Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term

Riepilogo

Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.

Abstract

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D'importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.

Introduzione

Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito^1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell'istone, modifica dell'istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli della struttura della cromatina zygotic per lunghi periodi, non sono mai stati metodi per valutare la qualità degli zigoti o per predire il loro sviluppo di termine nella fase di un cella analizzando la loro struttura della cromatina stabilito.

Nello studio precedente, si è scoperto che zigoti hanno una struttura della cromatina estremamente allentata³. Attualmente, scioltezza della cromatina o apertura è creduta per essere un fattore importante per la differenziazione cellulare potenziale di cellule staminali embrionali (ES)⁴. Le cellule ES non esibiscono omogeneità nella natura, ma sono piuttosto eterogenee; nelle colonie di cellule ES, alcuni transitoriamente acquisire un maggiore potenziale di differenziazione paragonabile a blastomeri degli embrioni in fase due-cellula. Durante questa transizione in due-cellula come stato, scioltezza della cromatina in ES cellule si trasforma in che cosa è paragonabile con fase bicellulare embrioni⁵. Così, scioltezza di cromatina sembra essere importante per potenziale di differenziazione cellulare ed è possibile che ampiamente aperto della cromatina in zigoti è utile per la valutazione del potenziale inerente allo sviluppo zygotic.

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi in quanto questo metodo permette lo sviluppo successivo e anche pieno-termine sviluppo⁶. Come uno dei metodi di formazione immagine diretta, FRAP analisi sono stato utilizzato per esaminare la scioltezza della cromatina in embrioni preimpianto ed ES cellule^3,4,5. Se scioltezza zygotic cromatina possa essere analizzato senza un effetto negativo sullo sviluppo di pieno-termine di FRAP analisi, può essere un valido strumento per la valutazione della qualità degli embrioni nella fase uno-cella. Tuttavia, non sono stati esaminati gli effetti sullo sviluppo di pieno-termine da questo metodo sperimentale. Recentemente, è stato sviluppato un sistema sperimentale utilizzando FRAP per valutare la scioltezza della cromatina zygotic. Perché questo era un nuovo sistema di osservazione per zigoti, esso è stato chiamato come zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP non ha colpito criticamente termine sviluppo è stato segnalato altrove⁷. In questo rapporto, il protocollo di questo metodo sperimentale è descritto.

Protocollo

Questo studio è stato svolto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università di Yamanashi. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell'Università di Yamanashi (permesso numero: A24-50). Tutti gli interventi sono stati eseguiti in anestesia tribromoethanol, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. Una panoramica illustrata delle procedure e l'orario sono mostrati in Figura 1 e tabella 1, rispettivamente.

1. preparazione di RNA messaggero (In Vitro trascrizione del mRNA di eGFP-H2B)

1. Linearizzare 5 µ g di DNA pTOPO-eGFP-H2B^3,7 modello con 30 U di non ho in 50 µ l a 37 ° C durante la notte.
2. Raccogliere 1,5 µ l di DNA digerito per conferma se completamente digeriti mediante elettroforesi.
   1. Applicare 1,5 µ l e 3-5 µ l di DNA digerito con caricamento tintura nel pozzetto del gel di agarosio al 2%, rispettivamente e sottoposti ad elettroforesi.
      Nota: Se completamente digerito, si osserva una banda singola (circa 5 kb). DNA non digerito viene utilizzato come un controllo, che viene visualizzato in una posizione diversa.
3. Aggiungere 151.5 µ l di ddH₂O e 200 µ l di fenolo/cloroformio/isoamil alcool (25:24:1) per i restanti digerito il DNA.
   1. Mescolare energicamente dal vortice.
   2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
4. Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 200 µ l di cloroformio.
   1. Mescolare energicamente dal vortice.
   2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
5. Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3M e 1,5 µ l di ethachinmate.
   1. Mescolare energicamente dal vortice.
   2. 550 µ l di etanolo al 100% e poi mescolare vigorosamente Vortex.
   3. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
   4. Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.
   5. Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.
6. Sciogliere il DNA del plasmide precipitata in 8 µ l di acqua priva di nucleasi.
7. Valutare la concentrazione di plasmide (concentrazione prevista è di circa 300-500 ng / µ l) con nanodrop seguendo le istruzioni del fabbricante.
8. Eseguire trascrizione in vitro per mRNA codificante eGFP-H2B con 1 µ g di DNA purificato come un modello in 20 µ l di volume di reazione totale seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Dopo la trascrizione in vitro , aggiungere 36 μL di acqua poi recuperare 1,5 µ l da 56 µ l di mRNA sintetizzato per l'analisi mediante elettroforesi (come senza poli A).
9. Eseguire tailing A poli per mRNA sintetizzato in un 100 µ l di reazione seguendo le istruzioni del produttore.
10. Aggiungere 60 µ l di soluzione di precipitazione del cloruro di litio poli un mRNA munito di eGFP-H2B e poi mescolare vigorosamente.
    1. Raffreddare a-30 ° C per 30 min.
    2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
    3. Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.
    4. Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.
11. Dissolva la pallina con 20 µ l di acqua priva di nucleasi di riscaldamento a 55 ° C per 30 min.
12. Valutare la concentrazione del mRNA precipitato con nanodrop. Diluire a 500 ng / µ l con acqua priva di nucleasi e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
13. Confermare la produzione di mRNA preferito; soggetti 1 µ l di mRNA con/senza (ottenuti in 1.8.1 e 1,12 passaggi, rispettivamente) poli una coda miscelata con 1,5 µ l di 0,1 mg/mL di bromuro di etidio e 3 µ l di colorante di caricamento del campione per l'analisi di elettroforesi. Volume applicata era 5,5 µ l.
    Nota: Se coda di Poly A è stata completata, la band spostata rispetto al mRNA senza poli una coda dovrebbe essere osservata (Figura 2A).

