JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر الارتخاء الكروماتين أن تشارك في الإمكانات الإنمائية بلاستوميريس. ومع ذلك، لم يتضح ما إذا كان الارتخاء الكروماتين يمكن استخدامها كمؤشر موثوق لإمكانات النمو للأجنة. هنا، قد وصف نظام تجريبي التي يمكن أن تتطور الكروماتين zygotes تقييم الارتخاء لفترة كاملة.

Abstract

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي. مؤخرا، ثبت أن تشارك في إمكانيات التمايز الخلوي للخلايا الجذعية الجنينية pluripotent الكروماتين الارتخاء أو الانفتاح. وذكر سابقا أن مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، ميناء zygotes بنية الكروماتين خففت جداً، مما يوحي بارتباطها بما توتيبوتينسي. ومع ذلك، حتى الآن، قد لم تعالج عما إذا كان هذا الهيكل الكروماتين الغاية خففت/فتح مهم لإمكانات النمو الجنينية. في هذه الدراسة، ولدراسة هذه الفرضية، وضع نظام تجريبي في زيجوتيس التي التي تم تحليلها بواسطة الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة يمكن أن تتطور إلى المدة دون أي أضرار كبيرة. الأهم من ذلك، يحتاج هذا النظام التجريبي فقط سخان الترمس-لوحة بالإضافة إلى المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن الانتعاش الأسفار بعد تبييض الصورة تحليل التحليل (فراب) يمكن استخدامها للتحقيق في ما إذا كانت الأحداث الجزيئية في الكروماتين زيجوتيك هامان للتنمية الكاملة ومدتها.

Introduction

بعد الإخصاب، هو تغيير بنية الكروماتين بشكل حيوي، وهيكل الكروماتين زيجوتيك ثم أنشئت في نهاية المطاف1،2. خلال هذه الفترة، والأب برونوكلي، يتم تغيير البروتين الكروماتين المهيمنة من البروتامين إلى هيستون. الكروماتين الناتجة من مختلف للغاية من الحيوانات المنوية وبويضات الإناث في عدة نقاط (مثلاً، التكوين البديل هستون، هستون تعديل). وهكذا، يعتقد الكروماتين زيجوتيك شكلت مهمة للتنمية الجنينية اللاحقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من الجهود المبذولة للكشف عن تفاصيل هيكل الكروماتين زيجوتيك على مدى فترات طويلة، أساليب لتقييم نوعية زيجوتيس أو للتنبؤ بتنميتها الأجل الكامل في مرحلة واحدة-خلية عن طريق تحليل بنيتها الكروماتين لم تكن المنشأة.

في الدراسة السابقة، فهو اكتشف أن zygotes هيكل الكروماتين خففت الغاية3. في الوقت الراهن، يعتقد أن يكون عاملاً هاما في التمايز الخلوي المحتملة في الخلايا الجذعية الجنينية (ES)4الارتخاء الكروماتين أو الانفتاح. دإط الخلايا لا يحمل التجانس في الطبيعة، ولكن بدلاً من ذلك غير المتجانسة؛ في مستعمرات الخلايا دإط، اكتساب بعض عابر إمكانية تفريق أعلى يماثل blastomeres المرحلة اثنين خلايا الأجنة. خلال هذه المرحلة الانتقالية إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة، خلايا الكروماتين الارتخاء في وفاق التغييرات إلى ما قابل للمقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة5. وهكذا، يبدو الارتخاء الكروماتين لتكون هامة لإمكانيات التمايز الخلوي وأنه من الممكن أن فتح الكروماتين على نطاق واسع في زيجوتيس مفيد لتقييم الإمكانات الإنمائية زيجوتيك.

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي حيث يسمح هذا الأسلوب لذلك من تنمية وتطوير كامل المدة حتى6. وقد استخدمت تحليل فراب كأحد أساليب التصوير الحي، دراسة الارتخاء الكروماتين في الأجنة preimplantation وداط الخلايا3،،من45. إذا كان يمكن تحليل الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون أثر ضار على التنمية الكاملة ومدتها بتحليل فراب، قد يكون أداة قيمة لتقييم نوعية الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية. ومع ذلك، قد لا درست آثار على التنمية على المدى الكامل بهذا الأسلوب التجريبي. مؤخرا، تم تطوير نظام تجريبي لاستخدام فراب لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك. لأن هذا نظام جديد لمراقبة زيجوتيس، وقد وصفته فراب زيجوتيك (زفراب). زفراب لم تؤثر على التنمية على المدى الكامل خطيرة، وقد ذكرت في مكان آخر7. ويرد في هذا التقرير، البروتوكول هذا الأسلوب التجريبي.

Protocol

وأجرى هذه الدراسة يتفق بشكل صارم مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجامعة ياماناشي. البروتوكول أقرته لجنة "أخلاقيات التجارب الحيوانية" من جامعة ياماناشي (تصريح رقم: A24-50). وأجريت جميع العمليات الجراحية تحت التخدير تريبروموثانول، وقد بذلت جميع الجهود للتقليل من المعاناة. وترد لمحة توضيحية للإجراءات والجدول الزمني في الشكل 1 و الجدول 1، على التوالي.

1-إعداد الجيش الملكي النيبالي رسول (النسخفي المختبر مرناً H2B اجفب)

  1. لينيريزي 5 ميكروغرام من قالب الحمض النووي توبو-اجفب-H2B3،7 مع 30 يو لا أنا في 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. جمع 1.5 ميليلتر من هضم الحمض النووي لتأكيد ما إذا كانت تعي تماما بالتفريد.
    1. تطبيق ميليلتر 1.5 و 3-5 ميليلتر من الحمض النووي عسر الهضم مع تحميل صبغ للبئر من 2% [اغروس] هلام، على التوالي، ورهنا بالتفريد.
      ملاحظة: إذا استوعبت تماما، هو لاحظ عصابة واحدة (ما يقارب 5 كيلو بايت). عسر الهضم الحمض النووي كعنصر تحكم الذي يظهر في موضع آخر.
  3. إضافة ميليلتر 151.5 ddH2س و 200 ميليلتر الكحول الفينول/كلوروفورم/إيسواميل (25:24:1) لتبقى هضم الحمض النووي.
    1. مزيج من قوة بدوامة.
    2. الطرد المركزي في الحد الأقصى للسرعة لمدة 15 دقيقة.
  4. استعادة المادة طافية، ثم قم بإضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم.
    1. مزيج من قوة بدوامة.
    2. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
  5. استعادة المادة طافية، ثم قم بإضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم م 3 و 1.5 ميليلتر من اثاتشينماتي.
    1. مزيج من قوة بدوامة.
    2. إضافة ميليلتر 550 من الإيثانول 100% وثم تخلط بقوة بدوامة.
    3. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
    4. تجاهل المادة طافية ويغسل بيليه مع الإيثانول 70%.
    5. جاف بيليه بالتبخر لمدة 5-10 دقائق.
  6. يحل الحمض النووي بلازميد سرع في 8 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي.
  7. تقييم تركيز بلازميد (تركيز المتوقعة عن 300-500 نانوغرام/ميليلتر) مع نانودروب باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  8. إجراء النسخ في المختبر مرناً ترميز H2B اجفب مع 1 ميكروغرام لتنقية الحمض النووي كقالب في 20 ميليلتر من حجم رد الفعل الكلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    1. بعد النسخ في المختبر ، إضافة 36 ميكروليتر من الماء ثم استرداد 1.5 ميليلتر من 56 ميليلتر من تجميعي مرناً لتحليل بالتفريد (دون بولي A).
  9. أداء بولي بتراجع للمركب مرناً في حجم رد فعل 100 ميليلتر باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  10. إضافة 60 ميليلتر من كلوريد الليثيوم هطول الأمطار الحل إلى بولي مرناً الذيل من H2B اجفب وثم تخلط بقوة.
    1. باردة عند-30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
    3. تجاهل المادة طافية ويغسل بيليه مع الإيثانول 70%.
    4. جاف بيليه بالتبخر لمدة 5-10 دقائق.
  11. حل بيليه مع 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس بتدفئة في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  12. تقييم تركيز مرناً سرع مع نانودروب. تضعف إلى 500 نانوغرام/ميليلتر مع المياه خالية من نوكلاس ومخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  13. تأكيد المفضل مرناً الإنتاج؛ الموضوع 1 ميليلتر من مرناً مع/بدون (حصلت 1.8.1 والخطوات 1.12، على التوالي) بولي ذيل مختلطة مع 1.5 ميليلتر من 0.1 مغ/مل اثيديوم بروميد و 3 ميليلتر من صبغة تحميل عينة للتحليل الكهربي. وكان حجم التطبيقية 5.5 ميليلتر.
    ملاحظة: إذا تراجع أ بولي كان ناجحاً، الفرقة تحول مرناً دون بولي تراجع بالمقارنة مع ينبغي التقيد (الشكل 2A).

2-إعداد الفئران الذكور استؤصل الاسهر لديهم

  1. وزن الفئران الذكور الممثل المدني الدولي في 8-12 شهرا باستخدام مقياس وزن.
  2. إينترابيريتونيلي حقن الفئران الذكور مع 0.7-0.9 مل تريبروموثانول 1.2% التخدير.
    ملاحظة: كمية التخدير يعتمد على حجم الماوس. على سبيل المثال، يتم حقن ماوس وزنها 40 ز مع 0.8 مل تخدير تريبروموثانول.
  3. ويت بيري مع الإيثانول 70%.
  4. جعل صغيرة قطع (3-5 مم) على بري ثم قم بإجراء شق في الجدار العضلات مع مساعدة المقص.
    ملاحظة: المقص والملقط يجب تنظيف مع الإيثانول 70% قبل البدء الجراحة.
  5. قبضة وسادة الدهون مع الملقط واسحبه برفق. ثم، تظهر الخصية والاسهر.
    ملاحظة: الاسهر أنبوب على شكل U ومع الأوعية الدموية حمراء.
  6. التعادل قبالة الاسهر عند نقطتين بخيوط الجراحة وبعد ذلك قطع الجزء الأوسط بين نقاط ربط.
  7. ادفع برفق مرة أخرى لوحة الدهون والخصية إلى بري.
    1. كرر العملية مع الخصية المتبقية.
  8. خياطة الجدار العضلات مع غرز اثنين مع خياطة العمليات الجراحية.

3-التلقيح الاصطناعي

  1. حقن 8-10-الأسبوع القديمة B6D2F1 الإناث الفئران (BDF1) إينترابيريتونيلي مع 7.5 وحدة دولية تروج المشيمة الخيلي (eCG) وتروج المشيمية البشرية (hCG) عند الفاصل الزمني ح 46-50.
  2. إعداد قطرات من 300 ميليلتر البشرية البوقي السوائل (HTF)8 وسائط تأهيلية والتلقيح يوم 1 قبل التلقيح الاصطناعي في صحن 30 ملم وتغطي هذه القطرات مع الزيوت المعدنية على مقاعد البدلاء المختبر وثم بريينكوباتي في حاضنة بين عشية وضحاها.
  3. التضحية نضجت الفئران الذكور الممثل المدني الدولي بخلع عنق الرحم. تشريح البربخ كودا بإبرة 27-ز وجمع المني. الثقافة منهم تأهيلية في 300 ميليلتر HTF وسائل الإعلام ح 1-2 في 38 درجة مئوية.
  4. ح 16 بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن، التضحية الفئران الإناث سوبر أوفولاتيد بخلع عنق الرحم. نقل ampulla قناة في الزيوت المعدنية بجوار HTF وسائل الإعلام وثم استخلاص الخلايا الركام وبويضات معقدة من هذا أمبالا قناة بإبرة 30-ز في المتوسط HTF التلقيح بريينكوباتيد.
    ملاحظة: لا تظهر بعض الفئران الإناث غالباً الإباضة رغم العلاج سوبر الإباضة. أمبالا قناة الموسع علامة على الإباضة.
  5. بعد تأهيلية، نقل 2-3 ميليلتر من المني كاباسيتاتيد في وسائل الإعلام HTF التلقيح التي جمعت بويضات أوفولاتيد.
  6. جمع zygotes المخصبة ح 1 بعد التلقيح، وتعاملهم مع البروتين السكري المثبط في 100 ميكروغرام/مل لمدة 10 دقيقة في كزب9 وسائط الإعلام.
    ملاحظة: ح 1 بعد التلقيح، عندما يتم إجراء التلقيح بشكل صحيح، هي ملاحظة zygotes المخصبة مع الجسم القطبي 2nd . إذا تم استخدام الحيوانات المنوية أقل أو منخفضة الجودة، ويلاحظ إلا القليل زيجوتيس مع الجسم القطبي 2nd . أيضا، إذا تم استخدام العديد من الحيوانات المنوية للتلقيح، يحدث بوليسبيرمي. التلقيح المناسب يؤدي إلى زيجوتيس مع برونوكلي الذكور والإناث. باستخدام هذه المعايير، من الممكن العثور على ما إذا كان يتم التلقيح جيدا أم لا.
    1. بعد الغسيل في كزب الإعلام، رهنا زيجوتيس مع جسم القطبي ثاني microinjection مع اجفب-H2B مرناً.

