الجينات مراسل fluorescence النويدات المشعة التصوير لتتبع تطور الورم في نماذج القوارض الورم

Summary

يمكننا وصف بروتوكول لتتبع الإكلينيكية في فيفو من سرطان خبيث. أنه يستند إلى مراسل النويدات مشعة-الأسفار الجمع بين سيمبورتير يوديد الصوديوم، الكشف عنها بواسطة غير الغازية [¹⁸و] رباعي فلوروبورات-الحيوانات الأليفة، وبروتين فلوري لتبسيط السابقين فيفو تأكيد. الأسلوب الواجب التطبيق السريري في فيفو خلية تتبع وراء ورم علم الأحياء.

Abstract

ورم خبيث المسؤولة عن معظم وفيات السرطان. وعلى الرغم من البحث المكثف، آليا إلى فهم العمليات المعقدة التي تحكم ورم خبيث لم تكتمل بعد. في فيفو نماذج لها أهمية قصوى لورم خبيث للبحث، ولكن تحتاج إلى صقل. تتبع خبيث عفوية غير الغازية في فيفو التصوير من الممكن الآن، ولكن لا تزال صعبة إذ أنها تقتضي المراقبة منذ فترة طويلة وحساسية عالية. ونحن تصف طولية مجتمعة النويدات المشعة والأسفار جسم كله في فيفو التصوير النهج لتعقب تقدم وتطور ورم خبيث عفوية. وتستخدم هذه المنهجية الجينات مراسل سيمبورتير يوديد الصوديوم (NIS) تنصهر فيها بروتين فلوري (FP). الخلايا السرطانية صممت لصريح ستابلي شيكل-FP متبوعاً بالتحديد استناداً إلى فرز fluorescence تنشيط الخلية. أن يتم إنشاء المقابلة الورم نماذج في الفئران. شيكل إسرائيلي جديد-FP الخلايا السرطانية إذ تعرب عن تعقب غير إينفاسيفيلي في فيفو على مستوى كامل الجسم بالتصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) الدول المستقلة حديثا باستخدام radiotracer [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–. الحيوانات الأليفة حاليا الأكثر حساسية في فيفو التصوير التكنولوجيا المتاحة في هذا الجدول ويمكن تقدير موثوق بها والمطلق. الأساليب الحالية تعتمد على أفواج كبيرة من الحيوانات التي هي euthanized لتقييم ورم خبيث عند نقاط زمنية مختلفة، أو الاعتماد على تصوير ثنائي الأبعاد بالكاد قابلة للقياس الكمي. مزايا الطريقة الموصوفة: (ط) عالية الحساسية غير الغازية في فيفو تصوير الحيوانات الأليفة 3D والتقدير الكمي، (ثانيا) الحيوانات الأليفة الراسم الإنتاج الآلي، (ثالثا) انخفاض كبير في إعداد الحيوانات المطلوبة بسبب تكرار خيارات التصوير، (رابعا). الحصول على البيانات المزدوجة من الدورات اللاحقة التصوير توفير بيانات إحصائية أفضل، و (v) خيار جوهري السابقين فيفو تأكيدا للخلايا السرطانية في الأنسجة بالأسفار مجهرية أو الخلوي. في هذا البروتوكول، يصف لنا جميع الخطوات المطلوبة من أجل الروتينية شيكل-FP-أتاحت غير الغازية في فيفو سرطان الخلية تتبع استخدام تأكيد PET/CT و السابقين فيفو فيفو في النتائج. هذا البروتوكول له تطبيقات تتجاوز أبحاث السرطان كلما كان في فيفو التعريب والتوسع ورصد منذ فترة طويلة لمحتوى الخلية من الفائدة.

Introduction

المرض المنتشر هو سبب معظم الوفيات الناجمة عن السرطان ¹. وعلى الرغم من بحوث مستفيضة في عمليات المنتشر، رصد موثوق بها من سرطان خبيث في نظم نموذجية الحيوان من الصعب تحقيق. وقد مكنت التطورات الحديثة في تقنيات التصوير الجسم كله والنهج التصوير المتعدد الوسائط غير الغازية في فيفو خلية تتبع^2،3،،من⁴⁵. ويمكن استخدام هذا الأخير كأداة رصد وجود وتوزيع، والكمية، والجدوى من الخلايا، غير إينفاسيفيلي ومرارا وتكرارا الحيوانات حية أو من حقوق إنسان.

وغرض الأسلوب الموصوفة هنا طوليا وغير إينفاسيفيلي تتبع الخلايا السرطانية في 3D في نماذج الورم القوارض الحية. باستخدام هذا الأسلوب، سوف تكون قادرة على دقة قياس تطور الورم بما في ذلك انتشار المنتشر في 3D الباحثين. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية غير المستندة إلى التصوير، يقدم هذا الأسلوب الحصول على البيانات الكمية مع إلى حد كبير انخفاض إعداد الحيوانات. ميزة أخرى لهذا الأسلوب أنه يتيح الارتباط في فيفو التصوير مع تحليل مبسط المصب السابقين فيفو المتعقبة خلايا الأنسجة المقطوع بالانسجة أو الخلوي^3،6.

وكان الأساس المنطقي لتطوير هذا الأسلوب لتوفير أداة في فيفو للرصد والقياس الكمي لعملية كاملة المنتشر في نماذج القوارض الورم. الأهم من ذلك، وقد صممت للحد من استخدام الحيوانات في الوقت نفسه الحد من تقلب بين الحيوانات. تصوير كامل الجسم غير الغازية الطولي ممتاز مناسبة لإطلاع على ثمرة المنتشر، لهي في حد ذاتها من الصعب التنبؤ بدقة بوقت ومكان حدوثه. ولذلك تم تصوير كامل الجسم ثلاثي الأبعاد في مركز تنمية الأسلوب. حجم الفجوة بين الجسم كله في فيفو تصوير وإمكانات كان المصب السابقين فيفو تأكيد النسيجي، مقياس متعدد النهج التصوير استناداً إلى مراسل النويدات مشعة ذات الوضع المزدوج-الأسفار المعتمدة^{3، 6}.

التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) هي الأكثر حساسية 3D كامل الجسم التصوير التكنولوجيا المتاحة حاليا تقدم ممتاز عمق الاختراق و الكمي المطلق⁷ مع قرار من < 1 مم^8،9. حاليا، يمكن موثوق الإكلينيكية خلية تتبع على مستوى كامل الجسم من النويدات المشعة التصوير الكشف عن الخلايا في كثافة الخلايا ~ 1,000 كل حجم من 1 مليون الخلايا^3،6 مع القرارات في المنطقة الفرعية ملليمتر. خلافا مجهرية إينترافيتال، فإنه لا يمكن الكشف عن الخلايا السرطانية نشر واحدة، بل أنها لا تتطلب الإجراءات الجراحية (مثل الدوائر النافذة)، ولا يقتصر مجال رؤية صغيرة، وليس باختراق الأنسجة منخفضة ومبعثر. التصوير الإضاءة الحيوية يوفر بديل غير مكلفة، لكن المقترنة مبعثر والمسائل امتصاص الضوء، فضلا عن ضعف عمق الاختراق، وبالتالي محدودة بشدة في تحديد مقدار². تصوير كامل الجسم الأسفار وقد استخدمت للحصول على صور ثلاثية الأبعاد، إلا أنها حساسة أقل بكثير مقارنة ب تكنولوجيات الإضاءة الحيوية أو النويدات المشعة². ومع ذلك، الأسفار يتيح الفرصة لإجراء تحليل السابقين فيفو المصب النسيج الخلوي أو الفحص المجهري. هذا الأخير يغلق المقياس-الفجوة بين تصوير كامل الجسم العيانية (القرار مم) والأسفار الأنسجة المجهرية التحليل (القرار ميكرومتر)³. ولذلك، طرائق النويدات المشعة والأسفار يكمل كل منهما الآخر، بدءاً من مستوى الجسم كله إلى النطاق الخلوية (sub-).

تصوير الجينات مراسل يعتبر مثاليا لفترات طويلة خلية تتبع كما هو مطلوب في أبحاث ورم خبيث. في هذا التطبيق متفوقة على وسم الخلية مباشرة كما هو (ط) لا تتأثر بتمييع التسمية وهكذا لا تقتصر في تتبع الوقت، وتعكس أرقام الخلية الحية (ثانيا) أفضل. ونتيجة لذلك، كامل الجسم خلية تتبع مفيد بشكل خاص للتطبيقات التي يمكن تتبعها الخلايا تتكاثر أو توسيع في فيفو، على سبيل المثال في سرطان البحثية^3،6، للكشف عن تشكيل تيراتوما في الجذعية خلية البحث، أو للتحديد الكمي لجهاز المناعة الخليوي توسع⁵.

مختلف النويدات المشعة على مراسل الجينات هي المتاحة². وتشمل هذه الإنزيمات مثل كيناز thymidine HSV11 فيروس الحلأ البسيط (HSV1-المعارف التقليدية)، وشركات النقل مثل سيمبورتير يوديد الصوديوم (NIS) أو إفراز الناقل (صافي)، وكذلك مستقبلات الخلية السطحية مثل الدوبامين (مستقبلات D2 D2R). شيكل إسرائيلي جديد هو بروتين عبر غشاء الغليكوزيلاتي الذي يتوسط بنشاط امتصاص يوديد، على سبيل المثال في جرابي خلايا الغدة الدرقية للتوليف اللاحقة لهرمونات الغدة الدرقية¹⁰. هذه العملية بدافع سيمبورت نا⁺ ويعتمد على التدرج الصوديوم الخلوية، الذي تم تطويره من قبل الجمعية الوطنية⁺/K⁺-أتباسي¹¹. ونتيجة لذلك، شيكل إسرائيلي جديد يعكس بشكل أفضل المعيشة الخلية عدد من الصحفيين الآخرين كما يرتبط امتصاص يوديد/راديوتراسير نا نشطة⁺التدرج/K⁺ بدلاً من مجرد وجود الناقل. تقليديا، وقد استخدم راديويوديدي لتصوير شيكل. تتبع الخلية، وأبلغ راديوتراسيرس شيكل البديلة التي لم يتم تطويق أيضي في الغدة الدرقية لتكون متفوقة⁶. وهذا مؤخرا بوضع الحيوانات الأليفة radiotracer [¹⁸و] رباعي فلوروبورات (فرنك بلجيكي [¹⁸و]₄^–)^،من¹²¹³ يظهر الدوائية متفوقة بالمقارنة مع راديويوديدي⁶ بينما يجري متاح في أنشطة محددة ارتفاع¹⁴ دون الحاجة إلى مرافق مجمع الكيمياء الإشعاعية. [¹⁸و] يمكن توليفها فرنك بلجيكي₄^– عبر طريقتين مختلفتين. وتستند الطريقة الأولى تبادل النظائر غير مشعة ¹⁹و في فرنك بلجيكي₄^– مع المشعة ¹⁸و¹². الطريقة الثانية عن طريق إضافة ¹⁸و البورون غير مشعة فلوريد ثلاثي¹⁴. أفادت الأنباء أن تسفر عن أنشطة محددة ارتفاع¹⁴ الأسلوب الأخير وهو الأسلوب المفضل للتصوير السريري.

