Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme

Résumé

Relâchement de la chromatine semble être impliquée dans le développement potentiel des blastomères. Cependant, on ne sait pas si le relâchement de la chromatine peut être utilisé comme un indice fiable pour le potentiel de développement pour les embryons. Ici, on a décrit un système expérimental dans lequel les zygotes-Evaluation de relâchement de la chromatine peuvent développer à terme.

Résumé

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse. Récemment, la chromatine desserrement ou une ouverture s’est avéré être impliqués dans le potentiel de différenciation cellulaire des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Il a été rapporté précédemment que comparé avec les cellules souches embryonnaires, zygotes hébergent une structure de la chromatine extrêmement desserrées, suggérant sa liaison avec leur totipotence. Toutefois, jusqu'à présent, il n'a pas été traitée si cette structure de la chromatine extrêmement relâché/ouvrir est importante pour les potentialités de développement embryonnaire. Dans la présente étude, afin d’examiner cette hypothèse, un système expérimental dans lequel zygotes qui ont été analysés par fluorescence récupération après blanchiment photo peut se développer à terme sans aucun dommage significatif a été développé. Ce qui est important, ce système expérimental a besoin seulement un chauffage de la thermos-plaque en plus un confocal laser scanning microscope. Les conclusions de cette étude suggèrent que le rétablissement fluorescence après que blanchiment photo analyse (PAF) de l’analyse peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires dans la chromatine zygotique sont importants pour le développement à terme.

Introduction

Après la fécondation, la structure de la chromatine est modifiée dynamiquement, et structure de la chromatine zygotique est puis finalement établie^1,2. Durant cette période, dans les pronucléus paternels, la protéine dominante de la chromatine est passée de protamine en histone. La chromatine qui en résulte est extrêmement différente de celle des spermatozoïdes et des ovocytes féminins en plusieurs points (par exemple, composition variant d’histone, modification des histones). Ainsi, formé de chromatine zygotique est considérée comme important pour le développement ultérieur de l’embryon. Cependant, malgré les efforts pour révéler les détails de la structure de la chromatine zygotiques sur de longues périodes, des méthodes pour évaluer la qualité des zygotes ou pour prédire leur développement à terme au stade unicellulaire en analysant leur structure de la chromatine n’ont jamais été mis en place.

Dans l’étude précédente, il est découvert que les zygotes ont une structure de chromatine extrêmement desserré³. Actuellement, la chromatine desserrement ou une ouverture est censé être un important facteur de différenciation cellulaire potentielle de cellules souches embryonnaires (ES)⁴. ES cellules ne présentent pas d’homogénéité dans la nature, mais sont assez hétérogènes ; dans les colonies de cellules ES, certains acquièrent transitoirement un potentiel plus élevé de différenciation comparable à blastomères des embryons au stade de deux cellules. Au cours de cette transition dans les deux cellules comme État, relâchement de la chromatine dans ES cellules change dans ce qui est comparable avec le stade de deux cellules d’embryons⁵. Relâchement de la chromatine semble donc être important pour le potentiel de différenciation cellulaire et il est possible qui s’ouvrent largement la chromatine dans les zygotes est utile pour l’évaluation du potentiel de développement zygotique.

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse étant donné que cette méthode permet le développement ultérieur et même à terme développement⁶. Parmi les méthodes d’imagerie live, FRAP analyse a été utilisé pour examiner le relâchement de la chromatine dans les embryons préimplantatoires et ES cellules^3,4,5. Si le relâchement de la chromatine zygotiques peut être analysée sans un effet néfaste sur le développement à terme par FRAP analyse, il peut être un outil précieux pour l’évaluation de la qualité des embryons au stade unicellulaire. Toutefois, les effets sur le développement à terme par cette méthode expérimentale n’ont pas été examinés. Récemment, un système d’expérimentation à l’aide de FRAP pour évaluer le relâchement de la chromatine zygotique a été développé. Parce qu’il s’agissait d’un nouveau système d’observation pour les zygotes, il a été appelé comme FRAP zygotique (zFRAP). zFRAP n’a rien à terme développement critique et a été signalée ailleurs⁷. Dans ce rapport, le protocole de cette méthode expérimentale est décrit.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Yamanashi. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Yamanashi (numéro de permis : A24-50). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie de tribromoethanol, et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances. An illustrated aperçu des procédures et de calendrier sont indiquées dans la Figure 1 et tableau 1, respectivement.

1. préparation de l’ARN messager (TranscriptionIn Vitro des ARNm eGFP-H2B)

1. Linéariser 5 µg de modèle ADN pTOPO-eGFP-H2B^3,7 avec 30 U de pas j’ai dans 50 µL à 37 ° C durant la nuit.
2. Prélever 1,5 µL d’ADN digéré pour confirmation si complètement digérée par électrophorèse.
   1. Appliquer 1,5 µL et 3-5 µL d’ADN non digéré avec chargement de colorant dans le puits du gel d’agarose à 2 %, respectivement et sous réserve de l’électrophorèse.
      Remarque : Si la complètement digérée, une seule bande (environ 5 Ko) est observée. ADN non digéré est utilisé comme un contrôle qui s’affiche à un poste différent.
3. Ajouter 151,5 µL de ddH₂O et 200 µL de phénol/chloroforme/isoamylique alcool (25:24:1) pour les autres ADN digéré.
   1. Mélanger vigoureusement par vortex.
   2. Centrifuger à la vitesse maximale pendant 15 minutes.
4. Récupérer le surnageant et puis ajouter 200 µL de chloroforme.
   1. Mélanger vigoureusement par vortex.
   2. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
5. Récupérer le surnageant et ajouter 20 µL d’acétate de sodium 3M et 1,5 µL d’ethachinmate.
   1. Mélanger vigoureusement par vortex.
   2. Ajouter 550 µL d’éthanol à 100 %, puis mélanger vigoureusement par vortex.
   3. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
   4. Jeter le surnageant et laver le culot avec l’éthanol à 70 %.
   5. Sécher le culot par évaporation pendant 5-10 min.
6. Dissoudre le précipité de plasmide dans 8 µL d’eau exempte de nucléase.
7. Évaluer la concentration de plasmide (concentration prévue est d’environ 300 à 500 ng/µL) avec nanodrop en suivant les instructions du fabricant.
8. Effectuer in vitro de transcription de l’ARNm codant pour eGFP-H2B avec 1 µg d’ADN purifié comme modèle dans 20 µL du volume total de réaction en suivant les instructions du fabricant.
   1. Après la transcription in vitro , ajouter 36 μL d’eau, puis récupérer 1,5 µL de 56 µL d’ARNm synthétisé pour l’analyse par électrophorèse (car sans poly A).
9. Effectuer des résidus A poly pour ARNm synthétisé dans un volume de réaction 100 µL en suivant les instructions du fabricant.
10. Ajouter 60 µL de solution de précipitation de chlorure de lithium à la poly un ARNm à queue d’eGFP-H2B, puis mélanger vigoureusement.
    1. Refroidir à-30 ° C pendant 30 min.
    2. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
    3. Jeter le surnageant et laver le culot avec l’éthanol à 70 %.
    4. Sécher le culot par évaporation pendant 5-10 min.
11. Dissoudre le culot avec 20 µL d’eau exempte de nucléase par chauffage à 55 ° C pendant 30 min.
12. Évaluer la concentration de l’ARNm précipité avec nanodrop. Diluer à 500 ng/µL d’eau exempte de nucléase et de conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
13. Confirmer la production d’ARNm préféré ; sujet 1 µL d’ARNm avec/sans (obtenu en 1.8.1 et 1,12 étapes, respectivement) poly une queue mélangée avec 1,5 µL de bromure d’éthidium de 0,1 mg/mL et 3 µL de colorant de chargement d’échantillon pour l’analyse par électrophorèse. Volume appliquée était µL de 5,5.
    Remarque : Si Poly A traînée s’est déroulée, la bande décalée par rapport à l’ARNm sans poly une traînée doit être observée (Figure 2 a).

