפשיר את כדורי תא קפוא בקרח, וכן להשעות מחדש עם 15 מ"ל של מאגר פירוק (50 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 20 מ מ, 20 מ מ nicotinamide), 5 µL של β-mercaptoethanol, µL 1 Benzonase נוקלאז (250 יחידות).
2. לשבור את התאים על ידי sonication 40 kHz-70% כוח פלט עם 10 מחזורים של 10 צרורות קצרים s, ואחריו במרווחים של 30 s לקירור כדי לחלץ גולמי טופס. צנטריפוגה גולמי לחלץ ב g x 20,000 עבור 25 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע במסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר, לטעון לתוך עמודה המכילה 1 מ"ל של ניקל-nitrilotriacetic חומצה (Ni-נ) שרף equilibrated עם 20 מ של מים ו- 20 מ של פירוק מאגר.
   הערה: גם יכול להיות שבור תאים על ידי דטרגנטים קלים, אם sonication אינה זמינה.
3. לשטוף את העמודה עם 20 מ של מאגר לשטוף (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 50 מ מ, 20 מ מ nicotinamide) ולאחר מכן elute עם 2 מ"ל • תנאי מאגר (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 150 מ מ, 20 מ מ nicotinamide).
4. Desalt השבר • תנאי עם desalting מאגר (25 מ מ טריס pH 7.8 ו-10 מ"מ NaCl) לפי העמודה PD-10, בעקבות המדריך של היצרן. מודדים את ריכוז החלבון eluted על-ידי ביצוע ההוראה מהתרכובת assay חלבון ברדפורד. החלבון desalted מוכן לניסויים נוספים.
   הערה: להפוך את 50% מניות גליצרול של החלבון, ולשמור ב-80 מעלות לאחסון.

4. איפיון ביוכימי של החלבון Acetylated

1. ניתוחים ספקטרומטר מרחביות-דף והמסה.
   1. Denature חלבונים עם נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) דוגמת המאגר (5 µL חלבון דוגמה עם 2 µL 4 X מרחביות דוגמת המאגר) צינור 2 מ"ל ב 105 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, centrifuge את התערובת ב 2000 g x 10 s, עומס על גבי 4-20% נתרן dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל electroph ג'ל oresis (מרחביות-עמוד), ריצה ב- 200 וולט למשך 30 דקות.
   2. לשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים ומנערים בעדינות במשך 5 דקות, חזרה על התהליך 3 פעמים. למחוק את המים, מכתים את הג'ל עם כתם כחול Coomassie עבור h 1 ברעידות עדין. מבטל את מכתים את הג'ל עם מים מזוקקים, ללחוץ בעדינות במשך 30 דקות, ואני חוזר זה מבטל את כתם 3 פעמים.
   3. חותכים את הלהקה kDa 33 על Coomassie blue מוכתמת הג'ל מרחביות-דף, ולשלוח אותו ספקטרומטר מסה מתקנים או חברות כדי לאשר ש-acetyllysine סופחה במיקום מעוצב.
      הערה: הפרוטוקול של ספקטרומטר מסה ניתוח בעקבות הניסוי הקודם³⁴.
2. סופג המערבי
   1. הפעל את הג'ל מרחביות-דף עם הפרוטוקול באותו שלב 4.1. לאחר הג'ל לרוץ, משרים את הג'ל עם מאגר העברה (25 מ מ טריס, מ מ 192 גליצין, pH 8.3 ו 20% מתנול) למשך 15 דקות.
   2. הפעלה של 0.2 µm, 7 ס"מ 8.5 ס"מ polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור 1 דקות, ולשטוף עם מאגר העברה לפני הכנת הכריך העברה.
      הערה: מתנול הוא מסוכן במקרה של מגע עם העור, קשר עין, בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.
   3. להפוך את הכריך העברה מקטודה כדי אנודת (ספוג נייר סינון, עמודים מרחביות ג'ל, PVDF ממברנה, נייר סינון, ספוג). להכניס את המחסנית למיכל העברה, להפעיל זרם קבוע של 350 mA למשך 45 דקות.
      הערה: זמן ההעברה עשוי להזדקק אופטימיזציה.
   4. לשטוף את הקרום PVDF עם 25 מ ל באגירה טריס מלוחים, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 מ מ NaCl, 20 מ מ. טריס, 0.1% Tween-20, pH 7.6) המאגר עבור חמש דקות עם טלטול עדין. לחסום את הקרום עם 5% שור אלבומין (BSA) במאגר TBST לשעה בטמפרטורת החדר.
   5. דגירה הקרום עם נוגדנים acetyllysine מצומדת HRP עם ריכוז סופי של 1 µg/mL מדולל עם 5% BSA ב- TBST ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין.
      הערה: לקבלת תוצאות מהר יותר, שלב זה יכול להתבצע בטמפרטורת החדר מאובטח. הדילול של נוגדן עשוי להזדקק אופטימיזציה.
   6. לשטוף את הקרום עם 20 מ ל מאגר TBST עבור חמש דקות עם טלטולים עדינים, חוזרים על השלב 4 פעמים. להחיל את המצע chemiluminescence על הקרום לפי הוראות היצרן. ללכוד את האות עם imager המצלמה מבוסס תשלום מצמידים מכשיר (CCD).

תוצאות

התשואה של חלבון MDH acetylated היה 15 מ ג לכל תרבות 1 ליטר, בזמן זה של פראי-סוג MDH היה 31 מ ג 1 ליטר תרבות. חלבונים מטוהרים נותחו על ידי עמודים מרחביות, כפי שמוצג באיור1. MDH פראי-סוג שימש בקרה חיובית³⁴. חלבון מטוהרים מתאי מסתירים את המערכת ההתאגדות acetyllysine (AcK) ...

Discussion

שילוב גנטי של חומצות אמינו noncanonical (ncAAs) המבוסס על דיכוי codon שהוקצו, בעיקר אמבר stop codon UAG^36,37,38,39, על ידי סינתזת טעון-ncAA המכילה את anticodon המתאים. כידוע, codon UAG מזוהה על-ידי שחרור הפקטור-1 (RF1) של חיידקים, זה ניתן גם לדכא מאת ליד tRNAs cogn...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking