胚荧光恢复后的染色质松动的光漂分析, 允许足月发展

摘要

染色质松动似乎参与了卵裂球的发展潜力。然而, 目前尚不清楚染色质松动是否可以作为胚胎发育潜能的可靠指标。在这里, 我们描述了一个实验系统, 其中染色质松动评价受精卵可以发展到足月。

摘要

实时成像是一个强大的工具, 允许分析分子事件在个体发育期间。最近, 染色质松动或开放性已被证明参与了细胞分化潜能的多潜能胚胎干细胞。此前据报道, 与胚胎干细胞相比, 受精卵港的染色质结构非常松动, 暗示其与全能的关系。然而, 直到目前为止, 还没有讨论这一极其松动/开放的染色质结构对胚胎发育潜力是否重要。在本研究中, 为了检验这一假说, 本文研制了一种实验系统, 在受精卵的光漂白后, 通过荧光恢复分析, 得到了不明显的损伤。重要的是, 除了共焦激光扫描显微镜, 这个实验系统还需要一个热水瓶加热器。这项研究的结果表明, 光漂白分析 (酶) 分析后的荧光恢复可以用来调查胚染色质中的分子事件是否对足月的发展是重要的。

引言

受精后, 染色质结构动态改变, 胚染色质结构最终建立^1,2。在此期间, 在父系 pronuclei, 显性染色质蛋白从精蛋白转化为组蛋白。由此产生的染色质与精子和雌性卵母细胞在几个点上的差别非常大 (例如, 组蛋白变异组成, 组蛋白修饰)。因此, 形成的胚染色质被认为是重要的后续胚胎发育。然而, 尽管努力揭示胚染色质结构的细节, 在长时间内, 评价受精卵质量的方法或预测其在单细胞阶段的全面发展, 通过分析其染色质结构从来没有建立。

在先前的研究中, 发现受精卵有一个非常松散的染色质结构³。目前, 染色质松动或开放性被认为是一个重要因素的细胞分化潜能的胚胎干细胞 (ES) 细胞⁴。ES 细胞在自然界中并不表现出同质性, 而是相当异构;在 ES 细胞菌落中, 一些瞬时获得的分化电位较高, 可与卵裂球的两细胞阶段胚胎相媲美。在这种向双细胞状状态的过渡过程中, ES 细胞的染色质松动改变为与两细胞阶段胚胎⁵相媲美的东西。因此, 染色质松动似乎是重要的细胞分化潜力, 这是可能的广泛开放染色质在受精卵是有益的评价胚发展潜力。

实时成像是一个强大的工具, 允许分析在个体发育期间的分子事件, 因为这种方法允许随后的发展, 甚至是⁶的足月发展。作为一种实时成像方法, 酶分析已用于检查前体细胞和 ES 细胞^3,4,5的染色质松动。如果通过酶分析对胚染色质松动进行分析, 对足月发育无不良影响, 可能是评价单细胞期胚胎质量的重要工具。然而, 这一实验方法对足月发展的影响还未被研究。最近, 建立了一个利用酶评价胚染色质松动的实验系统。因为这是一个新的观察系统的受精卵, 它被称为胚酶 (zFRAP)。zFRAP 没有严重影响全面发展, 并已在别处报告⁷。在本报告中, 介绍了该实验方法的协议。

研究方案

这项研究是严格按照《山梨大学实验室动物护理和使用指南》的建议进行的。该议定书获得了山梨大学动物实验伦理学委员会 (许可证号: A24-50) 的批准。所有的手术都是在 tribromoethanol 麻醉下进行的, 并尽一切努力尽量减少痛苦。图 1和表 1分别显示了过程和时间表的插图概述。

1. 信使 RNA 的制备 (eGFP-H2B mRNA 的体外转录)