2. préparation des souris mâles vasectomisés

1. Peser les souris mâles ICR à 8-12 mois en utilisant une échelle de poids.
2. Injecter par voie intrapéritonéale souris mâles avec anesthésie de 1,2 % tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL.
   Remarque : Le montant de l’anesthésie dépend de la taille de la souris. Par exemple, une souris pesant 40 g est injectée avec 0,8 mL d’anesthésie tribromoethanol.
3. Humides de la baie d’éthanol à 70 %.
4. Faire une petite coupe (3-5 mm) sur la baie et puis faire une incision sur la paroi musculaire à l’aide de ciseaux.
   NOTE : Ciseaux et pinces doivent être nettoyés avec l’éthanol à 70 % avant de commencer la chirurgie.
5. Saisir une grosse garniture avec une pince et tirez doucement. Ensuite, les testicules et le canal déférent apparaissent.
   Remarque : Le canal déférent est un tube en U et avec un vaisseau sanguin rouge.
6. Attacher le canal déférent à deux points avec les sutures chirurgicales et découper la partie centrale entre les points liés.
7. Doucement repousser les coussinets adipeux et les testicules dans le berry.
   1. Répétez l’opération avec le testicule restant.
8. Coudre la paroi musculaire avec deux points de suture avec suture chirurgicale.

3. FIV

1. Injecter des 8 - 10 - semaine vieux B6D2F1 femelles (BDF1) souris par voie intrapéritonéale avec 7,5 IU gonadotrophine chorionique équine (eCG) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) à intervalle de 46 à 50 h.
2. Préparer des gouttes de 300 µL humaine tubaire (HTF)⁸ fluides capacitation et insémination 1 jour avant la FIV dans un plat de 30 mm, couvrir ces gouttes avec l’huile minérale sur le banc de laboratoire et ensuite príncuber dans un incubateur pendant la nuit.
3. Sacrifier les souris ICR mâles ayant subi une maturation en dislocation cervicale. Disséquer la cauda épididyme avec une aiguille de 27 G et recueillir le spermatozoïde. Leur culture de capacitation dans 300 µL de médias de FASS pendant 1-2 h à 38 ° C.
4. 16 h après l’injection d’hCG, sacrifier des souris femelles super ovulés par dislocation cervicale. Transférer l’ampoule de l’oviducte dans l’huile minérale à côté de médias de FASS et puis soulignent les cellules du cumulus et complexe des ovocytes de cette ampoule oviducte par une aiguille 30 G dans le milieu préincubées insémination-FASS.
   Remarque : Certaines femelles ne montrent pas souvent l’ovulation malgré un traitement super ovulation. Oviducte élargie ampulla est un signe d’ovulation.
5. Après la capacitation, transférer 2-3 µL du spermatozoïde capacitated dans médias insémination-FASS dans laquelle les ovocytes ovulés ont été collectées.
6. 1 h après l’insémination, recueillir les zygotes fertilisés et traitez-les avec hyaluronidase à 100 µg/mL pendant 10 min dans les médias de⁹ CZB.
   Remarque : Lors de l’insémination est réalisée correctement, 1 h après l’insémination, les zygotes fertilisés avec le globule polaire 2^nd sont observées. Si inférieure ou basse qualité sperme est utilisé, seulement peu zygotes avec le globule polaire 2^nd sont observées. En outre, si plusieurs spermatozoïdes sont utilisés pour l’insémination, polyspermie se produit. Bonne insémination conduit à zygotes avec pronucléus mâles et femelles. En utilisant ces critères, il est possible de trouver si l’insémination se faite bien ou non.
   1. Apres le lavage médias CZB, sous réserve des zygotes avec un second globule polaire microinjection avec eGFP-H2B ARNm.

4. préparation de la chambre et les Pipettes de micro-injection

1. Diluer le RNA encodage eGFP-H2B l’eau exempte de nucléase pour obtenir une concentration de 250 ng/µL.
2. Préparer 2 à 3 gouttes de PVP-FASS eGFP-H2B gouttes ARNm, et 5 à 6 gouttes d’Hepes tamponnée CZB (H-CZB) gouttes sur le plat de 60 mm. Couvrir ces gouttes avec de l’huile minérale.
   Remarque : Ces préparations peuvent être effectuées sur le banc de laboratoire. Il n’y a pas d’exigence pour l’utilisation du cabinet de flux d’air laminaire.
3. Tirez en verre borosilicate avec un micropipettes (p. ex., P = 500, chaleur = 825, pull = 30, vel = 120 et le temps = 200)
4. Après la rupture de l’embout de la pipette, plier la pipette de micro-injection de verre tiré près de la pointe (µm −300 retour) à environ 30 ° à l’aide d’une microforge.

5. microinjection

1. Éteindre le chauffage de la plaque sur la scène du micromanipulateur pour empêcher l’abattage des zygotes avec un piezo pendant l’injection de l’ARNm.
2. Laver et enduire l’intérieur des aiguilles à injection dans HEPES-tampon-FASS contenant 10 % PVP (JcJ-FASS).
3. Collecter les zygotes fertilisés avec un globule polaire de 2^nd (Figure 2 b) et transférer des zygotes de 20-25 dans la chambre de la platine du microscope attachée avec un micromanipulateur.
4. Remplissez l’ARNm eGFP-H2B dilué dans les capillaires en verre de borosilicate de la pointe.
5. Tenez le zygote avec une pipette de tenue et puis briser la zone pellucide et la membrane cytosolique avec un disque piézo-électrique.
6. Injecter environ 10 pL de l’ARNm dans le cytoplasme des zygotes. Fini les ARNm-injection moins de 10 min pour éviter tout dommage causé en plus cultivant les zygotes en dehors de l’incubateur.
   Remarque : Le volume d’injection devrait être aussi grand que le globule polaire 2^nd . Si la quantité d’ARNm injecté est trop grande, il est possible de provoquer la fraction libre eGFP-H2B, susceptibles d’affecter la fraction mobile.
7. 10 min après microinjection, laver au moins 3 gouttes et puis la culture les zygotes injectées dans CZB à 38 ° C jusqu'à l’analyse de zFRAP.

6. zFRAP analyse

1. 1 h avant l’analyse zFRAP, allumer le laser et la plaque chauffante, attaché à l’étape de la microscopie confocale. Réglez la température à 38 ° C.
2. Mettre 6-10 µL de médias CZB tampon HEPES couverte d’huile minérale sur le plat de fond de verre de 60 mm et chaud sur le radiateur jusqu'à collection zygote.
3. 8 - 12 h après l’insémination, collect zygotes exprimant eGFP-H2B 5-10 et le transfert dans 6-10 µL de préchauffée chute moyenne de tampon HEPES CZB.
   Remarque : Pour éviter une culture plus longtemps en dehors de l’incubateur, 5-10 exprimant eGFP-H2B zygotes servaient à chaque analyse. 5 à 10 zygotes peuvent être analysés à 1 h.
4. Définir les conditions de blanchiment et d’imagerie selon les instructions du fabricant. L’affaire un confocal laser scanning microscope (Table des matières) est illustré ci-dessous :
   1. Utilisation 60 X lentille de l’huile (60 X 60 X / 1,35 huile).
      NOTE : Les lentilles avec grossissement (ouverture numérique plus élevée) Voir la plus élevée une sensibilité plus élevée.
   2. Réglez la vitesse de balayage comme 4.0 µs/Pixel ou une taille comme « 512 » sur « Acquisition Setting » (la Figure 1).
   3. Augmenter le zoom numérique à « 5 » (la Figure 1).
      Remarque : Un zoom plus élevé est nécessaire pour reconnaître si dérive de discussion ait lieu ou non.
   4. Ouvrez la liste de colorant (la Figure 1) et puis choisissez « EGFP ». La valeur de temps d’observation que 1.6 s (intervalle défini comme paramètre de « free run ») (la Figure 1)
      Remarque : Plusieurs points d’observation peuvent provoquer des données plus détaillées, mais il peut également provoquer de phototoxicité. Dans l’analyse de zFRAP, un temps d’observation s 1.6 semble être suffisant pour détecter l’asymétrie parental de relâchement de la chromatine.
   5. Définir le nombre de photos que 12 au total (la Figure 1).
   6. Démarrer Panneau de « Réglage de Stimulus », puis cliquez sur « Main » sur UseScanner. Définir la vitesse comme 10,0 µs/Pixel de balayage. Cliquez sur « Activation en série », puis définissez pré-allumage « 3 frames » ainsi que le temps d’Activation comme « 5 sec » (la Figure 1).
   7. Cliquez sur « Focus x 2 » et définir le focus et ensuite sur « Stop ».
   8. La valeur de blanchiment et d’imagerie laser puissance (477 nm) à µW 110 et 15, respectivement, en réglage « gage puissance de laser » (la Figure 1).
      NOTE : Blanchiment très forte peut entraîner une plus grande surface blanchie, ce qui provoque des difficultés d’analyse quantitative. Pour la mesure de la puissance du laser, utilisez un wattmètre. Il est important de confirmer la puissance du laser pour éviter l’effet de la détérioration liées au temps de la puissance du laser.
   9. Cliquez sur « Clip Rect » (la Figure 1) dans le panneau de réglage de Stimulus. Définir la zone d’intérêt (ROI ; rouge ; ROI 1 b #) 40 x 40 pixels (7,6 µm²). Préparer une région de référence (REF ; vert ; Retour sur investissement #2) et un fond (BG ; bleu ; ROI #3) à l’aide de « copier le ROI » et « coller le ROI » (bouton de clic-droit sur la souris).
      Remarque : Taille de Pixel peut être réglée par « Gestionnaire de ROI », qui peut être appelé en cliquant sur le bouton droit de la souris lorsque le curseur est sur le retour sur investissement. Grands ROIs sont censés être mieux car ils peuvent normaliser la dispersion de la partition de zFRAP. Cependant, trop grande d’un ROI ne peut servir pour cette analyse car il est difficile d’éviter l’organisme précurseur de nucléole (CNLC). H2B-eGFP dans ce compartiment était considéré comme exempt de la chromatine et remarquable de mobilité supérieure³. ROI et REF zones devraient être séparés autant que possible. Si ces deux régions sont proches, blanchiment peut aussi toucher la région de REF.
   10. Cliquez sur « Live » sur la barre d’outils, puis lancez « Live Plot » (la Figure 1).
       Remarque : Terrain Live indique l’intensité de signal de fluorescence au sein de chaque ROI et est utilisé pour ajuster la puissance du laser à l’aide de HV. Notez que si le ROI n’est pas activée, aucune intensité ne serait détectée sur panneau tracé direct.
   11. Détermination de la position du ROI
       NOTE : Retour sur investissement peut être déplacé en le faisant glisser dans la position souhaitée dans pronucléus. (1) être sûr d’éviter le nucléole et (2) fit le ROI ensemble dans le nucléoplasme. Ne contiennent pas de la région à l’extérieur de la zone de la membrane nucléaire (cytoplasme) dans le ROI. La localisation d’eGFP-H2B est fortement restreint dans le nucléoplasme afin qu’il soit facile de trouver le ROI contient cytoplasme ou non par la fluorescence d’eGFP-H2B. Pronucléus mâles ont tendance à être plus grandes que celles des femelles, qui sont souvent localisées près du globule polaire 2^nd . Lors de l’utilisation de ces critères, le juge les pronucléus mâles ou femelles.
   12. Cliquez sur « Focus x 2 » (la Figure 1) puis ajustez la jauge de puissance HV du chenal pour EGFP dans l’intensité de la fluorescence à environ 2000 (intensité de la fluorescence peut être vu dans la fenêtre « complot direct »).
5. Cliquez sur « Time », puis « XY » (la Figure 1) pour démarrer l’analyse de zFRAP.
   Remarque : Si le bouton « Time » est correctement sélectionné, « t » apparaît sur le bouton « XY ».
   1. Cliquez sur « Série fait » (la Figure 1), qui apparaît après l’imagerie FRAP près de la touche « XY » et puis obtenir FRAP-a analysé les données.
   2. Enregistrez le fichier « 2D vue-Image XXXXX » comme un fichier nommé préféré (format de fichier oib.) par « enregistrer sous » (Ctrl + Maj + S peut être également utilisé).
   3. Sélectionnez retour sur investissement, REF et BG et puis cliquez sur (Ctrl + A peut être également utilisé) « Analyse de la série » dans la fenêtre « Image de vue 2D ».
   4. Obtenir des données de ligne FRAP et puis cliquez sur « enregistrer » dans la fenêtre de tracé direct.
      Remarque : Le rang des données quantitatives FRAP sont enregistrées dans un fichier csv.
6. Aucun contrôle de zFRAP, mettre un peu de zygotes injectés avec l’ARNm sur la goutte, qui est près de la jante de la vaisselle en verre bas pour éviter l’effet de l’observation de la fluorescence.