2. preparazione dei topi maschii di vasectomia

1. Pesare i topi ICR maschii alle 8-12 mesi, utilizzando una scala di peso.
2. Intraperitonealmente iniettare topi maschi con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL.
   Nota: La quantità di anestesia dipende dalle dimensioni del mouse. Ad esempio, un mouse con un peso 40 g viene iniettato con 0,8 mL di anestesia tribromoethanol.
3. Bagnate la bacca con etanolo al 70%.
4. Fare un piccolo taglio (3-5 mm) sulla bacca e poi fare un'incisione sulla parete muscolare con l'aiuto di forbici.
   Nota: Forbici e pinze devono essere pulite con etanolo al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico.
5. Afferrare un rilievo grasso con forcipe ed estrarla delicatamente. Poi, il testicolo ed il dotto deferente appaiono.
   Nota: Vaso deferente è un tubo a forma di U e con un vaso di sangue rosso.
6. Legare il dotto deferente in due punti con suture chirurgiche e poi tagliare la parte centrale tra i punti vincolati.
7. Spingere delicatamente indietro il rilievo grasso e testicolo nella bacca.
   1. Ripetere l'intervento chirurgico con il testicolo rimanente.
8. Cucire la parete muscolare con due punti di sutura con sutura chirurgica.

3. IVF

1. Iniettare 8 - 10 - settimana-vecchio B6D2F1 femminile (BDF1) topi intraperitonealmente con 7,5 IU gonadotropina corionica equina (eCG) e gonadotropina corionica umana (hCG) all'intervallo h 46-50.
2. Preparare gocce di 300 µ l umano tubarica (HTF)⁸ mezzi fluidi per capacitazione e inseminazione 1 giorno prima della fecondazione in vitro in un piatto di 30 mm, coprire queste gocce con l'olio minerale sul banco di laboratorio e poi preincubate in un'incubatrice durante la notte.
3. Sacrificare i topi ICR maschii stagionati di dislocazione cervicale. Sezionare cauda epididimo con un ago 27 G e raccogliere spermatozoo. Loro cultura per capacitazione a 300 µ l di media HTF per 1-2 h a 38 ° C.
4. 16 h dopo l'iniezione di hCG, sacrificare super ovulati topi femminili di dislocazione cervicale. Trasferire il ampulla ovidotto in olio minerale accanto supporto HTF e poi tirare fuori cellule del cumulo e ovociti complessi da questa ampolla ovidotto da un ago 30-G nel mezzo preincubato inseminazione-HTF.
   Nota: Alcuni topi femminili non mostrano spesso ovulazione malgrado il trattamento di superovulazione. Ovidotto allargata ampolla è un segno di ovulazione.
5. Dopo capacitazione, trasferimento 2-3 µ l dello spermatozoo capacitato in media di inseminazione-HTF in cui sono stati raccolti gli ovociti ovulated.
6. 1 h dopo l'inseminazione, raccogliere gli zigoti fecondati e trattarli con ialuronidasi a 100 µ g/mL per 10 min in media⁹ CZB.
   Nota: Quando l'inseminazione viene eseguita correttamente, 1 h dopo l'inseminazione, gli zigoti fecondati con il corpo di polar 2^nd sono osservati. Se lo sperma viene utilizzato meno o bassa qualità, si osservano solo poco zigoti con il corpo di polar 2^nd . Inoltre, se molti spermatozoi vengono utilizzati per l'inseminazione, gamete si verifica. Corretta inseminazione conduce a zigoti con pronuclei maschile e femminile. Utilizzando questi criteri, è possibile trovare se l'inseminazione è fatto bene o no.
   1. Dopo il lavaggio nei media CZB, sottoporre gli zigoti con un secondo corpo polare a microiniezione con eGFP-H2B mRNA.