وأعرب عن شيكل هو الغاية في أنسجة الغدة الدرقية. فهو وارد أيضا في الغدد الثديية اللعابية ولاتشريمال والمرضعات، فضلا عن المعدة، ولكن على مستويات أقل بالمقارنة مع الغدة الدرقية¹⁰. ولذلك، يمكن تحقيقها تصوير ممتازة التباين في مناطق أخرى من الجسم باستخدام شيكل. وأيضا كبير مثلى بين الإنسان والفئران والفأر¹⁰. وعلاوة على ذلك، لا توجد تقارير السمية عند التعبير شيكل حمل خارج الرحم في الخلايا غير ثيرويدال. الأهم من ذلك، شيكل أيضا لم يكن المقترنة مع الاستجابات المناعية المضيف، لا في البشر ولا في القوارض. وقد استخدمت شيكل كجينات مراسل لقياس المروج النشاط^15،،من¹⁶¹⁷ والجينات التعبير^{18،19،20،21،22 ،23} في عدة سياقات مختلفة. فقد استخدمت أيضا لتصوير غير الغازية للجينات العلاج ناقلات^24،25وتتبع الخلايا في القلب⁴و المكونة للدم²⁶والتهاب⁵والدراسات العصبية²⁷. في الآونة الأخيرة، شيكل كما استخدمت كجينات مراسل لتعقب سرطان خبيث في فيفو^3،6.

وباختصار، المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب على التقنيات السابقة: (ط) عالية الحساسية غير الغازية 3D في فيفو التعريب والتحديد الكمي المنتشر انتشار، (ثانيا) الإنتاج من [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– الآلي في أنشطة المولى عالية، (ثالثا) تخفيضاً كبيرا في الحيوانات المطلوبة من خلال التصوير الطولي، (رابعا) الحصول على البيانات المزدوجة من الدورات اللاحقة التصوير أدى إلى تحسين البيانات الإحصائية، مما يقلل بدوره مزيدا من استخدام الحيوانات، و (v) خيار جوهري السابقين فيفو تأكيدا للخلايا السرطانية في الأنسجة بالفحص المجهري الخلوي أو الأسفار.

Protocol

هذا البروتوكول يفي بجميع المتطلبات التي حددها فريق "المراجعة الأخلاقية" المحلية وتشريعات "المملكة المتحدة" (المملكة المتحدة). عند اتباع هذا البروتوكول، ضمان الإجراءات أيضا تلبية جميع المتطلبات التي تمليها التشريعات الوطنية وهيئة "المراجعة الأخلاقية" المحلية. تضمن كل التجربة التي تنطوي على نشاط إشعاعي متوافقة مع القوانين والقواعد المحلية والمؤداة بأمان.

1-الهندسة وتوصيف الخلايا السرطانية للتعبير عن مراسل الانصهار النويدات المشعة-الأسفار شيكل-تنظيم الأسرة

ملاحظة: لأغراض التبسيط، هو اختصار ميجفب A206K "التجارة والنقل"، ومشري ك "العروض" في الأجزاء اللاحقة من هذا البروتوكول.

1. جيل جسيمات لينتيفيرال
   1. لإنتاج جزيئات lentivirus، شارك ترانسفيكت الخلايا 293T مع البلازميدات الأربعة التالية باستخدام أسلوب تعداء مناسبة: (ط) ترميز بلازميد الجينات مراسل (بلنت سفف شيكل-التجارة والنقل أو بلنت سفف شيكل-طلب تقديم العروض (انظر المعلومات التكميلية)، (ثانيا) الجيل الثالث pMD2.G (iii) برسف-القس، التعبئة والتغليف والبلازميدات بري وبلازميد (رابعا) الفيروس المغلف الذي يتضمن، على سبيل المثال، لينتيفيرال. قبل مزيج من البلازميدات قبل إضافتها لمزيج تعداء. أداء تعداء في غطاء ثقافة خلية.
      ملاحظة: يتم توفير معلومات إضافية تعداء في "المعلومات التكميلية".
   2. تقييم نجاح تعداء بعد 48 ساعة قبل الفحص المجهري معيار واسع المجال الأسفار مع إعدادات عامل التصفية المناسب للمراسل الانصهار المختار (NIS-التجارة والنقل أو شيكل-RFP).
      ملاحظة: إشارات Fluorescence الإرشادية لمراسل الجينات تعداء، وبذا لا بديل تعداء المشارك الناجح، وليس مؤشرا لإنتاج الفيروس ناجحة.
   3. حصاد الفيروسات التي تحتوي على الجسيمات المادة طافية استخدام المحاقن وإزالة الخلايا العائمة والحطام الخلية بعملية التصفية من خلال عامل تصفية بولييثيرسولفوني عقيمة (PES) 0.45 ميكرومتر. نقل إلى أنبوب البولي بروبلين رد فعل معقم 1.5 مل. أداء عمل الفيروس في غطاء ثقافة خلية والتأكد من الفيروس لا يعيش يترك البيئة الواردة.
2. توصيل واختيار شيكل-FP وإذ تعرب عن سرطان الخلية الخطوط
   1. استخدام الفيروس جديدة نقية من الخطوة 1.1.3 مختلطة 1:1 (v/v) مع متوسط النمو الأمثل لكل خط خلية سرطان (دميم لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا و 1640 ربمي للخلايا 4T1؛ انظر "الجدول المواد" لتشكيل وسائل الإعلام). إجراء توصيل في غطاء ثقافة خلية.
      ملاحظة: بروتوكول أكثر عامة المشار إليها في "المعلومات التكميلية".
   2. ترانسدوسي الخلايا السرطانية مع المحتوية على الفيروس متوسطة في حاضنة مع الغلاف الجوي هوميديفيد التي تحتوي على 5% (v/v) CO₂ في 37 درجة مئوية ح 72 (العمل على مقياس جيدا 6 أو 12-جيدا باستخدام 1 مل أو 0.4 مل من مزيج الفيروس من الخطوة 1.2.1).
   3. مراقبة التعبير شيكل-FP الخلية الهدف بالفحص المجهري الأسفار.
   4. توسيع نطاق الخلايا ترانسدوسيد بنجاح إلى نطاق خلايا 3 مليون باستخدام شروط الثقافة القياسية (انظر ATCC لخطوط الخلايا 4T1 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231).
   5. استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتنقية الخلايا وإذ تعرب عن FP شيكل من الخلايا غير ترانسدوسيد.
      ملاحظة: نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن أن تكون مصدرا للعدوى بالميكوبلازما؛ من المستحسن للتحقق من وجود مفطورة قبل إنتاج الفيروس وتوصيل بل أيضا بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية وقبل الخطوة 1، 3.
3. توصيف شيكل-FP وإذ تعرب عن سرطان الخلية خطوط
   1. تأكيد التعبير المراسل بقياس تدفق القياسية كما هو موضح في مكان آخر من²⁸.
   2. التأكد من سلامة المراسل ب immunoblotting القياسية كما هو موضح في مكان آخر²⁹.
   3. تحليل التعريب مراسل الانصهار داخل الخلايا بالميكروسكوب الأسفار [كنفوكل].
      ملاحظة: تلطيخ مع أو التعبير المشارك غشاء البلازما علامة⁶ والتعريب المشارك اللاحقة تحليل³⁰ سيسهل هذه الخطوة.
   4. تحليل امتصاص راديوتراسير في نيس-FP خطوط الخلايا وإذ تعرب عن.
      ملاحظة: أي الركازة شيكل المشعة المتوافقة مع المعدات الموجودة غير مناسبة، مثل النظائر يوديد (¹²³أنا^-، ¹²⁴أنا^-، ¹²⁵أنا^-، ¹³¹أنا^–)، ^{م 99} TcO₄^-،^-، ¹⁸⁸تكتنفها₄[¹⁸و] حتى₃و^– أو [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–.
      1. تنقية البذور 10⁶ خلايا في لوحات 6-جيدا في المتوسطة على النمو الأمثل (انظر الجدول للمواد) قبل يوم واحد من التجربة. إعداد جميع العينات في ثلاث نسخ، وتدرج عينات التحكم: (ط) خصوصية "ضوابط"، أي شيكل-FP وإذ تعرب عن الخلايا المحتضنة مسبقاً مع الركازة شيكل تنافسية لاختبار امتصاص خصوصية؛ (ثانيا) "عناصر الخلية الأبوية"، أي خلايا لم تعرب عن FP شيكل ولكن تلقي راديوتراسير لاختبار امتصاص القاعدية في الخلايا الأبوية.
      2. في صباح اليوم التالي، يغسل خلايا مرة واحدة مع متوسط النمو خالية من المصل.
      3. احتضان خلايا خالية من المصل النمو المتوسطة بحضور 50 بيكيريل ^{99 m}TcO₄^– أو [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (1 مل الحجم الإجمالي). لعناصر التحكم في الخصوصية، قبل احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة مع منافسة الركازة ناكلو₄^– (12.5 ميكرون تركيز النهائي). الحفاظ على تركيز منافسة الركازة ثابت في كافة مراحل التجربة.
      4. جمع المادة طافية ونقل 100 ميليلتر إلى أنبوب جمع معدّة المسمى "طافية".
      5. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل المثلج مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تحتوي على Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. جمع كل حل المياه والصرف الصحي ونقل 100 ميليلتر من كل منها إلى أنبوب جمع معدّة المسمى "wash1" أو "wash2"، على التوالي.
      6. رفع الخلايا بإضافة 500 ميليلتر PBS المحتوية على التربسين 0.25% (w/v) و 0.53 ملم يدتا، وتفرخ في 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا (الاختيار بصريا باستخدام مجهر). نقل التعليق في أنبوب استعداد مجموعة المسماة "خلايا". غسل الآبار مع 500 ميليلتر المثلج برنامج تلفزيوني يتضمن Ca^{2 +}/Mg^{2 +} وإضافة إلى الأنبوب "الخلايا". بيليه الخلايا بالطرد المركزي (250 x ز, 4 دقيقة, 4 درجة مئوية).
      7. تعيين عدد جميع أنواع العينة أربعة من كل كذلك باستخدام أشعة غاما التصدي على النحو الملائم للنظائر المشعة خيار (هنا: ¹⁸و أو ^{م 99}Tc).
         ملاحظة: نظراً للعدد الكبير من عينات في هذا التحليل، ينصح باستخدام γ-عداد الآلي قادرة على تصحيح الانحلال التلقائي.
      8. تحليل البيانات بجمع التهم جاما التي تم الحصول عليها من عينات من كل بئر لتحديد عدد مجموع النشاط إشعاعي للبئر الواحد.
         ملاحظة: أن اليقوتينج في الخطوات 1.3.4.4 و 1.3.4.5 في الاعتبار بضرب الأرقام من 10 ل "طافية"، و "غسل" الكسور.
      9. التعبير عن امتصاص radiotracer الخلوية كنسبة الإقبال على النحو المشار إليه في Equ.1. حساب المتوسطات والانحرافات المعيارية من ثلاث تجارب.
         (Equ.1)
         ملاحظة: هنا، تجارب التحقق من صحة مراسل موصوفة، لكن في نهاية المطاف الوظائف الخلوية غير متعلقة بمراسل (مثل انتشار، وغزو خلايا السرطان، التعبير الجيني إلخ) الخاصة بالتطبيق والمسؤولية لكل مستخدم.

2-إنشاء نماذج ورم في فيفو

1. استخدم فقط تتميز الكامل والتحقق من صحة الخلايا لإجراء تجارب عليها في فيفو . التحقق من صف خلايا قبل الإدارة بأي أسلوب مناسب (مثل الأسفار مجهرية، التدفق الخلوي) في كل مناسبة.
2. إنشاء نموذج الورم في الفئران الإناث الصغار والكبار 5-6 أسابيع من العمر. استخدام بالب/كانكرل أو الفئران بالب/cAnN.Cg-Foxn1^نو (عارية بالب/ج) لنموذج الورم 4T1 و إيماءة. بركدك cg^{إخضاعها} Il2rg^tm1WjI/SzJ الفئران (مجموعة موردي المواد النووية) لنموذج جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-المستندة إلى الورم. حلق الحيوانات محلياً واستخدام تقنية العقيم. مباشرة حقن 50 ميليلتر من تعليق يتضمن 10⁶ شيكل-FP إذ تعرب عن سرطان خلايا/مل في لوحة الدهون الثديية بين الرابعة وفي الحلمة الخامسة³¹.
   ملاحظة: لتحسين دقة الحقن، من المستحسن إجراء الحقن تحت التخدير العام باستخدام مخدر هنالك مثل إيسوفلوراني (1-2% (v/v) في س₂).
   ملاحظة: غرس الجراحي لقطع ورم من الأورام شيكل-FP وإذ تعرب عن نهج بديل للورم نموذج إنشاء³¹.
3. تحقق من الأسفار خلايا في مواقع الحقن بعد الإدارة وفي الأيام الأولى بعد الحقن. استخدام الأسفار الشعلة وتصفية نظارات مناسبة لتنظيم الأسرة الاختيار.
4. رصد نمو الورم والتحقق من وجود أي علامات سريرية (لا سيما في نقاط زمنية لاحقة).
   ملاحظة: لاورام سطحية، أي أورثوتوبيك الثدي أورام في هذا البروتوكول، واستخدام الفرجار، والصيغة لقطر الورم يعني (مليون دينار) = ½· (ل + W) ³².

3-إنتاج [¹⁸ و] فرنك بلجيكي ₄^– باستخدام منصة توليف (جمعية الإغاثة اﻷرمنية) راديوتراسير الآلي.

ملاحظة: هنا، توليف₄^– فرنك بلجيكي الآلي [¹⁸و] استناداً إلى الأسلوب من ¹⁸و بالإضافة إلى فلوريد البورون الثلاثي هو وصف. مستخدمين منصة ARS متاح على نطاق واسع (انظر الجدول للمواد)، يمكن تحميل ملف لغة التوصيف القابلة للتوسيع (XML) المقابلة المطلوبة لتشغيل تسلسل الآلي على هذا النظام الأساسي (ملف تكميلي). ويرد شرحاً مفصلاً لتخطيط كاسيت هو مبين في الشكل 1 في (الجدول 1) فضلا عن وصف مفصل لكل خطوة في ملف XML التسلسل (الجدول 2) لدعم الترجمة إلى أي منصة مؤتمتة.

1. إعداد منهاج جمعية الإغاثة اﻷرمنية كما هو موضح في الجدول 1 والتأكد من أنها التشغيلية مع ملف XML صحيح تحميلها على الكمبيوتر التحكم. ضمان وضع منهاج جمعية الإغاثة اﻷرمنية في غطاء كيميائية مناسبة لسلامة العمل مع كميات جبق من النشاط الإشعاعي.
2. نضح أنتجت سيكلوترون [¹⁸و] و^– (عادة جبق 1.5-2 في 2-7 مل [¹⁸س] ح₂س) عن طريق مدخل الخزان (V6).
3. مصيدة النشاط الإشعاعي راتنج تبادل شاردة (مثل رباعي الأمونيوم شاردة تبادل خرطوشة; V5 ل V4)، استرداد [¹⁸س] ح₂س في قنينة منفصلة (V1).
4. الوت [¹⁸و] و^– (عكس شطف، V5 ل V4) في المفاعل (V8) مع ميليلتر 750 من 0.9% (w/v) المحلول الملحي (V2)، تليها 1.5 مل من الاسيتو الانيتريل (V16).
5. إزالة المياه بالتبخر أزيوتروبي تحت تدفق الفراغ والنيتروجين بتدفئة في 105 درجة مئوية ثم 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. خفض درجة حرارة المفاعل إلى 80 درجة مئوية.
7. إضافة 800 ميليلتر من 5-15-التاج في الاسيتو الانيتريل اللامائى (46 ملغ، 0.21 ملمول) إلى الجاف [¹⁸و] و^– من خلال الميناء المركزي للمفاعل (V8).
8. إضافة ميليلتر 850 فرنك بلجيكي₃. أويت₂ في الاسيتو الانيتريل اللامائى (0.16 mg، 1.13 µmol) للمفاعل.
9. الرد لمدة 5 دقائق بينما كان عائدا إلى درجة حرارة الغرفة.
10. تمرير الخليط رد فعل عن طريق خرطوشة أكسيد الألومنيوم (V17 ل V18) إلى اعتراض تريفلوروبوراتي.
11. العودة الخليط رد فعل لحقنه S2 وتخفف بالماء (حوالي 1.6 مل).
12. تمرير الخليط رد فعل عن طريق خرطوشة تبادل شاردة ثانية (V19 إلى V20) إلى اعتراض المنتج₄^– فرنك بلجيكي [¹⁸و].
13. أغسل المفاعل بالماء (حوالي 5.5 مل).
14. تمرير حل الناتجة عن طريق شركة ألومينا وخراطيش تبادل شاردة الثانية.
15. شطف المحاقن S2 و S3 بالماء.
16. أغسل خرطوشة تبادل شاردة الثانية مع المياه والجافة مع غاز النيتروجين.
17. الوت المنتج (V19 إلى V20) مع 1 مل من 0.9% كلوريد الصوديوم (V14) في المحاقن S3.
18. نقل المنتج (400-500 ميليلتر) عن طريق خط منفذ (V21) لقنينة جمع زجاج 1 مل.
    ملاحظة: نشاط المولى جانبا هاما من كل راديوتراسير. ومع ذلك، عزمها الروتينية ليس فقط مضيعة للوقت لكن أيضا يتطلب كميات كبيرة من تجميعي طازجة [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^-، مثل أن يصبح عاملاً مقيداً لعدد الحيوانات التي يمكن تصويرها. لاختبار إمكانية تكرار نتائج وأنشطة المولى لما نتج عنها [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–، من المستحسن لجدولة عدد قليل من تشغيل اختبار مخصصة لهذا الغرض. لمزيد من التفاصيل حول أنشطة المولى، يرجى الرجوع إلى قسم النقاش.

4-الخلايا في فيفو تصوير شيكل-FP الإعراب عن طريق نانوبيت/CT

1. إعداد الحيوانات
   1. تخدير الفئران مع isoflurane 1.5-2.0% (v/v) في س₂ بمعدل 1.0-1.5 لتر في الدقيقة في دائرة التعريفي لتدفق. للتحقق من وجود نظرة التخدير كافية لغياب رد الفعل الدواسة.
   2. ضمان تطبيق مرهم البيطرية في عيون الحيوان لمنع جفاف بينما تحت التخدير
   3. حرك الماوس على لوحة تدفئة مع الآنف في قناع توريد مخدر والحارة الذيل (مثلاً بأنها تستنزف المياه 37 درجة مئوية أو باستخدام مصباح ضوء الأشعة تحت حمراء).
   4. تمييع فرنك بلجيكي الطازجة العقيمة التي تمت تصفيتها [¹⁸و] حل₄^– مبق 5 الواحد 50 ميليلتر مع المالحة العقيمة 0.9 في المائة.
   5. استخدام حقنه متصلة إبرة حقن (قياس 29-31) ورسم 100 ميليلتر من الحل₄^– فرنك بلجيكي [¹⁸و] وقياس النشاط الإشعاعي في المحاقن وملاحظة القيمة ووقت القياس.
   6. إدارة 50 ميليلتر من الحل₄^– فرنك بلجيكي [¹⁸و] الوريد الوريد ذيل المعالجون مسبقاً.
   7. قياس النشاط الإشعاعي المتبقي في المحاقن وملاحظة القيمة ووقت القياس. الفرق بين القيم التي تم قياسها في الخطوات 4.1.7 و 4.1.5 هي حقن جرعة (ID).
   8. تعيين مؤقت العد التنازلي من 45 دقيقة (وقت البدء لتصوير الحيوانات الأليفة = 0 دقيقة).
   9. ضع الماوس على السرير للماسح الضوئي نانوبيت/الأشعة المقطعية وضمان الإمداد بمخدر إعادة المرفق بشكل صحيح.
   10. تحقق يبقى التخدير الكامل عن طريق اختبار لغياب رد الفعل دواسة.
   11. ضمان وضع الماوس على السرير بالطريقة المرجوة، مثل 'أبو الهول'-مثل الموقف.
   12. تثبيت أجهزة مراقبة الحيوان وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، مثل مجس درجة حرارة المستقيم، مجس قياس الحيوان في التنفس، أو أقطاب لتسجيل كهربية. التحقق من وظيفة مناسبة لجميع الصكوك.
       ملاحظة: للاختبارات المجراة في خصوصية مع نيس radiotracer [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–، الحيوانات يتم تصويرها كما هو موضح أعلاه، وثم استراح مستيقظا حتى قد التهاوي النشاط الإشعاعي بما فيه الكفاية اعتبار لا يعتد بها، مثلاً ح 48 1.3·10 في وقت لاحق عندما فقط^−6% المتبقية ¹⁸و النشاط الإشعاعي سيكون حاضرا في الحيوان. في الدورة اللاحقة التصوير، تدار الركيزة تنافسية أومه₄^– بجرعة 200 مغ/كغ و 30 دقيقة قبل الإدارة راديوتراسير، والتصوير يتم كما هو موضح أعلاه.
2. التصوير بواسطة نانوبيت/CT
   1. تعيين المطلوب CT تصوير المعلمات، مثل استخدام الجهد أنبوب كفب 55 نانوبيت/CT، وتعيين وقت التعرض إلى 1200 مرض التصلب العصبي المتعدد مع تصعيد درجة واحدة الزاوي وإسقاطات 180 درجة.
   2. تعيين المعلمات للحصول على الصور الحيوانات الأليفة. استخدام ثابت مسح معلمات الحيوانات الأليفة لمدة 30 دقيقة، ووضع صدفة 1:5 400-600 كيفب الطاقة النافذة.
   3. في وقت العد التنازلي = 15 دقيقة الحصول على الصور المقطعية ابدأ.
   4. في وقت العد التنازلي = 0 دقيقة ابدأ الحيوانات الأليفة الحصول على الصور.
      1. إذا كان المسلسل تصوير الحيوانات الحيوانات المطلوبة، دعونا يتعافى تماما من التخدير، أي استعادة وعيه تحت الإشراف. وفي وقت لاحق، نقلها إلى وحدة صيانة.
      2. إذا كانت هذه هي المحطة الطرفية التصوير الدورة، المضي قدما إلى القتل الرحيم الحيوانية أما جرعة مخدر، ارتفاع تركيز ثاني أكسيد الكربون، أو التفكك في الرقبة.

5-تحليل البيانات في فيفو

1. إعادة إنشاء البيانات PET/CT باستخدام خوارزمية تكرارية 3D الكاملة المستندة إلى مونتي كارلو. ضمان أن يتم بحث التصويبات التوهين والوقت الميت وتحلل النظائر المشعة. للتفاصيل، راجع إرشادات الشركة المصنعة للصك PET/CT في استخدام.
2. الصور المقطعية الاختيار والحيوانات الأليفة شارك مسجلة بشكل صحيح وحفظ البيانات في تنسيق تبادل مناسبة مثل 'التصوير الرقمي والاتصالات في الطب' (DICOM).
3. تحليل الصور
   1. تحميل ملفات DICOM أعيد بناؤها في صورة مناسبة تحليل برمجيات التي تمكن من التعرف على وترسيم المناطق الاهتمام (رويس) والحيوانات الأليفة اللاحقة إشارة الكمي في هذه رويس.
   2. الجزء رويس استخدام العتبة اليدوي أو التكيفية لتعريف رويس^33،34 باستخدام حزمة برامج مناسبة. معلومات الصورة التشريحية من المقطعية يساعد دليل دوروا التعيين، مثل أورام سطحية أو أحجام الرئة.
   3. استخدام برمجيات التحليل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة والتأكد من معايرة لجرعة إشعاعية حقن البيانات وتصحيحها التوهين والانحلال الإشعاعي.
4. رسم الرسوم البيانية عرض البيانات من هذا التقدير الكمي في فيفو . بيانات صريحة في المائة أما حقن جرعة/وحدة التخزين (%ID/mL) أو قيمة الإقبال القياسي (سيارات الدفع الرباعي)، وهو تدبير بديل النظر في النشاط الإشعاعي في الجسم كله لهذا الموضوع.
   1. حساب القيم %ID/g افتراض كثافة الأنسجة لتكون مثل الماء، أي ~ 1 غ/ل. جدير بالذكر أن هذا الافتراض يمكن أن تكون صالحة للأجهزة مع كثافات مختلفة إلى حد كبير، مثل الرئة أو العظام.
   2. حساب الدفع الرباعي المختلفة لتقدير سيارات الدفع الرباعي صحيح (على سبيل المثال. سوفمين، سوفماكس)؛ سوفماكس هو أكثر موثوقية للأجسام الصغيرة، ويستخدم بشكل متكرر أكثر من سوفمين³⁵.

6-تحليلات السابقين فيفو

إجراء تحليلات المتلقين للمعلومات المدرجة: تصوير (ط) الأسفار من الأجهزة التي تحتوي على الخلايا السرطانية الفلورسنت (الورم الرئيسي والانبثاث) أثناء تشريح الحيوان، (ثانيا) قياس توزيع الأنسجة راديوتراسير، و (ثالثا) نسيجية أو (رابعا) تقييم سيتوميتريك لأجهزة سرطانية.

1. قياس التوزيع radiotracer γ-عد (السابقين فيفو بيوديستريبوشن) و السابقين فيفو fluorescence تصوير الأنسجة السرطانية.
   1. قياس النشاط الإشعاعي للحيوان الميت كله وملاحظة القيمة والوقت.
   2. تشريح الحيوانات والحصاد الأنسجة التالية: الرئة، القلب، الدم (باستخدام الشعيرات الزجاج عيار 20 ملم)، الكبد، المعدة، الكلي، الطحال، الأمعاء الصغيرة والكبيرة، الغدة الدرقية والغدد اللعابية، قطعة من عضلة من الساق، وعظم قصبة الخلفي، و ذات الصلة وديسيكتيبلي الغدد الليمفاوية والأنسجة السرطانية.
   3. قياس النشاط الإشعاعي للذبيحة المتبقية بما في ذلك أولاً ثم باستثناء الذيل وملاحظة القيم والأوقات للقياس.
      ملاحظة: النشاط الإشعاعي في الذيل يمكن اعتبار النابعة من راديوتراسير التي تم حقن سوء، وهكذا لم تصل إلى الدورة الدموية؛ ومن ثم، لا تساهم هذه الكمية من راديوتراسير حقن الجرعة. النشاط الإشعاعي ذيل يخدم أيضا كمعلمة أثر رجعي من نوعية الحقن.
   4. تزن كل الأنسجة (استخدام أنابيب موزون مسبقاً).
   5. التقاط صور فوتوغرافية لأجهزة سرطانية في وضح النهار وتحت ضوء الأسفار.
      ملاحظة: استخدم موقف كاميرا للحفاظ على المسافة بين عدسة الكاميرا وجهاز ثابت (أو استخدام أداة تجارية مخصصة لهذا الغرض).
   6. تضمين أجهزة/أنسجة مخصصة لعلم الأنسجة المصب في أكتوبر أو تزج لهم في الفورمالين للتثبيت. يمكن أن تختلف إعداد نموذج لغيرها من تطبيقات المتلقين للمعلومات.
   7. إعداد radiotracer معايير المعايرة في المكررة، مثل بيكيريل [¹⁸و] من 0 إلى 1000 فرنك بلجيكي₄^–.
      ملاحظة: معايرة المعايير تلزم (ط) تتعلق التهم يقاس كل دقيقة لقيم النشاط الإشعاعي (في بيكيريل)، و (ثانيا) تبسيط تصحيح الاضمحلال؛ ¹⁸ يمكن استبدال و^{– –}[¹⁸و] فرنك بلجيكي₄.
   8. حساب النشاط الإشعاعي لجميع الأنسجة المقطوع باستخدام عداد γ جنبا إلى جنب مع معايير معايرة النشاط الإشعاعي من الخطوة 6.1.7. ملاحظة وقت القياس. إذا كان حساب معدلات مرتفعة للغاية (أي خارج الخطي للمعايرة القياسية أو المشار إليه بعاليه للغاية للكشف عن قتلى مرات)، إعادة عد عينات اثنين radiotracer التنصيف في وقت لاحق.
   9. تقديم البيانات أما %ID/g أو قيم الإقبال القياسي (سيارات الدفع الرباعي) (Equ.2).
      سيارات الدفع الرباعي = (Equ.2)
   10. تجاهل جميع الأنسجة المقطوع غير مطلوبة لمزيد من التحليلات المصب وفقا لقواعد إدارة النفايات المحلية.
2. تحليل الأنسجة السرطانية بالخلوي أو الأنسجة وفقا لتفضيلات المستخدم ومستوى البروتوكولات الملحقة بها (كما هو موضح في مكان آخر^3،،من⁶²⁸).

النتائج

الخطوة الأولى يتطلب الهندسة الوراثية للخلايا السرطانية للفائدة. هنا، والنتائج لتوصيل لينتيفيرال خلايا سرطان الثدي المنتشر مورين 4T1 التحريضية والبشرية خلايا MDA-ميغابايت-231 المنتشر مع lentivirus تظهر جزيئات تحمل الحمض النووي ترميز شيكل-التجارة والنقل أو شيكل-طلب تقديم العروض. توصيل كفاءات تراوح بين خطوط خلايا السرطان (الشكل 2A، العمود الأيسر). ومع ذلك، ترانسدوسيد الناتجة كل خلية سرطانية تم اختيار خطوط بنظام مراقبة الأصول الميدانية للنقاء (الشكل 2A، حق). الأسفار [كنفوكل] مجهرية (الشكل 2) أثبت التعريب الصحيح غشاء البلازما للدول المستقلة حديثا-كان كمياً FPs شيكل-FP الدالة استخدام امتصاص radiotracer الممنوحة من الدول المستقلة حديثا (الشكل 2-2E) وأظهرت دالة شيكل و خصوصية. جدير بالذكر أن لا اختلافات كبيرة بين 4T1. شيكل إسرائيلي جديد-التجارة والنقل و 4T1. تم العثور على خطوط الخلايا إذ تعرب عن الدول المستقلة حديثا-طلب تقديم العروض مع مستويات مماثلة من التعبير شيكل (الشكل 2).

أثر كامل في المختبر توصيف خط الخلية، تم إعداد نماذج الورم مع خطوط خلايا السرطان يمكن تتبعها الذي تم إنشاؤه حديثا. على سبيل مثال، 4T1. شيكل إسرائيلي جديد-بروتينات فلورية خضراء الورم النموذجي، نموذجا لسرطان الثدي التحريضية، يظهر هنا (الشكل 3). في الحيوانات الحاملة للورم طولية الجسم كله الحيوانات الأليفة التصوير ثم على علم بتطور الورم بما في ذلك انتشار المنتشر (الشكل 3B). كان ضروريا لتصوير الحيوانات الأليفة radiotracer [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– والطازجة المنتجة في الصباح من كل الحيوانات الأليفة التصوير الدورة. تم إجراء توليف من [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– باستخدام الأسلوب ARS وصف. عادة، تستخدم كمدخل ~1.6 جبق ¹⁸و^– وحصل ~ 244 BF مبق [¹⁸و]₄^– في 40.5±3.9 دقيقة (N = 17). تم تحليلها بواسطة الراديو طبقة رقيقة اللوني أو أيون اللوني المنتج وأظهرت درجة نقاء الكيمياء الإشعاعية من 94.7±1.4%. وكان العائد الكيمياء % 19.4±4.0 (تسوس تصحيح).

في اليوم 19 بعد التطعيم الورم، الورم الرئيسي وضوح استخدام الحيوانات الأليفة، ولكن العثور على لا الانبثاث. بعد عشرة أيام (يوم 29)، الفئران الحاملة للورم نفسه إعادة المصورة وحددت ورم خبيث البعيدة في مختلف المواقع في جميع الحيوانات (ورم خبيث في الرئة، ورم خبيث لمختلف الغدد الليمفاوية الاربية و/أو إبطي). المثال في الشكل 3 يبين ورم خبيث في الرئة واسعة النطاق مع العديد من العقيدات يمكن تحديدها بوضوح وقابلة للقياس في الرئة (الشكل 3B-3E). وعلاوة على ذلك، قدم الحيوان الإقليمية انتشار الورم في الجدار البريتوني فضلا عن ورم خبيث في الاربية وكلا الليمفاوية إبطي. تختلف قيم معرف % من الانبثاث الفردي في الرئة (رقم 3E) على نطاق واسع، ولكن ذلك لم وحدات التخزين المحتلة العقيدات المنتشر الكامنة. وفي المقابل، كانت القيم تطبيع حجم %ID/mL (رقم 3E) موحدة أكثر بكثير. وكان هذا مفهومة الانبثاث مختلف مراحل التنمية مماثلة (أي بين أيام 19 و 29؛ الشكل 3). على النقيض من ذلك، كانت قيمة %ID/mL طبيعية للورم الرئيسي أقل من تلك التي الانبثاث الرئة، وهو ما يتماشى مع كتلة ورم قد مزيد من الوقت لإحراز تقدم وإعادة تشكيلها بما في ذلك تدفق أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا اللحمية والخلايا المناعية) ، لا سيما في هذا النموذج من سرطان الثدي التحريضية.

تسترشد بالصور في فيفو والأسفار من الخلايا السرطانية (مرئية أثناء تشريح الحيوان تحت الضوء الفلورية)، أجهزة عميقة الجذور الصغيرة مثل الليمفاوية موثوق حصادها، وفي الوقت نفسه، بتقييم للعقيدات سرطانية (المحتوى الشكل 4A). كان يدل على وجود ورم الخلية إشارة fluorescence أثناء تشريح الحيوان، فمن المهم لضمان هذا التصنيف كان يرافقه السابقين فيفو قياسات النشاط الإشعاعي للأنسجة المقطوع. يظهر الشكل 4B القيم الإقبال القياسي (سيارات الدفع الرباعي) الحصول على أنسجة مختلفة عبر مجموعة حيوانات الثلاثة، التي قدمت مع ورم خبيث. اندوجينوسلي شيكل-الإعراب عن أجهزة مثل الغدة الدرقية والغدد اللعابية (حصاد جنبا إلى جنب) أو المعدة أظهرت أيضا استيعاب radiotracer العالية المتوقعة. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا النهج FP شيكل تحديد خلية السرطان مباشرة خلال الأنسجة (الشكل 4). أظهرت البيانات المثال الأنسجة الفلورة هذا ورم الأوعية الدموية في 4T1. نموذج الورم شيكل-التجارة والنقل. وأظهرت هذه البيانات أيضا أن المراسل شيكل-بروتينات فلورية خضراء يقيمون أساسا في الأغشية البلازمية للورم خلايا أيضا في فيفو (الشكل 4)، وبالتالي التحقق من صحة نتائج الإقبال.

رقم 1. مخطط تفاصيل إنشاء منصة توليف راديوتراسير الآلي للإنتاج [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– عن طريق الأسلوب إضافة فلوريد ثلاثي الفلور-18--إلى--البورون- يتم طباعة أسماء الكاشف على أنابيب كل منهما في المخطط. كما هو الاختصار لتبادل شاردة أمونيوم رباعي، ويشير إلى المواد المستخدمة الفصل الكروماتوغرافي المرحلة الصلبة. وتتوفر تفاصيل إضافية في الجدولين 1 و 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. نتائج توصيف نموذجي لخطوط خلايا سرطان ستابلي يعبر عن الدول المستقلة حديثا-التجارة والنقل أو شيكل-طلب تقديم العروض. (أ) أجريت خطوط الخلايا المشار إليها باستخدام لينتيفيروسيس نقل شيكل-التجارة والنقل أو شيكل-طلب تقديم العروض. يوضح العمود الأيسر السكان ترانسدوسيد (الأخضر أو الأحمر نيون) بالمقارنة مع الخلايا الأبوية كل منهما (رمادي؛ 4T1 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا، على التوالي). إظهار النسب المئوية كفاءة توصيل حسبما يقرره التدفق الخلوي. يظهر العمود الأيسر نتائج تدفق التحليلات سيتوميتريك بعد تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية للسكان مختلطة في العمود الأيسر. وتبين أن جميع خطوط الخلايا > 99 ٪ نقية لأشار إلى الخلايا معربا عن شيكل (عن طريق التدفق الخلوي). (ب) يبين الفحص المجهري الأسفار [كنفوكل] من خطوط الخلايا المنقي التعريب غشاء البلازما شيكل-التجارة والنقل أو شيكل-طلب تقديم العروض في خطوط الخلايا الخاصة بكل منها. وغ Alexa633 كعلامة غشاء البلازما. (ج، د) التحقق من الصحة الوظيفية من البروتين شيكل-FP المعرب عنها في رد حديثا إنشاء خطوط خلايا السرطان. وتم قياس الدالة شيكل استخدام radiotracer ^{99 m}TcO₄^– (50 بيكيريل الواحدة ملايين الخلايا). واستخدمت خلايا الوالدين كعناصر تحكم، فضلا عن الانصهار مراسل تعرب عن الخلايا التي كانت تعامل مع بيركلورات الركازة المشارك شيكل قبل وأثناء الفحص (التحكم بخصوصية). النتائج تبين بوضوح وظيفة FP شيكل وخصوصية في جميع خطوط الخلايا. (ه) التحقق من الصحة الوظيفية من 4T1. شيكل إسرائيلي جديد-FP خطوط الخلايا استخدام [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– راديوتراسير للدول المستقلة حديثا. وكانت جميع الشروط الأخرى مطابقة ل (ج). الأهم من ذلك، الإقبال النسبي مشابهة جداً تم الحصول على نتائج لكل خطوط الخلايا المشتقة من 4T1 مع كلا راديوتراسيرس (الشكل 2 وهاء)، وبالتالي تبرير استخدام للتبادل في المختبر التوصيف الوظيفي لكل من وإذ تعرب عن خطوط الخلايا FP شيكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. الممثل نتيجة لورم خبيث تتبع طريق [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–-PET/CT تصوير في ماوس واضعة 4T1. ورم شيكل-التجارة والنقل- (أ) 1 مليون 4T1. تم حقن الخلايا شيكل-التجارة والنقل في منصات الدهون الثديية من 5-6 أسابيع من العمر بالب/ج CanN.Cg-Foxn1^نو/Crl الفئران وأعقب نمو الورم على مر الزمن باستخدام الفرجار. سبب fluorescence بروتينات فلورية خضراء من الخلايا السرطانية، كان تقييم الهوية البصرية الخام/النمو أيضا إمكانية استخدام شعلة الأسفار والنظارات مرشح مناسب (انظر الإطار الداخلي). (ب/يسار) كان وضوح الورم الرئيسي (خط أصفر متقطع) يوم 19 وظيفة ورم التطعيم، لكن لا ورم خبيث. الصورة المعروضة إسقاط أقصى شدتها (MIP) بصورة الحيوانات الأليفة. وسجلت أيضا إشارات شيكل الذاتية (واصفات الأبيض)، أي الغدة الدرقية والغدد اللعابية (Th + سان جرمان)، المعدة (S)، وكذلك، عند مستويات منخفضة جداً، بعض أجزاء الغدد الثديية ولاتشريمال. إشارة المثانة (ب) ينبع من إفراز الراسم. (ب/يمين) في يوم 29 وظيفة ورم التطعيم، ورم خبيث قد تحدد بوضوح: الانبثاث متعددة في الرئة (الخط المنقط صفراء)، فضلا عن العقد الليمفاوية المنتشر (إيلن، أكسلن؛ رؤوس الأسهم الصفراء). الصورة المعروضة هي MIP الصورة PET/CT. الورم الرئيسي (خط أصفر متقطع) نما ليس فقط في شكل كروي عند هذه النقطة الزمنية، ولكن أيضا قد غزت داخل الجدار البريتوني. (ج) تطبيق 3D تقنية العتبة أوتسو تمكين عرض سطح ثلاثي الأبعاد في الأنسجة السرطانية؛ وهذه يتم فرضه على MIP الحيوانات الأليفة. الانبثاث الرئة مبينة في العقد الليمفاوية إبطي أبيض، المنتشر باللون الأحمر، والعقدة الليمفاوية الاربية المنتشر باللون الأصفر، والورم الرئيسي التي غزت في الجدار البريتوني في عملية "توركواز". (د) صورة ضربة متابعة ل MIP PET/CT في (ب/يمين) للإشارة إلى الانبثاث الرئة الفردية. (ه) كمياً من الصور الثلاثية الأبعاد (معرف %) امتصاص راديوتراسير في الأنسجة السرطانية وتطبيعها بأحجامها كل منهما (%ID/mL). وتتوافق مع الانبثاث الرئة فردية الترقيم في (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. من الأمثلة النموذجية على السابقين فيفو البيانات يمكن الوصول إليها من الفئران الحاملة للورم FP شيكل. (أ) أثناء الحصاد الأنسجة لتحليلات المصب، خصائص الخلايا السرطانية أعرب شيكل-FP الفلورسنت بمثابة مؤشر توجيه تشريح الحيوان. كالنماذج، الأنسجة من الحيوان في الشكل 3، يتم إظهار أي الرئة مع عدة آفات المنتشر واثنين الليمفاوية إيجابية. التصوير الصيفي كذلك تظهر الصور الفلورية. وقد اتخذت الصور الأسفار مع الكاميرا نفسها كالصور الصيفي ولكن تحت زرقاء خفيفة الإثارة (450±10 شمال البحر الأبيض المتوسط ممر الموجه مرشح) مع عامل تصفية انبعاثات خضراء (530±30 شمال البحر الأبيض المتوسط ممر الموجه مرشح) وضعت أمام عدسة الكاميرا. (ب) توزيع راديوتراسير في مختلف أجهزة الحيوانات مع 4T1 ('بيوديستريبوشن'). أورام شيكل-التجارة والنقل (N = 3؛ يوم 29 وظيفة ورم التطعيم 5 فرنك بلجيكي مبق [¹⁸و]₄^–). الإقبال القياسي تم حساب قيم (سيارات الدفع الرباعي) وقيم > 1 تشير إلى تراكم محددة من راديوتراسير في الأجهزة المعنية. تشير البيانات إلى امتصاص radiotracer محددة في الأنسجة السرطانية، أي الورم الرئيسي، العقد الليمفاوية المنتشر (كما تم تحديدها بالتصوير والتشريح تحت الفلورية الخفيفة)، والرئة (تم تشريح ككل دون فصل الانبثاث الفردي)، وكذلك الإعراب عن أجهزة اندوجينوسلي شيكل، أي الغدة الدرقية والغدد اللعابية والمعدة. (ج) الفلورة علم الأنسجة الورم الابتدائي من الماوس نفسه كما هو مبين في الشكل 3. الورم الرئيسي كان حصادها والمضمنة في أكتوبر والمجمدة قبل مقطعة (10 ميكرون) والمجهزة لتلطيخ. وحددت شيكل-التجارة والنقل وإذ تعرب عن الخلايا السرطانية مباشرة دون الحاجة إلى تلطيخ جسم. كانت ملطخة الأوعية الدموية بجسم أرنب ضد الماوس بيكم-1/CD31 (2 ميكروغرام/مل) وجسم ثانوية أرنب المضادة مترافق Cy5 ماعز. كانت الملون الأنوية مع 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 ميكروغرام/مل) والعينة التي شنت في بولي (الكحول الفينيل-خلات الفينيل) التي تحتوي على 2.5% (w/v) دابكو أنتيفادي. تم الحصول على صور [كنفوكل] استخدام مجهر [كنفوكل] مع الإعدادات المناسبة ل 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole، Cy5 والتجارة والنقل. هذه البيانات المثال تبين بوضوح أنه في 4T1. هو vascularized الورم شيكل-التجارة والنقل ولكن أيضا تلك الأوعية الدموية يختلف في مداه (انظر الحافة العلوية اليسرى مع الوسط السفلي). ويظهر أيضا أن المراسل شيكل-التجارة والنقل يقيم غالباً في أغشية البلازما ورم الخلايا في فيفو (داخلي)، وبالتالي التحقق من صحة نتائج الإقبال في المختبر . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

صمام فاستلاب المتعددة	كاشف، والمذيبات، وخرطوشه أو أنابيب *		تفاصيل
V1	أنابيب سيليكون إلى [18س] ح2س زجاجة النفايات		14 سم
V2	0.9 محلول كلوريد الصوديوم %، ميليلتر 750		قنينة 11 مم
V3	محقنة S1		1 مل
V4	انيون تبادل خرطوشة C1، قبل مكيفة مع كلوريد الصوديوم 1 م (10 مل) وح2س (10 مل)		مثل سبتمبر-باك "أكسيلل بالإضافة إلى قما بالإضافة إلى الضوء" (المياه، ولجنة مناهضة التعذيب. لا. WAT023525)
V5	أنابيب سيليكون شاردة تبادل خرطوشة C1		14 سم
V6	[18س] ح2س/18و مدخل الخزان		ماكس 5 مل
V7	أنابيب سيليكون للسفينة المفاعل (الجانب الأيسر؛ مدخل الغاز)		14 سم
V8	أنابيب سيليكون لمفاعل السفينة (ميناء المركزية؛ ومدخل/مخرج السائل)		14 سم
V9	مغلقة
V10	مغلقة
V11	محقنة S2		5 مل
V12	15-التاج-5, 46 ملغ في 800 ميليلتر ميكن		قنينة 11 مم
V13	تريفلوروبوراتي ثنائي إثيل اثيراتي، ميليلتر 0.14 في 850 ميليلتر ميكن (تمييع ميليلتر 14 فرنك بلجيكي3. OEt2 مع 1 مل ميكن. تمييع 10 ميليلتر لهذا الحل إلى 850 ميليلتر مع ميكن).		قنينة 13 مم
V14	0.9 محلول كلوريد الصوديوم %، 1 مل		قنينة 13 مم
V15	سبايك كيس المياه
V16	الاسيتو الانيتريل (ميكن)، 1.5 مل		قنينة 13 مم
V17	سيليكون أنابيب لشركة ألومينا محايدة خرطوشة C2		14 سم
V18	شركة ألومينا محايدة خرطوشة C2، قبل مكيفة مع ح2س (10 مل)، الأسيتون (10 مل) والهواء (20 مل)		مثل سبتمبر-باك "الألومينا N بالإضافة إلى الضوء" (المياه، ولجنة مناهضة التعذيب. لا. WAT023561)
V19	أنابيب سيليكون شاردة تبادل خرطوشة C3		14 سم
V20	انيون تبادل خرطوشة C3، قبل مكيفة مع كلوريد الصوديوم 1 م (10 مل) وح2س (10 مل)		مثل سبتمبر-باك "أكسل بالإضافة إلى ذلك كما بالإضافة إلى الضوء" (المياه، ولجنة مناهضة التعذيب. لا. WAT023525)
V21	أنابيب سيليكون لجمع قنينة		40 سم
V22	مغلقة
V23	مغلقة
V24	S3 حقنه		5 مل
V25	أنابيب سيليكون للسفينة المفاعل (الجانب الأيمن؛ وميناء التفريغ)		40 سم
* ملاحظة: بسبب المسامير البلاستيكية، حجم القتلى للقنينات 11 مم وقنينات 13 مم حوالي 0.35 مل و 0.4 مل، على التوالي. ولذلك، المبالغ الفعلية من الكواشف التي نقلت إلى المفاعل تكون مختلفة قليلاً. كافة الكميات المشار إليها في هذا الأسلوب يشير إلى المبالغ الفعلية التي أدخل في كل قنينة كاشف.

الجدول 1. وصف تخطيط كاسيت لتوليف₄^– فرنك بلجيكي الآلي [¹⁸و] عن طريق الأسلوب إضافة الفلور-18--إلى--البورون فلوريد ثلاثي (انظر الشكل 1).

تسلسل الخطوات	التعليق
[1-2]	ممارسة الضغط على النظام ومسح المتشعبة مع N2
[3-15]	شطف حقنه S3 مرتين مع ح2س (V15)، تدفق المتشعبة مع N2
[16-23]	ممارسة الضغط على القنينات الكاشف في مواقف V16, V14, V13 و V12، بيغ المتشعبة مع N2 بين كل قنينة
[24-26]	فتح مدخل النشاط (V6)
	الاتصال القنينة التي تحتوي على 18f. إذا كان الحجم الإجمالي > 5 مل، فقط أدخل الإبرة في منتصف الطريق في القنينة قبل المتابعة.
[27-39]	إغلاق مدخل النشاط (V6)، فخ 18و في خرطوشة كما C1 (V5)، جمع [18س] ح2س في زجاجة النفايات (V1). إذا كان الحجم الإجمالي > 5 مل، وقفه بالتسلسل في خطوة 37، أرجع إلى الخطوة 26، أدخل الإبرة بالكامل في القنينة التي تحتوي على 18و، واستئناف العملية.
[40]	إغلاق ح [18س] نفايات الزجاجة2س (V1)، ومسح المتشعبة مع N2
[41]	ممارسة الضغط على القنينة الوينت في موقف V2
[42-44]	فتح صمام مفاعل V8، نضح الوينت من V2 في محقن S1
[45-50]	الوتي قما خرطوشة C1 إلى المفاعل (V8) باستخدام المياه المالحة من المحاقن S1، وضبط درجة حرارة المفاعل إلى 90 درجة مئوية
[51]	مسح خرطوشة كما C1 مع ن2 وزيادة درجة حرارة المفاعل إلى 105 درجة مئوية
[52-53]	رسم الاسيتو الانيتريل من V16 في محقن S2
[54-57]	نقل الاسيتو الانيتريل من المحاقن S2 إلى المفاعل (V8)
[58-60]	حرارة المفاعل في 120 درجة مئوية للحد الأدنى 5 Evaporate المذيب مع تدفق ن2 للمفاعل (V7).
[61-65]	تعيين درجة حرارة 105 مئوية، حقنه جافة S1 مع N2
[66-69]	رسم الحل 15-التاج-5 من V13 في محقن S2، وزيادة درجة حرارة المفاعل إلى 120 درجة مئوية
[70-71]	خفض درجة الحرارة إلى 105 درجة مئوية، دافق المتشعبة مع N2
[72]	تبريد المفاعل (مجموعة درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق
[73-78]	ضبط درجة حرارة المفاعل إلى 80 درجة مئوية، أو نقل الحل 15-التاج-5 من المحاقن S2 للمفاعل (V8)
[79-81]	رسم BF3. حل2 OEt من V14 في محقن S2
[82-87]	تحويل فرنك بلجيكي3. حل2 OEt من المحاقن S2 للمفاعل (V8)، مسح السطر المفاعل مع N2
[88]	مسح المتشعبة مع N2
[89]	رد فعل لمدة 5 دقائق، اسمحوا حرارة العودة إلى RT
[90-95]	نقل الخليط رد فعل (V8) بحقنه S2
[96-104]	تمرير الخليط رد فعل عن طريق "ن الألومينا" خرطوشة C2، في محقن S3
[105]	مسح المتشعبة مع N2
[106-109]	العودة الخليط رد فعل لحقنه S2
[110-112]	إفراغ حقنه S3، رسم ح2س (V15) في محقن S2 تمييع الخليط رد فعل
[113-115]	تحميل الخليط رد فعل على خرطوشة كما C3
[116-118]	رسم ح2س (V15) في محقن S2
[119-124]	شطف المفاعل (V8) مع ح2س من المحاقن S2، نضح الغسالات في محقن S2
[125-128]	تمرير الغسالات خلال خراطيش C2 و C3
[129-130]	الجاف الخراطيش والمتشعبة مع N2
[131-136]	حقنه تغسل S1 مع ح2س (V15)
[137-142]	حقنه تغسل S2 مع ح2س (V15)
[143]	مسح المتشعبة مع N2
[144-147]	رسم ح2س (V15) في محقن S2
[148-151]	مسح كما خرطوشة C3 مع ح2س من المحاقن S2
[152-153]	جاف كما خرطوشة C3 مع ن2 ومسح المتشعبة مع N2
[154-157]	الوت كما خرطوشة C3 مع 0.9% كلوريد الصوديوم (V14) في محقن S3
[158-161]	نقل المنتج من المحاقن S3 إلى القنينة جمع (V21)
[162-163]	كما تدفق خرطوشة C3 مع ن2 إلى القنينة جمع (V21)
[164-166]	مسح المتشعبة مع N2
[167-170]	مسح خراطيش C2 و C3 (النفايات زجاجة) والمتشعبة مع N2
[171]	تدفق أنابيب جمع (V21) مع N2

الجدول 2. وصف الخطوات في ملف التسلسل XML.