7. calcul de données

1. Tout en utilisant les données quantitatives obtenues, faire le graphique de la « courbe de récupération » et la « fraction mobile » par Excel comme indiqué dans les références^3,7 , avec quelques modifications (voir ci-dessous et supplémentaire fichier excel).
2. Calculer l’intensité relative en soustrayant la valeur du BG de celles du ROI et REF dans 12 photos pour chaque point dans le temps.
3. Divise la valeur de retour sur investissement par celle de la REF. En conséquence, les 12 notes standardisées d’intensité relative à chaque instant peuvent être obtenues.
4. Calculer la moyenne du score relatif pour ROI en 3 images prises avant la photo de blanchiment.
5. Calculer le taux de récupération. Diviser que le 12 a obtenu des scores relatifs pour ROI dans les images prises à chaque instant (obtenu à 7.1.2.) par la moyenne du score relatif avant photo blanchiment (obtenus à 7.1.3.). Dessiner la courbe de récupération avec l’aide de ces scores (Figure 2E).
6. Calculer le taux de blanchiment.
   NOTE : Blanchiment de taux (%) = 100 - taux de récupération de 4^ème image.
7. Calculer la fraction mobile (MF) en utilisant la formule comme suit^10,11,12
   MF (%) = taux de récupération 12^ème (à la fin) - 4 taux de récupération de^th / taux × 100 de blanchiment.

8. transplantation embryonnaire

1. S’accoupler des femelles ayant subi une maturation de l’IC à 8-12 mois avec vasectomisés souris ICR mâles la nuit avant le transfert de l’embryon en leur permettant d’être dans la même cage, du jour au lendemain.
2. Recueillir les embryons qui ont été analysé zFRAP et déterminés à développer pour le stade de deux cellules.
3. Par voie intrapéritonéale injecter des souris femelles avec anesthésie de 1,2 % tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL ou 0,35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg médétomidine/midazolam/butorphanol mixte agents avant le transfert d’embryons.
   Remarque : Le volume de l’anesthésie est déterminé par le poids corporel des souris. Tribromoethanol : 0,2 mL/10 g de poids corporel ; médétomidine/midazolam/butorphanol mélangé des agents : 0,1 mL/10 g de poids corporel.
   1. Transférer ces embryons au stade de deux cellules dans les oviductes de pseudo-gravides souris ICR femelles avec un plug vaginal à 0,5 jour post coitum (dpc).
   2. Après le transfert d’embryon, mettre les souris femelles sur l’appareil de chauffage réglé à 37 ° C jusqu'à ce qu’ils se réveillent.
4. À 18,5 dpc, sacrifier la mère porteuse par dislocation cervicale et récupérer les chiots provenant de zygotes zFRAP analysé par césarienne. Certains des petits récupérés ont été livrés à la mère nourricière et leurs poids corporel ont été évalués chaque semaine.

Résultats

zFRAP analyse avec eGFP-H2B

Produit correctement ARNm codant pour eGFP-H2B, qui est considéré comme un groupe décalé posés par poly une traînée (Figure 2 a), a été injecté dans le cytoplasme des zygotes avec un 2ème globule polaire à 1-3 h après l’insémination (Figure 2 b). 8 à 12 h après l’insémination, les zygotes avec 2 pronucléi montrant l’expre...

Discussion

Comme l’a révélé dans cette étude, l’analyse de zFRAP ne provoque pas de dégâts critiques au développement à terme, suggérant que cette méthode est un outil très utile pour révéler le lien entre les événements moléculaires et le potentiel de développement embryonnaire. Au cours de la reprogrammation, dans les deux cellules comme état de cellules ES, par lequel le différentiel potentiel de ces cellules devient plus élevé que celui des embryons au stade de deux cellules, relâchement de la chromati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16