4. preparazione della camera e microiniezione pipette

1. Diluire il RNA codifica eGFP-H2B utilizzando acqua priva di nucleasi per ottenere una concentrazione di 250 ng / µ l.
2. Preparare 2-3 gocce di PVP-HTF eGFP-H2B gocce mRNA e 5-6 gocce di Hepes tamponata CZB (H-CZB) gocce sul piatto da 60 mm. Coprire queste gocce con olio minerale.
   Nota: Queste preparazioni possono essere eseguite sul banco di laboratorio. Non c'è nessun requisito per l'utilizzo mobile di flusso d'aria laminare.
3. Tirare in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta (ad es., P = 500, calore = 825, pull = 30, vel = 120 e tempo = 200)
4. Dopo aver rotto la punta della pipetta, piegare la pipetta di microiniezione di vetro tirato vicino alla punta (versione 300 µm indietro) a circa 30 ° utilizzando un microforge.

5. microiniezione

1. Spegnere la piastra di riscaldamento sul palco del micromanipolatore per evitare l'uccisione degli zigoti con un piezo durante l'iniezione di mRNA.
2. Lavare e rivestire l'interno di aghi per iniezione in HEPES-tamponata-HTF contenente 10% PVP (PVP-HTF).
3. Raccogliere gli zigoti fecondati con un corpo di polar 2^nd (Figura 2B) e trasferimento di zigoti di 20-25 sulla camera della fase microscopio collegata con un micromanipolatore.
4. Riempire il mRNA diluita eGFP-H2B nei vasi capillari di vetro borosilicato dalle punte.
5. Tenere lo zigote con una pipetta di supporto e quindi rompere la zona pellucida e la membrana citosolica con un azionamento piezoelettrico.
6. Iniettare circa 10 pL di mRNA nel citoplasma degli zigoti. Finitura mRNA-iniezione entro 10 min per evitare danni causati da più coltura gli zigoti all'esterno dell'incubatrice.
   Nota: Il volume di iniezione deve essere grande quanto il corpo polare 2^nd . Se la quantità di mRNA iniettato è troppo grande, è possibile causare la frazione libera eGFP-H2B, che può influenzare la frazione mobile.
7. 10 min dopo microiniezione, lavare in almeno 3 gocce e poi cultura gli zigoti iniettati in CZB a 38 ° C fino all'analisi di zFRAP.