4-إعداد الدائرة والماصات Microinjection

  1. تمييع الحمض النووي الريبي ترميز اجفب-H2B استخدام مياه خالية من نوكلاس للحصول على تركيز 250 نانوغرام/ميليلتر.
  2. تحضير 2-3 قطرات من حماية الأصناف النباتية--HTF H2B اجفب قطرات مرناً، ومعزولة 5-6 قطرات حبيس قطرات كزب (ح-كزب) على الطبق 60 ملم. وتغطي هذه القطرات مع الزيوت المعدنية.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الأعمال التحضيرية على مقاعد البدلاء المختبر. لا يوجد أي شرط لاستخدام تدفق الهواء الصفحي مجلس الوزراء.
  3. سحب زجاج البورسليكات مع ساحبة ميكروبيبيتي (مثلاً P = 500، الحرارة = 825، سحب = 30، حطي = 120، والوقت = 200)
  4. بعد كسر منحنى غيض الماصة، ماصة microinjection الزجاج سحبت قريبة من الحافة (ميكرومتر −300 مرة أخرى) في حوالي 30 ° استخدام ميكروفورجي.

5-microinjection

  1. إيقاف تشغيل سخان لوحة على مرحلة ميكرومانيبولاتور الحيلولة دون قتل زيجوتيس مع بيزو خلال حقن مرناً.
  2. أغسل ومعطف داخل إبر الحقن في HTF حبيس مخزنة يحتوي على 10% حماية الأصناف النباتية (حماية الأصناف النباتية--HTF).
  3. جمع zygotes مخصبة بهيئة القطبي 2nd (الشكل 2B) ونقل زيجوتيس 20-25 إلى الدائرة بمرحلة مجهر المرفقة مع ميكرومانيبولاتور.
  4. تعبئة مرناً H2B اجفب المخفف في الشعيرات الدموية زجاج البورسليكات من النصائح.
  5. عقد اقحه مع ماصة القابضة وثم كسر بيلوسيدا زونا والغشاء سيتوسوليك مع محرك أقراص بيزو.
  6. ضخ حوالي 10 رر مرناً في السيتوبلازم زيجوتيس. إنهاء مرناً-الحقن داخل 10 دقيقة لمنع الضرر الناجم عن أطول استزراع zygotes خارج الحاضنة.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم حقن كبيرة مثل الجسم القطبي 2nd . إذا كان مقدار مرناً حقن كبير جداً، من الممكن يسبب الكسر H2B اجفب الحرة، التي يمكن أن تؤثر في كسر الجوال.
  7. تغسل في مالا يقل عن 3 قطرات 10 دقيقة بعد microinjection، وثم الثقافة zygotes حقنه في كزب في 38 درجة مئوية حتى التحليل زفراب.