Discussion

الخطوة الأولى لتقديم سرطان خلايا يمكن تتبعها في فيفو بهذه الطريقة يتطلب هندسة لهم بالتعبير عن مراسل الانصهار FP شيكل. اختيار بروتين فلوري في المراسل الانصهار الحرجة أوليجوميريزينج البروتينات الفلورية يمكن أن يؤدي إلى مراسل اصطناعية التكتل، مما أضر بوظيفتها. وحققنا نجاحا مع ثبت البروتينات الفلورية أحادي مثل ميجفب (مع أن الطفرة مونوميريزينج A206K^،من³⁶³⁷)، أو متاجرفب، أو مشري. شيكل إسرائيلي جديد يمكن أن يكون أما للإنسان أو الماوس الأصل (حنس أو مسنيس) استناداً إلى الغرض من التجربة ونموذج السرطان. توصيل الكفاءة عموما تختلف بين خطوط خلايا السرطان المختلفة. بيد هي تنقية خطوط خلايا السرطان التي تم إنشاؤها في وقت لاحق بنظام مراقبة الأصول الميدانية في هذا البروتوكول، مما يقلل من الحاجة إلى تحسين شروط توصيل. توصيل مع تعدد عالية للإصابة لا ينصح دائماً إدماج بناء متعددة في الجينوم من المرجح أن يؤدي أعلى بنية التعبير ليس فقط ولكن أيضا في تعديل الجينوم المنظم غير المرغوب فيها أكثر. ولذلك، من المهم السماح للخلايا ترانسدوسيد [بولكلونل] ينمو إلى استقرار تعبير (تخضع لمراقبة التدفق الخلوي) وتجنب الفرز المستنسخين ألمع فقط بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. كما يجعل وظيفية التحقق من صحة السمات غير مراسل حاسمة قبل أن تستخدم هذه الخلايا لإجراء تجارب عليها في فيفو . هو بديلاً المطورة حديثا لإيصال المورثات الفيروسية الجينات تحرير التكنولوجيا³⁸، الذي يوفر أكثر تحديداً من السيطرة على مواقع التكامل الفيروسية. من المهم تحليل التعبير بالتدفق الخلوي وإيمونوبلوتينج. التدفق الخلوي يتيح الحصول على البيانات المستندة إلى السكان خلية مفردة، مثلاً، لبحث ما إذا كانت هناك أي الانجراف في مستويات التعبير مراسل على مر الزمن. أنها تعتمد على مجموعة تنظيم الأسرة فقط، ما لم تكن الخلايا ملطخة أيضا بجسم مضاد ضد شيكل السطحية أو مجموع. لا يبلغ التدفق الخلوي بسلامة مراسل الانصهار. وفي المقابل، immunoblotting تقارير بشأن سلامة مراسل الانصهار. الوزن الجزيئي لشيكل، وتنظيم الأسرة يجب أن تضاف إلى تحديد الوزن الجزيئي المتوقعة للمختار FP. شيكل [كنفوكل] الأسفار المجهري أثبتت الانصهار مراسل كولوكاليزيشن مع أجلوتينين جرثومة القمح ماركر غشاء البلازما في جميع حديثا أدلى خطوط الخلايا. هذا الموقع الخلوية المتوقع بالنسبة للبروتين وأشار إلى مرحلة إعدادها للتحقق من صحة الفنية اللاحقة. إذا الحد الأدنى/لا شيكل-FP عثر على غشاء البلازما (مثلاً في المقصورات الداخلية الخلوية فقط)، وهذا يشير إلى مشكلة بيولوجية خلية مع مراسل الانصهار في هذا الخط خلية، أو طفرة محتملة للمراسل الانصهار التي تؤثر على ما الاتجار داخل الخلايا. جدير بالذكر أننا لاحظنا عدم مثل هذه حالة في أي من الخلايا السرطانية وقمنا باختبار حتى الآن، التي تشمل: A375P، A375M2، كورونا-Mel28، WM983A/ب (سرطان الجلد البشري)؛ MCF-7، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-436 (سرطان الثدي)؛ NCI-H1975 (سرطان الرئة البشرية)؛ كورونا-Hep1 (سرطان الكبد البشري)؛ 4T1، 4T1.2، cl 66 4، 67NR، FARN168 (سرطان الثدي التحريضية موريني)؛ B16F0، B16F3، B16F10 (مورين الميلانوما)؛ MTLn3 (فأر غدية الثدي).

يجب أن تقاس الدالة NIS استخدام فحوصات امتصاص مع ركائز شيكل المشعة. نظراً SPECT radiotracer ^{م 99}TcO₄^– التي تنتج المولدات وذلك على نطاق واسع في المستشفيات دون الحاجة إلى أي توليف radiotracer، فضلا عن وجود نصف عمر أطول أكثر ملاءمة (6.01 ح ^{لم 99} Tc بالمقارنة مع 110 دقيقة ل ¹⁸و)، استخدمنا هذه الركيزة شيكل للتحقق من الصحة الوظيفية الروتينية خطوط تعرب عن خلية جديدة FP شيكل. قبل تجميد الخلايا معربا عن الدول المستقلة حديثا مع فوق كلورات الصوديوم الركازة المشارك شيكل أسفرت عن التخفيض/إلغاء المتوقعة لامتصاص راديوتراسير، مدللة بذلك على الطابع الخاص لامتصاص راديوتراسير. هذا الاختبار خصوصية شاقل جديد خطوة حاسمة في التحقق من صحة. إذا كان لا يؤدي radiotracer انخفاض الإقبال مقارنة بخلايا الوالدين كل منهما تجربة خصوصية شيكل، حدث خطأ فني خلال التجربة، أو استيعاب radiotracer لم يكن سبب شيكل. من الممكن أيضا أن قبل حظر فوق كلورات الصوديوم يقلل من امتصاص راديوتراسير في خط خلية أبوية؛ هذا سوف تحديد خطوط الخلايا مع التعبير شيكل الفنية الذاتية (مثل الدرقية تحفز الخلايا⁶).

ميزة حاسمة لهذا البروتوكول التصوير أن يتم جمع المعلومات في 3D ومع مرور الوقت. يسمح هذا المقارنة بين الصور من الحيوان نفسه على مر الزمن، وبالتالي توفير البيانات المقترنة وهكذا التغلب على القضايا الناجمة عن تقلب بين الحيوانات. وهذا يتناقض مع أساليب التقييم المتصلة ورم خبيث-أكثر من التصوير التي تقوم على التضحية بالحيوانات المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. في الشكل 3B من الواضح كيف المنتشر انتشار وثمرة تقدما على مر الزمن في حيوان فردية. أساسا بسبب الإشارات التي تم الكشف عنها بواسطة التصوير PET/CT التعبير شيكل. وهذا يشمل جميع إشارات من خلايا السرطان معربا عن الدول المستقلة حديثا من مناشئ وكذلك جميع أجهزة اندوجينوسلي الإعراب عن الدول المستقلة حديثا. وتوجد إشارات شيكل الذاتية نموذجية في الغدة الدرقية والغدد اللعابية والمعدة، وعند مستويات منخفضة في بعض أجزاء من الغدد الثديية ولاتشريمال. بالإضافة إلى الذاتية شيكل التعبير، يفرز شيكل radiotracer [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– أيضا عن طريق الكلي، مما يفسر الإقبال راديوتراسير في أكياس مملوءة بالبول. لم يعد الإقبال الكلي يمكن كشفها عند نقطة وقت التصوير الموصى بها في هذا البروتوكول (45 دقيقة بعد راديوتراسير الحقن⁶). إذا كان ينبغي أن يؤدي إشارات من أكياس مليئة بالبول للإشارة إلى خلفية المسائل، يمكن إفراغ المثانة ميكانيكيا تحت التخدير قبل التصوير. الأهم من ذلك، يمكن أن تختلف هذه الإشارات الذاتية بين السلالات الحيوانية. الجدير بالذكر أن تعبير المؤسسات الوطنية الذاتية في الغدد الثديية يمكن أن تكون أعلى تحت ظروف المرضعات¹⁰أيضا. وفي الحالة المعروضة، وفي الحالات هذه الخطوط الخليوي المنتشر تتميز بنجاح قبل (انظر القائمة الواردة أعلاه)، فإننا لم نجد التعبير شيكل الذاتية للتدخل إلى حد كبير في الكشف عن ورم خبيث. جدير بالذكر، أن [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– ما زالت متاحة أكثر للامتصاص في الأنسجة السرطانية بالمقارنة مع يوديد، لأنه يتم استقلاب يوديد في هرمونات الغدة الدرقية⁶. هذه الظاهرة قد تسهم أيضا في كميات أكبر من راديويوديدي في مجرى الدم بالمقارنة مع [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^-6. لمختلف التطبيقات (سرطان الخلية تتبع في أمراض السرطان أو الخلايا غير السرطانية تتبع التطبيقات الأخرى)، وهذا قد تختلف، ولذلك يوصي بتقييم ما إذا كانت الذاتية شيكل التعبير من المحتمل أن يسبب مشاكل الإشارة إلى خلفية عن طريق تجارب أولية. جانبا مهما في مجال التصوير السريري هو نشاط المولى راديوتراسير. يستخدم ~1.5 و^– جبق ¹⁸كانطلاق المواد¹⁴ الأسلوب الموصوفة هنا وقد تبين أن إنتاج أنشطة المولى كثيرا أعلاه أسلوب استبدال المبلغ عنها سابقا¹². [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– المنتجة في أنشطة المولى دي وان جبق/µmol¹² يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الإقبال في الأنسجة معربا عن الدول المستقلة حديثا. وهذا له أهمية خاصة عند حقن كمية النشاط الإشعاعي للكيلوغرام الواحد ارتفاع، أي عندما تكون الحيوانات الصغيرة مثل الفئران تصويرها³⁹؛ أقل أهمية في الإنسان وضع⁴⁰. أنشطة المولى عالية ولذلك لا بد لتصوير الحيوانات الأليفة المنتجات عالية الجودة. ضرس الأنشطة التي حصل عليها البورون فلوريد ثلاثي إضافة أسلوب¹⁴، الذي يظهر في شكله الآلي في هذا البروتوكول، من التغلب على هذه المشكلة. وعلاوة على ذلك، فمن الجدير بالذكر أن البروتوكول المقدم لتوليف₄^– فرنك بلجيكي [¹⁸و] غير متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) وذلك غير صالحة للاستخدام في التجارب السريرية البشرية في هذا النموذج. بروتوكول برنامج الرصد العالمي (عبر طريقة استبدال ¹⁸و راديولابيل فرنك بلجيكي₄^–) متاح في أماكن أخرى⁴⁰.