6. zFRAP analisi

1. 1 h prima dell'analisi zFRAP, accendere il laser e la piastra calda associata alla fase del microscopio confocale. Impostare la temperatura a 38 ° C.
2. Mettere 6-10 µ l di media tamponata HEPES CZB coperto con olio minerale sul piatto inferiore 60 mm vetro e caldo della stufa fino a collezione zigote.
3. 8 - 12 h dopo l'inseminazione, raccogliere 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti e trasferimento in 6-10 µ l di pre-riscaldati goccia media CZB tamponata HEPES.
   Nota: Per evitare la coltura più a lungo all'esterno dell'incubatrice, 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti sono stati utilizzati a ogni analisi. 5 a 10 zigoti possono essere analizzati entro 1 h.
4. Impostare le condizioni di formazione immagine e imbianchimento secondo le istruzioni del produttore. Il caso un laser confocale a scansione microscopio (Tabella materiali) è illustrato di seguito:
   1. Uso 60 X lente di olio (60 X 60 X / 1,35 olio).
      Nota: Lenti con maggiore sensibilità Visualizza ingrandimento (maggiore apertura numerica).
   2. Impostare la velocità di scansione come 4,0 µs/Pixel e dimensioni come "512" su "Impostazione di acquisizione" (Supplemental figura 1).
   3. Aumentare lo zoom digitale a "5" (Supplemental figura 1).
      Nota: Un alto livello zoom è necessario per riconoscere se deriva lo stato attivo si verifica o non.
   4. Aprire la lista di tintura (Supplemental figura 1) e scegliere "EGFP". Impostare il tempo di osservazione come 1.6 s (intervallo è impostato come "free run" impostazione) (Supplemental figura 1)
      Nota: Più punti di osservazione possono causare dati più dettagliati, ma esso può anche causare la fototossicità. Nell'analisi zFRAP, un tempo di osservazione s 1,6 sembra essere sufficiente a rilevare l'asimmetria dei genitori di scioltezza della cromatina.
   5. Impostare il numero di immagini come 12 in totale (Supplemental figura 1).
   6. Avviare il pannello di "Impostazione di stimolo" e quindi fare clic su "Main" su UseScanner. Impostare la velocità come 10.0 µs/Pixel di scansione. Fare clic su "Attivazione in serie" e quindi impostare MultiOEM come "3 fotogrammi" e tempo di attivazione come "5 sec" (Supplemental figura 1).
   7. Fare clic su "Focus x 2" e impostare lo stato attivo e quindi "Stop".
   8. Impostare lo sbiancamento e potere del laser di imaging (477 nm) a 110 e 15 µW, rispettivamente, di regolazione "gage potenza del laser" (Supplemental figura 1).
      Nota: Sbianca molto forte può causare una più grande zona sbiancata, che provoca difficoltà di analisi quantitativa. Per misurare la potenza del laser, utilizzare un misuratore di potenza. È importante confermare la potenza del laser per evitare l'effetto di deterioramento temporale della potenza del laser.
   9. Fare clic su "Clip Rect" (Supplemental figura 1) nel pannello di impostazione di stimolo. Impostare l'area di interesse (ROI; rosso; ROI #1B) come 40 x 40 pixel (7,6 µm²). Preparare una regione di riferimento (REF; verde; ROI n. 2) e uno sfondo (BG; blu; ROI n. 3) utilizzando "copia ROI" e "Incolla ROI" (tasto destro del mouse).
      Nota: Dimensione dei Pixel può essere impostato tramite "Gestione ROI", che può essere chiamato cliccando il tasto destro del mouse quando il cursore è sul ROI. ROIs più grandi sono pensati per essere migliore dato che consente di standardizzare la dispersione del Punteggio zFRAP. Tuttavia, troppo grande di un ROI non può essere utilizzato per questa analisi perché rende più difficile evitare il corpo di precursore del nucleolo (NPB). eGFP-H2B in questo comparto è stato pensato per essere liberi dalla cromatina e ha mostrato notevole mobilità superiore³. ROI e REF aree devono essere separati per quanto possibile. Se queste due regioni sono vicini, lo sbiancamento può colpire anche la regione del Rif.
   10. Fare clic su "Live" sulla barra degli strumenti e quindi avviare "Live Plot" (Supplemental figura 1).
       Nota: Live trama indica l'intensità del segnale di fluorescenza all'interno di ogni ROI e viene utilizzato per regolare la potenza del laser utilizzando HV. Nota che se ROI non è selezionata, nessuna intensità verrebbe rilevato sul pannello Live trama.
   11. Determinazione della posizione di ROI
       Nota: ROI può essere spostate trascinandole nella posizione desiderata in pronuclei. (1) essere sicuri di evitare il nucleolo e (2) inserire il ROI intero il nucleoplasma. Non contengono la regione di fuori della zona della membrana nucleare (citoplasma) in ROI. La localizzazione di eGFP-H2B altamente è limitata nel nucleoplasma, in modo che è facile da trovare se ROI contiene citoplasma o non con la fluorescenza di eGFP-H2B. Pronuclei maschili tendono ad essere più grandi di quelli delle femmine, che sono spesso localizzate vicino al corpo di polar 2^nd . Durante l'utilizzo di questi criteri, giudicare i pronuclei maschili o femminili.
   12. Fare clic su "Focus x 2" (Supplemental figura 1) e quindi regolare il calibro di potere HV del canale per EGFP in intensità di fluorescenza a circa 2000 (l'intensità di fluorescenza può essere visto nella finestra "stampa diretta").
5. Fare clic su "Time" e quindi "XY" (Supplemental figura 1) per avviare l'analisi di zFRAP.
   Nota: Se opportunamente è selezionato il pulsante di "Tempo", "t" viene visualizzato sul pulsante di "XY".
   1. Fare clic su "Serie fatto" (Supplemental figura 1), che compare dopo FRAP imaging vicino a pulsante"XY" e quindi ottenere dati analizzati FRAP.
   2. Salvare il file "2D immagine vista XXXXX" come un file denominato preferito (oib. formato di file) di "Salva come" (Ctrl + Maiusc + S può essere anche usato).
   3. Selezionare ROI, REF e BG e quindi fare clic su (Ctrl + A può essere usato anche) "Analisi delle serie" nella finestra "immagine 2D della vista".
   4. Ottenere i dati FRAP riga e quindi fare clic su "Salva" pulsante nella finestra del grafico dal vivo.
      Nota: Riga dati quantitativi FRAP viene salvati come file csv.
6. Per nessun controllo di zFRAP, mettere alcuni degli zigoti iniettati con mRNA sulla goccia, che è vicino al cerchio i fondo dei piatti di vetro per evitare l'effetto dall'osservazione in fluorescenza.