6-زفراب التحليل

  1. ح 1 قبل التحليل زفراب، قم بتشغيل الليزر وصفيحة المرفقة إلى مرحلة المجهر [كنفوكل]. تعيين درجة الحرارة عند 38 درجة مئوية.
  2. وضعت 6-10 ميليلتر من وسائط التخزين المؤقت حبيس كزب مغطاة بالزيت المعدني في الطبق أسفل الزجاج عيار 60 ملم والحارة على السخان حتى جمع الزيجوت.
  3. 8-12 ساعة بعد التلقيح، جمع الإعراب عن H2B اجفب زيجوتيس 5-10 ونقل إلى 6-10 ميليلتر من قبل استعد الإسقاط المتوسط مخزنة هيبيس كزب.
    ملاحظة: لتجنب استزراع أطول خارج الحاضنة، استخدمت zygotes معربا عن H2B اجفب 5-10 في كل تحليل. يمكن تحليل zygotes 5 إلى 10 ضمن ح 1.
  4. تعيين شروط تبيض والتصوير وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. القضية [كنفوكل] ليزر المسح مجهر (جدول المواد) يظهر أدناه:
    1. استخدام 60 X عدسة النفط (60 X 60 X/1.35 النفط).
      ملاحظة: العدسات مع أعلى التكبير (أعلى الفتحة العددية) إظهار حساسية أكبر.
    2. تعيين سرعة المسح الضوئي ك 4.0 المايكروثانيه/بكسل والحجم ك "512" على "اقتناء الإعداد" (تكميلية الشكل 1).
    3. زيادة التكبير الرقمي "5" (تكميلية الشكل 1).
      ملاحظة: مطلوب تكبير أعلى للتعرف عما إذا كان التركيز الانجراف يحدث أم لا.
    4. فتح قائمة صبغ (تكميلية الشكل 1) واختار ثم "اجفب". تعيين وقت الملاحظة ك 1.6 s (يتم تعيين الفاصل الزمني كالأعداد "تشغيل حرة") (الإضافي رقم 1)
      ملاحظة: قد يسبب المزيد من نقاط المراقبة بيانات أكثر تفصيلاً، ولكن قد يسبب أيضا الضيائية. في تحليل زفراب، يبدو وقت ملاحظة s 1.6 تكون كافية للكشف عن اللاتناظر الأبوية من الارتخاء الكروماتين.
    5. تعيين عدد الصور ك 12 في المجموع (تكميلية الشكل 1).
    6. بدء تشغيل لوحة "التحفيز الإعداد" وثم انقر فوق "الرئيسي" في أوسيسكانير. تعيين سرعة بيكسل المايكروثانيه 10.0 المسح الضوئي. انقر فوق "تنشيط في سلسلة" ثم قم بتعيين PreActivation "3 إطارات" ووقت التنشيط "5 ثانية" (تكميلية الشكل 1).
    7. انقر فوق "التركيز x 2" وتعيين التركيز وثم "إيقاف".
    8. مجموعة تبيض والتصوير طاقة الليزر (477 nm) في µW 110 و 15، على التوالي، ضبط الليزر "عداد الطاقة" (تكميلية الشكل 1).
      ملاحظة: تبييض قوية جداً قد يسبب منطقة المبيضة أكبر، مما يتسبب في صعوبات بالنسبة للتحليل الكمي. لقياس قوة الليزر، استخدام مقياس طاقة. من المهم تأكيد قوة الليزر لتجنب تأثير تدهور قوة الليزر المتصلة بالوقت.
    9. انقر فوق "قصاصة Rect" (تكميلية الشكل 1) في لوحة "الإعداد التحفيز". تعيين المنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار؛ أحمر؛ ROI #1B) ك 40 × 40 بكسل (7.6 ميكرومتر2). تعد منطقة مرجعية (REF؛ أخضر؛ ROI #2)، وفي الخلفية (حرس الحدود؛ أزرق؛ ROI #3) باستخدام "نسخ عائد الاستثمار" و "لصق عائد الاستثمار" (الزر الأيمن على الماوس).
      ملاحظة: يمكن تعيين حجم بكسل من خلال "إدارة العائد على الاستثمار" التي يمكن استدعاؤها بواسطة النقر فوق الزر الأيمن للماوس عندما يكون المؤشر في العائد على الاستثمار. ويعتقد أن أفضل نظراً لأنها يمكن أن توحيد تشتت نقاط زفراب رويس أكبر. ومع ذلك، كبير جداً دوروا لا يمكن استخدام لهذا التحليل لأنه يجعل من الصعب تجنب الجسم السلائف نوية (بروميد البروبيل – ن). كان يعتقد أن تكون خالية من الكروماتين اجفب-H2B في هذه المقصورة وأظهرت ملحوظة التنقل أعلى3. يجب فصل المناطق العائد على الاستثمار، والمرجع إلى أقصى حد ممكن. في حالة إغلاق هاتين المنطقتين، تبيض قد تؤثر أيضا على المنطقة للمرجع.
    10. انقر فوق "لايف" على شريط الأدوات ثم قم بتشغيل "يعيش الأرض" (تكميلية الشكل 1).
      ملاحظة: الأرض الحية يشير إلى كثافة إشارة الأسفار داخل كل عائد الاستثمار ويستخدم لضبط طاقة الليزر باستخدام الجيش الكرواتي. لاحظ أنه إذا لم يتم تحديد العائد على الاستثمار، أن اكتشاف لا كثافة في لوحة الأرض حية.
    11. تحديد موقف عائد الاستثمار
      ملاحظة: يمكن نقل العائد على الاستثمار عن طريق سحب إلى الموضع الذي تريده في برونوكلي. (1) يمكن التأكد من تجنب نوية، و (2) تناسب دوروا كامل نوكليوبلاسم. لا تحتوي على منطقة خارج منطقة الغشاء النووي (السيتوبلازم) في العائد على الاستثمار. توطين H2B اجفب مقيد جداً في نوكليوبلاسم حيث أنه من السهل العثور على ما إذا كان العائد على الاستثمار يحتوي السيتوبلازم أو لا بالأسفار من اجفب-H2B. برونوكلي الذكور تميل إلى أن تكون أكبر من تلك التي للإناث، والتي غالباً ما تكون مترجمة قرب الجسم القطبي 2nd . أثناء استخدام هذه المعايير، القاضي pronuclei الذكور أو الإناث.
    12. انقر فوق "التركيز x 2" (تكميلية الشكل 1) ثم قم بضبط HV سبر طاقة القناة اجفب إلى كثافة الأسفار إلى حوالي 2000 (كثافة fluorescence يتبين في إطار "مؤامرة حية").
  5. انقر فوق "وقت" و "س" (تكميلية الشكل 1) ثم بدء تحليل زفراب.
    ملاحظة: إذا تم تحديد الزر "الوقت" مناسب "t" يظهر على الزر "س".
    1. انقر فوق "سلسلة" القيام به (تكميلية الشكل 1)، الذي يظهر بعد تصوير فراب بالقرب من زر "س"، وثم الحصول على بيانات تحليل فراب.
    2. قم بحفظ الملف "XXXXX عرض صورة 2D" كملف مسمى مفضل (تنسيق الملف oib.) من "حفظ باسم" (Ctrl + Shift + S يمكن أيضا استخدامها).
    3. تحديد العائد على الاستثمار، والمرجع، وحرس الحدود، وثم انقر فوق (Ctrl + A يمكن أيضا استخدام) "تحليل سلسلة" في إطار "عرض صورة ثنائية الأبعاد".
    4. الحصول على بيانات الصف فراب وثم انقر فوق "حفظ" زر في إطار مؤامرة حية.
      ملاحظة: صف البيانات الكمية فراب يتم حفظه كملف csv.
  6. للا مراقبة زفراب، وضعت بعض zygotes حقن مرناً في الانخفاض، وقريب من حافة الأطباق أسفل الزجاج لتجنب التأثير من الأسفار والمراقبة.