1. 进行线性化5µg 模板脱氧核糖核酸 pTOPO-eGFP-H2B^3,7与 30 U不I 在50µL 在37°c 隔夜。
2. 收集1.5 µL 的消化 DNA, 以确认是否经电泳完全消化。
   1. 将1.5 µL 和 3-5 µL 的未消化 DNA 与载染料分别应用于2% 琼脂糖凝胶井中, 并经电泳处理。
      注: 如果完全消化, 则观察单个波段 (约 5 kb)。未消化的 DNA 被用作控制, 出现在不同的位置。
3. 添加151.5 µL ddH₂O 和200µL 苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) 的剩余的消化 DNA。
   1. 由涡旋强烈混合。
   2. 离心机以最大速度为15分钟。
4. 恢复上清, 然后添加200µL 氯仿。
   1. 由涡旋强烈混合。
   2. 离心机以最大速度15分钟。
5. 恢复上清, 然后添加20µL 3M 醋酸钠和1.5 µL 的 ethachinmate。
   1. 由涡旋强烈混合。
   2. 加入550µL 的100% 乙醇, 然后用漩涡大力搅拌。
   3. 离心机以最大速度15分钟。
   4. 去掉上清, 然后用70% 乙醇清洗颗粒。
   5. 蒸发 5-10 分钟, 使颗粒干燥。
6. 将沉淀质粒 DNA 溶于8µL 的核酸酶水中。
7. 按照制造商的指示, 评估质粒浓度 (预期浓度约为 300-500 µL) 与 nanodrop。
8. 按照制造商的指示, 在总反应量的20µL 中, 用1µg 纯化 DNA 作为模板, 对 mRNA 编码 eGFP-H2B 进行体外转录。
   1. 在体外转录后, 添加 36 ul 的水, 然后从56µL 的合成 mRNA 中恢复1.5 µL, 进行电泳分析 (如无聚 A)。
9. 按照制造商的指示, 在100µL 反应量中对合成 mRNA 进行聚一尾矿。
10. 将60µL 的氯化锂沉淀液添加到 eGFP-H2B 的多尾 mRNA 中, 然后进行强力搅拌。
    1. -30 摄氏度冷却30分钟。
    2. 离心机以最大速度15分钟。
    3. 去掉上清, 然后用70% 乙醇清洗颗粒。
    4. 蒸发 5-10 分钟, 使颗粒干燥。
11. 用20µL 核酸酶的水, 用55摄氏度的热量将颗粒溶解30分钟。
12. 用 nanodrop 评价沉淀 mRNA 的浓度。稀释至500µL 与核酸酶的水和存储在-80 °c, 直到使用。
13. 确认首选 mRNA 生产;主题1µL 的 mRNA 与/没有 (获得1.8.1 和1.12 步骤, 分别) 聚一尾混合1.5 µL 0.1 毫克/毫升溴溴和3µL 样品加载染料的电泳分析。应用体积为5.5 µL。
    注: 如果聚 a 尾矿成功, 则应观察转移带与没有聚尾矿的 mRNA 相比较 (图 2A)。

2. 输精管切除术雄性小鼠的制备

1. 用体重秤在 8-12 月的时间内称其为雄性小鼠。
2. 腹腔注射 0.7-0.9 毫升 1.2% tribromoethanol 麻醉雄性小鼠。
   注: 麻醉量取决于鼠标大小。例如, 一只重量为40克的老鼠注射了0.8 毫升的 tribromoethanol 麻醉。
3. 用70% 乙醇将浆果淋湿。
4. 在浆果上做一个小切口 (3-5 毫米), 然后在剪刀的帮助下在肌肉壁上做一个切口。
   注: 在开始手术前, 应用70% 乙醇清洗剪刀和镊子。
5. 用镊子夹住脂肪垫, 然后轻轻地拔出。然后, 睾丸和输精管出现。
   注: 输精管为 U 形管, 有红色血管。
6. 用手术缝线将输精管栓在两个点上, 然后在栓点之间切开中间部分。
7. 轻轻地把脂肪垫和睾丸放回浆果里。
   1. 用剩下的睾丸重复手术。
8. 用两针缝合肌肉壁缝合手术。