7. dati calcolo

1. Durante l'utilizzo i dati quantitativi ottenuti, rendere il grafico della "curva di recupero" e "frazione mobile" di Excel, come illustrato in riferimenti^3,7 con alcune modifiche (Vedi qui sotto e supplementari file excel).
2. Calcolare l'intensità relativa sottraendo il valore di BG da quelli di ROI e REF in 12 immagini per ogni punto di tempo.
3. Dividere il valore del ROI per che la Ref. Di conseguenza, può essere ottenuto 12 gol di intensità relativa standardizzata in ogni momento.
4. Calcolare la media del punteggio relativo per il ROI in 3 immagini scattate prima foto lo sbiancamento.
5. Calcolare il tasso di recupero. Dividere che i 12 ottenuti relativi punteggi per ROI nelle immagini scattate in ogni punto del tempo (ottenuto a 7.1.2.) dalla media del punteggio relativo prima foto dello sbiancamento (ottenuto a 7.1.3.). Disegnare la curva di recupero con l'utilizzo di questi punteggi (Figura 2E).
6. Calcolare il tasso d'imbianchimento.
   Nota: Lo sbiancamento tasso (%) = 100 - tasso di recupero di immagine 4^th .
7. Calcolare la frazione mobile (MF) utilizzando la formula come segue^10,11,12
   MF (%) = 12^th tasso di recupero (al punto finale) - Tasso di recupero 4^th / candeggio tasso × 100.

8. embriotransfer

1. Accoppiano femmine ICR stagionate in 8-12 mesi con topi ICR maschii vasectomia la notte prima di trasferire l'embrione consentendo loro di essere nella stessa gabbia durante la notte.
2. Raccogliere gli embrioni che sono stati analizzati zFRAP e determinata a sviluppare alla fase due-cellula.
3. Intraperitonealmente iniettare topi femminili con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL o con 0,35 - 0,45 mL di 0.75/4/5mg/kg medetomidina/midazolam/butorfanolo mista agenti prima del trasferimento dell'embrione.
   Nota: Il volume dell'anestesia è determinato dal peso del corpo dei topi. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g di peso corporeo; medetomidina/midazolam/butorfanolo miscelati agenti: 0,1 mL/10 g di peso corporeo.
   1. Trasferire questi embrioni in fase due-cellula in ovidotti dei topi ICR femminili pseudopregnant con un plug vaginale al coitum dell'alberino di 0,5 giorni (dpc).
   2. Dopo il trasferimento embrionario, mettere i topi femminili sul riscaldatore impostato a 37 ° C fino a quando si svegliano.
4. Al 18,5 dpc, sacrificare la madre surrogata di dislocazione cervicale e recuperare i cuccioli derivati da zigoti zFRAP-analizzati dalla sezione cesarean. Alcuni dei cuccioli recuperati sono stati consegnati per la madre adottiva e del loro peso corporeo sono stato valutato ogni settimana.

Risultati

zFRAP analisi con eGFP-H2B

Prodotto correttamente mRNA codificante eGFP-H2B, che è visto come una band spostata causato da poli una coda (Figura 2A), è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un 2 ° corpo polare a 1-3 h dopo l'inseminazione (Figura 2B). Otto a 12 h dopo l'inseminazione, zigoti con 2 pronuclei mostrando l'espressione di eGFP-H2B sono stati raccol...

Discussione

Come rivelato in questo studio, l'analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l'associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16