7-بيانات الحساب

  1. أثناء استخدام البيانات الكمية التي تم الحصول عليها، وجعل الرسم البياني لمنحنى "الاسترداد" و "كسر المتنقلة" من Excel كما هو موضح في مراجع3،7 مع بعض التعديلات (انظر أدناه وتكميلية ملف أكسل).
  2. حساب الكثافة النسبية عن طريق طرح قيمة حرس الحدود من العائد على الاستثمار، والمرجع في 12 من الصور لكل نقطة في الوقت.
  3. تقسيم قيمة العائد على الاستثمار بالمرجع. نتيجة لذلك يمكن الحصول على 12 عشرات الكثافة النسبية موحدة في كل نقطة في الوقت.
  4. حساب متوسط درجة النسبية للعائد على الاستثمار في 3 من الصور التي التقطت قبل صور تبيض.
  5. حساب معدل الاسترداد. الفجوة التي حصلت 12 عشرات النسبي لعائد الاستثمار الصور التي اتخذت في كل مرة نقطة (التي تم الحصول عليها في 7.1.2.) بمتوسط نقاط النسبية قبل تبييض الصورة (التي تم الحصول عليها في 7.1.3.). رسم منحنى الانتعاش مع استخدام هذه النقاط (الشكل 2E).
  6. حساب معدل تبيض.
    ملاحظة: التبييض المعدل (%) = 100-معدل استرداد الصورةال 4.
  7. حساب الكسر المتنقلة (وسط) باستخدام الصيغة كالتالي10،،من1112
    وسط (%) = معدل استردادال 12 (عند نقطة النهاية)-4 معدل الاستردادth /تبيض معدل × 100.