3. IVF

1. 注射 8-10 周的老女性 B6D2F1 (BDF1) 小鼠腹腔7.5 的马绒毛膜促性腺激素 (eCG) 和人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 在 46-50 h 间隔。
2. 准备300µL 人输卵管液 (HTF)⁸种培养基进行精子和人工授精1天前, 在30毫米的盘子中受精, 用矿物油在实验室的长凳上盖上这些水滴, 然后在一夜之间在孵化箱中 preincubate。
3. 通过颈椎脱位牺牲成熟的雄性小鼠。用27克针解剖马尾附睾, 收集精子。培养他们为精子在300µL HTF 媒介为 1-2 h 在38°c。
4. 16小时后 hCG 注射, 牺牲超级排卵雌性小鼠颈椎脱位。将输卵管壶腹部转移到 HTF 培养基旁的矿物油中, 然后用30克针将卵丘细胞和卵母细胞从这个输卵管壶腹中抽出到 preincubated 受精-HTF 培养基中。
   注:一些雌性小鼠不经常显示排卵, 尽管超级排卵治疗。扩大输卵管壶腹是排卵的标志。
5. 精子后, 将约束精子的 2-3 µL 转移到受精-HTF 培养基中, 排卵卵母细胞被收集。
6. 1 h 受精后, 收集受精的受精卵, 并在100µg/毫升的透明质酸酶治疗, CZB⁹培养基10分钟。
   注:当受精完成后, 1 小时的受精后, 受精的受精卵与2和极地的身体被观察到。如果使用较少或低质量的精子, 只观察与2和极性身体的小受精卵。此外, 如果许多精子用于人工授精, 多精受精发生。适当的人工授精导致受精卵与男性和女性 pronuclei。通过使用这些标准, 有可能发现人工授精是否做得很好。
   1. 在 CZB 介质中洗涤后, 受精卵与第二极性体进行显微注射 eGFP-H2B mRNA。

4. 室和微注射吸管的制备

1. 稀释 RNA 编码 eGFP-H2B 使用无核酸酶水获得浓度为 250 ng/µL。
2. 准备 2-3 滴 PVP HTF 和 eGFP-H2B 滴 mRNA, 5-6 滴 Hepes 缓冲 CZB (H CZB) 滴在60毫米的盘子上。用矿物油盖住这些水滴。
   注: 这些准备工作可以在实验室的长凳上进行。不需要使用层流气流柜。
3. 拉硼玻璃与微拉出 (例如, P = 500, 热 = 825, 拉 = 30, 威 = 120, 时间 = 200)
4. 在打破了吸管的尖端, 弯曲的拉玻璃微注射吸管接近尖端 (−300µm 背部) 在周围的30°使用 microforge。

5. 显微注射

1. 关闭机器人台上的板式加热器, 以防止在 mRNA 注射过程中用压电法杀死受精卵。
2. 在含有 10% pvp (pvp-HTF) 的 HEPES 缓冲 HTF 中, 清洗并涂上注射针的内侧。
3. 收集受精的受精卵与2和极性身体 (图 2B) 和转移 20-25 受精卵到显微镜阶段的室附有机器人。
4. 将稀释后的 eGFP-H2B mRNA 从小贴士中填充到硼硅酸盐玻璃毛细血管中。
5. 将受精卵与持有的吸管保持在一起, 然后用压电驱动来打破透明的透明和胞浆膜。
6. 将10的 mRNA 注入受精卵的细胞质中。在10分钟内完成 mRNA 注射, 以防止在孵化器外培养受精卵所造成的损害。
   注:注入量应与2和极性体一样大 。如果注射的 mRNA 量太大, 就有可能导致游离 eGFP-H2B 分数, 这可能会影响移动分数。
7. 注射10分钟后, 至少3滴洗涤, 然后培养注射受精卵在 CZB 38 摄氏度, 直到 zFRAP 分析。

6. zFRAP 分析

1. 1 h 在 zFRAP 分析之前, 打开激光和热板连接到共焦显微镜的舞台上。将温度设置为摄氏38摄氏度。
2. 将 6-10 µL 的 HEPES 缓冲的 CZB 介质覆盖在60毫米的玻璃底盘上, 加热加热器直到合子收集。
3. 受精后 8-12 小时, 收集 5-10 eGFP-H2B-expressing 受精卵并转入 6-10 µL 预热 HEPES 缓冲 CZB 中滴。
   注意: 为避免在孵化器外培养较长时间, 每项分析使用 5-10 eGFP-H2B-expressing 受精卵。5到10受精卵可以在1小时内进行分析。
4. 根据制造商的说明设置漂白和成像条件。本案为共焦激光扫描显微镜 (材料表) 如下所示:
   1. 使用60X 油透镜 (60X 60 x/1.35 油)。
      注: 放大倍数 (高数值孔径) 的透镜显示较高的灵敏度。
   2. 设置扫描速度为4.0 µs/像素和大小为 "512" 上的 "采集设置" (补充图 1)。
   3. 增加数字变焦到 "5" (补充图 1)。
      注意: 需要更高的缩放来识别焦点漂移是否发生。
   4. 打开染料列表 (补充图 1), 然后选择 "EGFP"。将观察时间设置为1.6 秒 (间隔设置为 "自由运行" 设置) (补充图 1)
      注意: 更多的观察点可能会导致更详细的数据, 但也可能导致毒性。在 zFRAP 分析中, 1.6 的观察时间似乎足以检测出染色质松动的父母不对称性。
   5. 将图片总数设置为 12 (补充图 1)。
   6. 启动 "刺激设置" 面板, 然后单击 UseScanner 上的 "Main"。将扫描速度设置为10.0 µs/像素。单击 "串联激活", 然后将体细胞设置为 "3 帧", 激活时间为 "5 秒" (补充图 1)。
   7. 单击 "焦点 x 2" 并设置焦点, 然后 "停止"。
   8. 通过调整 "激光测量功率" (补充图 1), 分别将漂白和成像激光功率 (477 nm) 设为110和15µW。
      注: 非常强的漂白可能会造成较大的漂白面积, 这会给定量分析带来困难。对于激光功率的测量, 请使用功率计。确定激光功率以避免激光功率与时间相关的劣化效果是很重要的。
   9. 在 "刺激设置" 面板中单击 "剪辑矩形" (补充图 1)。设置感兴趣的区域 (ROI; 红色;ROI #1B) 为 40 x 40 像素 (7.6 µm²)。准备参考区域 (REF; 绿色;ROI #2) 和背景 (BG; 蓝色;roi #3) 使用 "复制 roi" 和 "粘贴 roi" (鼠标右键单击按钮)。
      注意: 像素大小可以通过 "roi 管理器" 设置, 当光标位于 roi 上时, 单击鼠标的右键即可调用它。更大的 ROIs 被认为是更好的, 因为他们可以标准化的分散 zFRAP 评分。然而, 太大的 ROI 不能用于这种分析, 因为它使得很难避免核仁前体 (NPB)。eGFP-H2B 在这个车厢被认为是无染色质和显示显着更高的机动性³。ROI 和 REF 区域应该尽可能地分开。如果这两个区域接近, 漂白也可能影响到 REF 区。
   10. 单击工具栏上的 "实时", 然后开始 "实时绘图" (补充图 1)。
       注: 现场图表示每个 ROI 内的荧光信号强度, 用于用高压调整激光功率。请注意, 如果未选择 ROI, 则在 "实时绘图" 面板上不会检测到强度。
   11. 确定 ROI 位置
       注意: 可以通过拖动到 pronuclei 中的所需位置来移动 ROI。(1) 一定要避免核仁, (2) 适合整个 ROI 的 nucleoplasm。不包含区域外的核膜 (细胞质) 在 ROI。eGFP-H2B 的定位高度限制在 nucleoplasm 中, 所以很容易发现 ROI 是否含有细胞质, 或者不是由 eGFP-H2B 的荧光。雄性 pronuclei 往往比雌性的大, 通常在2和极体附近进行定位.在使用这些标准时, 要判断男性或女性的 pronuclei。
   12. 单击 "焦点 x 2" (补充图 1), 然后将通道的高压功率计调整为 EGFP 到大约 2000 (荧光强度可在 "活图" 窗口中看到)。
5. 点击 "时间", 然后 "XY" (补充图 1) 开始 zFRAP 分析。
   注: 如果 "时间" 按钮被适当选中, "t" 将出现在 "XY" 按钮上。
   1. 点击 "完成" (补充图 1), 它出现在酶成像附近的 "XY 按钮", 然后获得酶分析的数据。
   2. 通过 "另存为" (可以使用 ctrl+ Shift + S), 将文件 "2D 视图-图像的 oib" 保存为首选的命名文件 (文件格式)。
   3. 选择 ROI、REF 和 BG, 然后在 "2D 视图图像" 窗口中单击 (可同时使用 Ctrl + A) "系列分析"。
   4. 获取行酶数据, 然后单击 "实时绘图" 窗口中的 "保存" 按钮。
      注意: 行酶量化数据保存为 csv 文件。
6. 对于没有 zFRAP 的控制, 把一些受精卵注入 mRNA 的下降, 这是接近边缘的玻璃底部菜肴, 以避免从荧光观察的效果。

7. 数据计算

1. 在使用获得的量化数据时, Excel 将 "恢复曲线" 和 "移动分数" 的图表显示在参考^3、7和一些修改 (见下文和补充 Excel 文件) 中。
2. 计算相对强度, 方法是将 BG 的值从 ROI 和 REF 中减去每个时间点的12张图片。
3. 将 ROI 的价值除以 REF 的值。因此, 可以获得12标准的相对强度分数在每个时间点。
4. 计算在照片漂白前3张图像中 ROI 的相对分数的平均值。
5. 计算回收率。在每一个时间点 (7.1.2 获得的) 图像中, 除以相对分数的平均值 (在7.1.3 获得), 将12获得的 ROI 的相对分数分到。使用这些分数绘制恢复曲线 (图 2E)。
6. 计算漂白率。
   注: 漂白率 (%) = 100-恢复率为 4次图像。
7. 使用公式计算移动分数 (MF), 如下所示^10、11、12
   MF (%) = 12回收率 (在终点)-4% 回收率/漂白率 x 100。

8. 胚胎移植

1. 交配成熟的女性在 8-12 月与输精管切除术雄性小鼠在胚胎移植前的前一天晚上让他们在同一个笼子过夜。
2. 收集 zFRAP 分析的胚胎, 并确定其发育为两细胞阶段。
3. 腹腔注射雌性小鼠 0.7-0.9 毫升 1.2% tribromoethanol 麻醉或 0.35-0.45 毫升 0.75/4/5 毫克/千克 medetomidine/咪唑仑/布托啡诺混合剂在胚胎移植之前。
   注: 麻醉量由小鼠的体重决定。Tribromoethanol: 体重 0.2 mL/10 克;medetomidine/咪达唑仑/布托啡诺混合剂: 0.1 毫升/10 克的体重。
   1. 在 coitum 后0.5 天, 将这两个细胞阶段的胚胎转移到 pseudopregnant 雌性小鼠的输卵管中, 并使用阴道插头。
   2. 胚胎移植后, 将雌性小鼠放在加热器上设置为37摄氏度, 直到它们醒来。
4. 在 18.5 dpc, 用宫颈脱位牺牲代孕母, 从 zFRAP 分析受精卵中提取的幼崽进行剖宫产。一些被恢复的幼崽被送到寄养母亲身上, 他们的体重每周都被评估。

结果

zFRAP 分析与 eGFP-H2B

适当产生的 mRNA 编码 eGFP-H2B, 这是被视为一个转移带引起的聚一条尾矿 (图 2A), 被注入到受精卵胞浆与第二极性身体在 1-3 小时后受精 (图 2B)。八至12小时人工授精后, 受精卵与 2 pronuclei 显示 eGFP-H2B 的表达, 并受到 zFRAP 分析 (图 2C)。酶分析包括?...

讨论

如本研究所揭示的, zFRAP 分析不会对足月发展造成严重损害, 这表明该方法是揭示分子事件与胚胎发育潜能之间关联的非常有用的工具。在重新编程过程中, 进入 ES 细胞的双细胞状状态, 这些细胞的差异电位与两细胞阶段胚胎的高度一样高, 染色质松动改变为与两细胞级胚胎⁵的可比性。因此, 有可能胚染色质松动对胚胎发育潜力很重要。体细胞细胞核转移到卵母细胞的细胞质显示, ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16