يسمح التصوير PET/CT تصور امتصاص راديوتراسير، مما يدل على استيعاب radiotracer شيكل بوساطة النابعة من الخلايا السرطانية شيكل-FP وإذ تعرب عن. الأهم من ذلك، يمكن قياسها كمياً إشارات الحيوانات الأليفة المرتبطة بها. من الضروري أن تطبق إجراءات العتبة يمكن الاعتماد عليها لضمان تمايز متسقة وغير متحيزة من الإشارات ذات الصلة من أي خلفية محتملة. كما يختلف الخلفية في مواقع مختلفة في فيفو، من المهم النظر في العتبة المحلية والإقليمية، وتجزئة. أحد هذه الأساليب التي وضعتها وسميت أوتسو³⁴، ويعمل في تنفيذه 3D لعرض ثلاثي الأبعاد للورم الرئيسي والانبثاث في هذا البروتوكول. عموما، أن الصورة ينظر المراقب بصريا يناظر أفضل القيم كمياً % حقن جرعة (معرف %). أما بالنسبة للصورة القائمة على القياس الكمي، من المهم أيضا أن تطبيع قيم قياس النشاط الإشعاعي لانسجة مختلفة بأحجامها. هناك طريقتان تستخدم غالباً للتعبير عن نتائج طبيعية، ومعرف (ط) % كل وحدة التخزين (مثل %ID/mL)، وامتصاص (ثانيا) معيار القيمة (³⁵من سيارات الدفع الرباعي). وهي تختلف في ذلك %ID/mL يأخذ في الاعتبار حجم الفردية فقط، بينما سيارات الدفع الرباعي هو تدبير ذو صلة بالنشاط الإشعاعي المتوسط عبر الحيوان كله. من المهم أيضا أن نلاحظ أن تصوير شيكل إسرائيلي جديد يجعل حجم الورم حية (المركبة التكتيكية الخفيفة) موجوداً، لأن الخلايا الميت/الموت لا توليف ATP يمكن لم يعد استيراد راديوتراسير¹⁰. وهذا ما يفسر منطقة منخفضة--إشارة كبيرة داخل الورم الرئيسي ("على شكل دونات" ورم) تشير إلى المجالات التي من ورم الخلايا الموت/نخر. الأهم من ذلك، كانت المركبة التكتيكية الخفيفة مقياسا يعول عليه أكثر بكثير من عبء الورم بالمقارنة مع حجم الورم الخام موجوداً بقياسات قدمه ذات الورنيّة (الذي لا يأخذ بعين الاعتبار الجدوى وتقييم المناطق ورم سطحي فقط).

وميزة رئيسية لهذه الاستراتيجية المزدوجة تتبع الواضح عند الحصاد الأنسجة بعد إعدام الحيوانات. تسترشد بالصور في فيفو ومساعدة الخلايا السرطانية الفلورسنت أثناء تشريح الحيوان، يمكن أيضا أن تحصد الأجهزة الصغيرة والعميقة الجذور/الانبثاث موثوق بها. الأنسجة المجمدة تمزيقها/الحفاظ على منهجية تمكن تصوير fluorescence مباشرة للتجارة والنقل دون الحاجة لتلطيخ جسم المضادة-التجارة والنقل، ولكن على حساب الحفاظ على الأنسجة الهيكلية مخفضة بالمقارنة مع الفورمالين--ثابت جزءا لا يتجزأ من البارافين المنهجية (فب). الأخير خطيرة تتطلب أيضا تلطيخ FP المضادة، لأن الأسلوب فب غير متوافق مع الحفاظ عليها سليمة من البروتينات الفلورية (بسبب تثبيت/الجفاف/الإماهة). أن يدل على وجود ورم الخلية إشارة الأسفار، فمن المهم لضمان هذا التصنيف هو ما يؤكده السابقين فيفو قياسات النشاط الإشعاعي للأنسجة المقطوع ('بيوديستريبوشن'). السابقين فيفو قياسات النشاط الإشعاعي أكثر حساسية من الكشف البصري للأسفار، وبالتالي يمكن أن تسمح بتحديد سرطان الخلية تعتمد على إشارات بخلاف ذلك سوف تبقى غير مكتشفة. في حالة محطة التصوير الدورة، أنه أمر بالغ الأهمية أن نلاحظ دقة المبالغ radiotracer المحقون، فضلا عن أوقات radiotracer قياسات النشاط الإشعاعي، وحقن الحيوان، والحيوان إعدام، ومعايرة قياسات العداد التﻷلؤ الأنسجة المقطوع. وهذا أمر حاسم لضمان تصحيح تسوس راديوتراسير ومن ثم تمكين تحليل موثوق بها بيوديستريبوتيون.

وكرر PET/CT تصوير تمكن الكمي 3D غير الغازية لتطور الورم بما في ذلك تقييم انتشار المنتشر على مستوى كامل الجسم. هذه الميزة هي ميزة هامة على الأساليب التقليدية، التي كثيرا ما تعتمد على أفواج كبيرة من الحيوانات التي هي euthanized لتقييم تطور الورم عند نقاط زمنية مختلفة. مزايا هذا النهج القائم على التصوير: (ط) عالية الحساسية غير الغازية 3D في فيفو الكمي، (ثانيا) انخفاض كبير في إعداد الحيوانات نظراً لإمكانية تكرار التصوير، (ثالثا) الحصول على بيانات مقترن طولية من اللاحقة التصوير دورات تحسين الإحصاءات بالتباين بين الحيوانات، مما يقلل بدوره زيادة إعداد الحيوانات، باستثناء الإنتاج من [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^– الآلي (الرابع) في أنشطة محددة عالية، و (v) الخيار الجوهرية لتأكيد السابقين فيفو في الأنسجة بمنهجيات الأسفار مثل الميكروسكوب أو الخلوي.

في فيفو خلية تتبع حقل متنامية. وقد كانت تغذيها التطورات الأخيرة في تكنولوجيا، مما أسفر عن قرار المعززة وحدود الكشف والقدرة متعدد (عن طريق التصوير المتعدد الوسائط) التصوير. في هذا البروتوكول، نقوم بتطبيق هذا المفهوم لتتبع تطور الورم بما في ذلك السرطان عفوية خلية ورم خبيث في 3D بتكرار التصوير. وتشمل التطبيقات دراسات تهدف إلى كشف آليات الخلية عفوية سرطان خبيث. على سبيل المثال، يمكن الخلايا السرطانية يمكن عزوها دراسة تأثير مكونات الخلايا المناعية المختلفة (كالوقت الحاضر/الوظيفية في السلالات الحيوانية ذات المستويات المختلفة من إيمونوكومبروميسيشن) في عملية المنتشر. وبالمثل، يمكن دراسة تأثير الجينات الفردية، أما في سلالة حيوانية أو خط خلية سرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول المقدم لتقييم/التحقق من فعالية العقاقير محددة أو مفاهيم علاجية على تطور الورم. الأهم من ذلك، هذا الزوج مراسل الجينات: راديوتراسير لتصوير الحيوانات الأليفة (شيكل إسرائيلي جديد: [¹⁸و] فرنك بلجيكي₄^–) يمكن أن تستخدم أيضا لخلية مختلفة تتبع التطبيقات. على سبيل المثال، عدة خلايا العلاجات حاليا الناشئة النهج العلاجية كما تبشر بالخير. وهذا يشمل العلاجات الخلوية ل علاج السرطان⁴¹ ولكن أيضا في زرع⁴² و^43،الطب التجديدي⁴⁴ الإعدادات. الجسم كله في فيفو خلية تتبع تزداد أهمية للتنمية والترجمة السريرية للعلاجات الخلوية، على سبيل المثال، لتقييم سلامة ورصد العلاج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole	Thermo Scientific	H3570	Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line	ATCC	CRl-2539	for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter	Roche Diagnostics GmbH	5651697001	CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent	Sedna Scientific	2501036
CASYton Isotonic Diluent	Sedna Scientific	2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5	Leica, Wetzlar, Germany		Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness	VWR International	631-0150
Dabco	Sigma	290734	Stock 125 mg/mL
DMEM	Sigma	D5546	Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III	BD Biosciences		Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma	LKB Wallac Laboratory		99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution	Life Technologies	H1399	1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine	Sigma	G7513	Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells	ATCC	HTB-26	for details see ATCC website
Mowiol 4-88	Sigma	81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP	request from our lab	n/a	For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry	request from our lab	n/a	For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G	Addgene	#12259	plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE	Addgene	#12251	packaging plasmid
pRSV-Rev	Addgene	#12253	packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P43330	Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate)	Polysciences	17951	Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride	Sigma	P8833	From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge	Hettich Lab Technology
RPMI 1640	Sigma	R0883	Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm	Corning
Syringes 10 mL	BD Emerald		Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL	Life Technologies		Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma	59418C	(0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate	Life Technologies	W21404	Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper	World Precision Instruments	501601
Isoflurane 1000 mg/g	Isocare		For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin	Terumo		29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5	Sigma-Aldrich	188832	CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous)	Acros Organics	326811000
Boron trifluoride diethyl etherate	Sigma-Aldrich	216607	BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab	GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes	GE Healthcare		FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets	Macherey-Nagel	802021	RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light	Waters	WAT023525	Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light	Waters	WAT023561	Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP	GE Healthcare
Nitrogen filter	Millipore	SE2M049I05	Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g	Isocare		For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT	Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber	Vet-Tech	AN010R	With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system	Vet-Tech	AN001B	Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline	Thermo Scientific Oxoid	BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin	Terumo		29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger	Vet-Tech	AN200	VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm	Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software	Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane	Sigma	59070-1L-D	Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	85040C
Cover slips 22×50 mm	VWR International	SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT	SLEE Medical		two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson/Stratech	111-175-144	Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco	Sigma	290734	Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35	CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope	Nikon		Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma	LKB Wallac Laboratory		99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution	Life Technologies	H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound	VWR international	361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN	Dako UK Ltd		Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Rabbit anti-CD31	Abcam	ab28364	Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides	VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS)	available from various suppliers.		Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4