8. نقل الأجنة

  1. ورفيقه نضجت الممثل المدني الدولي الإناث في 8-12 شهرا مع استؤصل الاسهر لديهم ذكور الفئران الممثل المدني الدولي ليلة قبل نقل الجنين قبل السماح لهم بأن تكون في القفص نفسه بين عشية وضحاها.
  2. جمع الأجنة التي تم تحليلها زفراب والعزم على تطوير إلى مرحلة الخلية اثنان.
  3. إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث مع 0.7-0.9 مل تريبروموثانول 1.2% التخدير أو 0.35-0.45 مل 0.75/4/5mg/kg ميديتوميديني/الميدازولام/بوتورفانول العوامل المختلطة قبل نقل الأجنة.
    ملاحظة: يتحدد حجم التخدير بوزن الجسم في الفئران. تريبروموثانول: 0.2 مل/10 غم وزن الجسم؛ ميديتوميديني/الميدازولام/بوتورفانول المختلطة وكلاء: 0.1 مل/10 غرام وزن الجسم.
    1. نقل هذه الأجنة مرحلة الخلية اثنين في أوفيدوكتس من بسيودوبريجنانت الإناث من الفئران الممثل المدني الدولي مع المكونات مهبلية في أيام 0.5 وظيفة كويتوم (dpc).
    2. بعد نقل الجنين، وضع الفئران الإناث على سخان تعيين عند 37 درجة مئوية حتى تستيقظ.
  4. في dpc 18.5، التضحية بآلام البديلة بخلع عنق الرحم واسترداد الجراء مستمدة من تحليل زفراب زيجوتيس بالعملية القيصرية. وسلمت بعض الجراء المستردة إلى الأم الحاضنة واوزانها الهيئة قيمت كل أسبوع.

النتائج

تحليل زفراب مع اجفب-H2B

تنتج بشكل صحيح تم حقن مرناً ترميز H2B اجفب، الذي ينظر إليه بسبب عصابة تحول بولي تراجع (الشكل 2A)، في السيتوبلازم زيجوتيس مع جسم القطبي 2 في 1-3 ح بعد التلقيح (الشكل 2). 8 إلى 12 ح بعد التلقيح، زيج...

Discussion

تحليل زفراب كما اتضح في هذه الدراسة، لا يسبب الضرر الحرجة للتنمية على المدى الكامل، مما يوحي بهذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية للكشف عن الرابطة بين الأحداث الجزيئية وإمكانية إنمائية الجنينية. أثناء إعادة برمجة، إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة دإط الخلايا، ومن خلالها إمكانيات تفضيلية لتلك ال?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر ساتوشي كيشيجامي، واكاياما ساياكا، هيرواكي ناغاتومو، كاميمورا ساتوشي، وكانا كيشيدا لتوفير الدعم التقني والتعليقات الانتقادية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بالبرنامج وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا لتعزيز الإصلاح للجامعات الوطنية إلى مو؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (16 ح 02593) ومؤسسة العلوم اسادا ومؤسسة العلوم وتاكيدا ل T.W. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal laser scaning microscopeOlympusFV1200FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plateTokai HitTP-110RH26
Inverted microscopeOlympusIX71
Micro manupilatorNarishigeMMO-202ND
Pieze Micro MicromanipulatorPrime techPMAS-CT150
35 mm culture dishFalcom35100835 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dishFalcom35100760 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dishFalcom35100650 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dishMatsunamiD91040050 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oilOrganic spceiality chemicals625071For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oilSigmaM8410-1LFor IVF and embryo culture
glass capillaryDrummond1-000-1000For handling mouse zygotes
Borosilicate glassPrime techB100-75-10-PTFor microinjection of mRNA
Micropipett pullerSutter instrumentP-97/IVFFor preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kitThermo
Fisher scientific		AM1340
Poly (A) tailing kitThermo
Fisher scientific		AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BTemplate plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye Thermo
Fisher scientific		AM8551For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcoholnacalai tesque25970-14
Chloroformnacalai tesque 08401-65
Not ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 Otical power meterHioki3664 Power meter for laser power
StereomicmicroscopeOlympusSZX16

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved