قناة موائع جزيئية إعادة التشكيل مع سيديوالس ديسكريتيزيد Pin

Summary

قناة موائع جزيئية مع سيديوالس تشوه يوفر التحكم بالانسياب ومعالجة الجسيمات، التخصيص البعد قناة وأخرى نقلهم بينما في الاستخدام. يصف لنا طريقة لاختلاق قناة موائع جزيئية مع سيديوالس مصنوعة من مجموعة المسامير التي يسمح بها الشكل لتغيير.

Abstract

مكونات موائع جزيئية تحتاج إلى الأشكال المختلفة لتحقيق المهام موائع جزيئية أساسية مختلفة مثل خلط والانفصال، ومحاصرة الجسيمات، أو ردود الفعل. قناة موائع جزيئية أن تبعثر حتى بعد تلفيق مع الاحتفاظ بالشكل القناة تمكن reconfigurability الزمانية المكانية العالية. هذا reconfigurability مطلوب في مثل هذه المهام موائع جزيئية الرئيسية التي يصعب تحقيق نظم موائع جزيئية "إعادة التشكيل" أو "متكاملة" الموجودة. يصف لنا طريقة لتلفيق قناة موائع جزيئية مع تشوه جدار يتألف من مجموعة محاذاة أفقياً من نهايات دبابيس مستطيلة. تحرك الدبابيس في توجهاتها طولية التغييرات نهاية المواقف الدبابيس، ومن ثم، شكل قناة ديسكريتيزيد سيديوالس. يمكن أن يسبب فجوات دبوس التسرب غير المرغوب فيها أو الالتصاق بدبابيس المتاخمة التي ألحقتها قوات غضروف. وادخلنا إلى سد الفجوات دبوس، ملء الفراغ القائم على تعليق فلوروبوليمير الهيدروكربونية مصحوبة بحاجز المرنة. هذا الجهاز موائع جزيئية إعادة التشكيل يمكن أن تولد تدفق قوي من التشرد في قناة الزمانية، أو يمكن أن يوقف التدفق في أي منطقة من القناة. هذه الميزة سيسهل، بناء على الطلب، التعامل مع الخلايا وسوائل لزجة وفقاعات الغاز وغير السوائل، حتى إذا كان وجودها أو السلوك غير معروف في وقت التصنيع.

Introduction

تقدم أجهزة موائع جزيئية-الحجم الصغير من الأجهزة التي تتحكم في كميات صغيرة من السائل وتدفقاتها-تصغير إجراءات الطبية الحيوية في شكل "شرائح" مع قابلية زيادة، وفي كثير من الأحيان، القدرة على تحمل التكاليف. كما هو موضح في مراجعة الأخيرة¹، وضعت مختلف مكونات موائع جزيئية تتكون من الأماكن والمعالم الإيجابية لتحقيق المهام فلويديك الأساسية والرئيسية مثل خلط والانفصال، ومحاصرة الجسيمات، أو ردود الفعل.

بينما يتم تحديد سلوك أجهزة موائع جزيئية عديدة في مرحلة التصميم، بعض أنواع أجهزة موائع جزيئية تسمح التغييرات تلفيق ما بعد الهيكل أو السلوك. نشير هنا إلى هذه الميزة ك "reconfigurability". Reconfigurability نظم موائع جزيئية عموما يقلل الوقت والتكلفة اللازمة لتصميم جهاز، و/أو تمكين تخصيص تخطيط موائع جزيئية أو الدالات على مر الزمن.

ووصف سابقا موائع جزيئية إعادة التشكيل الأجهزة تندرج في الفئات الثلاث التالية. في المرحلة الأولى، يسمح تشوه القنوات المرنة معدلات التدفق والاتجاهات تغييرها أثناء الاستخدام. للحصول على reconfigurability، هي مشوهاً القنوات المرنة بمختلف القوى الخارجية والسيطرة عليها مثل مصادر الضغط الهوائي²أو طريقة برايل المشغلات³ضغط ختم⁴. في الحالة الثانية، أجهزة إعادة التشكيل تعتمد على تصاميم معيارية، مثل اتصال وصلتي الدوائر فلويديك متعدد الطبقات، قنوات وحدات مع المغناطيسية، والمستندة إلى أنابيب ميكروفلويديكس⁵. في المجموعة الثالثة، الجهاز نفسه ليس من إعادة التشكيل، ولكن ميكرودروبليت النقل الكهربائي صفائف (غالباً ما يشار إلى ميكروفلويديكس الرقمية)^6،7 ومعلقة على أساس إسقاط موائع جزيئية الأجهزة⁸ تمكين بناء على الطلب التبديل من التدفق أو مسار السائل.

ومع ذلك، العديد من نقلهم هذه محدودة على الصعيدين طوبولوجي والعيانية. على سبيل المثال، العديد من الأجهزة المتكاملة موائع جزيئية وقف تدفق أو تغيير اتجاه التدفق بطي ميكروتشانيلس في مناطق محددة مسبقاً. بيد أن الموقف وعدد من المناطق تكون مطوية لا إعادة التشكيل. على الرغم من أن ميكروفلويديكس الرقمية لديها مجموعة متنوعة من السوائل التعامل مع قدراتهم، ينبغي أن تكون محدودة التدفقات المحتملة إلى حد كبير بحجم كل قطره. وبالإضافة إلى ذلك، عندما تستزرع خلايا في هذه قطرات من خلية ثقافة وسائل الإعلام، مطلوب بذل جهد إضافي لمنع التبخر وتبديد الغاز من قطرات وتفادي صدمة osmolality وتغير مفاجئ في درجة الحموضة.

لتحقيق قناة ميزة مستوى reconfigurability، اقترحنا جهاز موائع جزيئية مع سيديوالس المنقولة التي تألفت من صفائف عناصر الجهاز لإعادة تكوين بشكل حيوي لهم في حالة استخدام⁹. لتشكل جدار تشوه، كانت اصطف دبابيس صغيرة مستطيلة الشكل حيث أن كل طرف من أطرافها تعريف جزء من الجدار. انزلاق الدبابيس يسمح تشوه الجدار الذي يسمح بالنقل أو الزخرفة من الخلايا وفقاعات، والجسيمات داخل القناة. لتقليل حجم القتلى وتعظيم reconfigurability، كانت المسافة بين أطرافها المتاخمة إلى أدنى حد. ومع ذلك، عمل شعري قوية تعمل على الصغيرة الفجوات بين دبابيس الاتصال الداخل وخارج microchannel يسبب تسرب أي سائل إدخال pin الفجوة، مما تسبب في تبخر وسائل الإعلام والتلوث البكتيري أو السامة للخلايا، وفي نهاية المطاف خلية الموت. ولذلك، قمنا بتطوير نوع جدار ديسكريتيزيد خالية من تسرب موائع جزيئية إعادة التشكيل القنوات التي تحمل الإجراءات دبوس دوري و ثقافة خلية طويل الأجل¹⁰.

في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول لبناء موائع جزيئية خلية ثقافة الجهاز مع جدار ديسكريتيزيد التي يمكن أن يكون تشكيلها عقب الزيادة التدريجية في مجال الثقافة الخلية. يتم اختبار أيرتايتنيس سيديوالس قناة منفصلة باستخدام التصوير بالأسفار. خلية ثقافة التوافق وقدرة الخلية الزخرفة يتم تقييم استخدام زراعة الخلايا على شريحة.

وهذا النظام موائع جزيئية مناسبة كلما كان تصميم قناة مناسبة لا يمكن أن تكون محددة مسبقاً، ويجب تغيير في الطلب. على سبيل المثال، يمكن أن يستخدم هذا النظام لضبط معدل تدفق وعرض القناة على أساس نمو الخلايا أو الهجرة بالديدان الخيطية نشطة تدفق أو فخ أو غيرها من الأشياء الصغيرة التي تتصرف بشكل غير متوقع في القناة، أو قبول مختلف عينات الخام أو المنتجات الحيوية التي لا كان ينظر حتى الآن في وقت التصميم.

Protocol

1-النقش من الدبابيس (الشكل 2أ)

1. ديجريسى دبابيس مستطيلة بالانغماس في الأسيتون.
2. تخميل الدبابيس بتخبط في 4 مل حامض النيتريك 10%، ثم الحرارة الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في فرن.
3. Sonicate الدبابيس في المياه لمدة 5 دقائق إزالة الأحماض المتبقية والجافة مع منشفة ورقية. تزج الدبابيس في 0.5 مل من العفن الإفراج عن وكيل ل 2 h.Sonicate الدبابيس في المياه لمدة 5 دقائق.
4. افتعال طبق النقش (الشكل 2-ج).
   1. رسم أو يسجلوا خطين متوازيين مع وجود فجوة 4 مم على شريحة زجاج باستخدام مسطرة.
   2. تطبيق مادة لاصقة مقاومة للمواد الكيميائية والمنخفضة لزوجة على سطح واحد من اثنين مستطيلة قطع كوفيرجلاسيس.
   3. السندات كوفيرجلاسيس قطع اثنين على الشريحة الزجاجية في فجوة 4 مم. استخدام الخط الموازي كدليل.
5. الاستغناء عن هذين الخطين من لاصق السيليكون على الطبق النقش (انظر الشكل 2ج للموقف وحجم الخطوط الكونتورية).
   ملاحظة: قالب طباعة 3D (ملف نموذج STL يتم تضمين كمادة تكميلية) سيساعد رسم الخطوط بسهولة ودقة.
6. وضع الدبابيس على الطبق النقش حيث نصائح مم طوله 2 في غاياتها المستقيمة مغمورة في نمط الخط لاصقة. الاستغناء عن لاصقة مرة أخرى لضمان أن الدبابيس مغطاة تماما ورسم المنحنى. نقل الطبق النقش إلى تخمير هوميديفيد تسخينها إلى 38 درجة مئوية. الانتظار بين عشية وضحاها علاج مادة لاصقة.
7. إضافة 0.2 مل حامض النيتريك 0.5 M إلى 0.2 مل حمض الهيدروكلوريك م 5.0 ببطء في قنينة زجاج.
   تنبيه: الخليط، المعروف أيضا ريجيا أكوا، أكالة جداً وقابلة للانفجار. ارتداء قفازات مطاطية حمض ونظارات واقية، وتوخي الحذر الشديد عند التعامل مع الأحماض. عدم تخزين الحل. تقليل حمض النيتريك قدر الإمكان انخفاض في العدوانية.
8. وضعت الطبق النقش على هوتبلت تسخينها إلى 65 درجة مئوية. صب 0.4 مل المخلوط حمض فوق المنطقة وكشف من الدبابيس. انتظر 10 دقائق ونقل الحامض إلى كوب.
9. تحييد جميع الأحماض المتبقية بما في ذلك منطقة محفوراً في الدبابيس مع 5 مل من محلول بيكربونات الصوديوم 0.8 متر في المياه.
10. إزالة الدبابيس من الطبق النقش بسحب الدبابيس طوليا مع ملاقط. Sonicate الدبابيس في المياه لمدة 5 دقائق تليها سونيكيشن في الأسيتون لمدة 5 دقائق.
11. تخميل منطقة محفوراً في دبابيس كما في الخطوة 1.2.
12. تحقق من عرض دبابيس محفوراً مجهر متجر مع شبكاني. ضبط وقت النقش الموصوفة في 1.7 حيث يكون عرض منطقة محفوراً 0.2 ± مم 0.02.
13. نقل الدبابيس لقنينة زجاج الذي يحتوي على 5 مل إيثانول 70%. إحلال القنينة غطاء الصفحي. التقاط الدبابيس خارج القنينة والسماح لهم الجافة.

2-تصنيع لوح سيليكون مع الخزانات ومساحة دبابيس.

1. اختﻻق العفن لمساحة دبابيس وجدار ثابت بعمليات معدني نموذجية.
   1. معطف شريحة زجاجية الدسم مع 1 مل من الإيبوكسي سلبي مقاوم الضوء باستخدام المغطى تدور 1,000 لفة في الدقيقة. الجاف مقاوم الضوء على لوحة ساخن 95 درجة مئوية للحد الأدنى 15 تكرار هذه الخطوة مرة واحدة.
   2. تدور معطف الطبقة الثالثة من مقاوم نفس الضوء 2,000 لفة في الدقيقة على الشريحة الزجاجية مع مقاوم الضوء المغلفة. الجاف مقاوم الضوء على هوتبلت 95 درجة مئوية مدة 30 دقيقة.
   3. كشف الطبقة مقاوم الضوء إلى 450 مللي جول/سم² من 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية من مصدر ضوء موضعي في الأشعة فوق البنفسجية من خلال فيلم فوتوبلوتيد. خبز مقاوم الضوء المكشوفة في هوتبلت 95 درجة مئوية عن 15 دقيقة وضع مقاوم الضوء برش مادة مذيبة (اسيتات 2-ميثوكس-1-ميثيليثيل) باستخدام بخاخ من ناحية، وتسريحه مع غاز النيتروجين.
   4. مكان الشريحة الزجاجية مع مقاوم الضوء منقوشة في الجزء السفلي من صحن البلاستيك.
2. من أجل بريبوليمير من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) على العفن بسمك 3 ملم. ديبوبلي prepolymer PDMS في مجفف فراغ في الجيش الشعبي الكوري-800 لمدة 10 دقائق.
3. علاج prepolymer PDMS في فرن عند 65 درجة مئوية ل 1 h. ديمولد لوح PDMS شُفي جزئيا باستخدام مشرط. علاج كامل PDMS في فرن على 120 درجة مئوية ح 1.
4. على طول نمط المبدأ التوجيهي، تقليم حواف غير النظامية بعيداً من لوح PDMS مع مشرط نفسه. دقيقة وتنظيف قطع ممكن، لا سيما على السطح التي تعرف فتحه الإدراج (انظر الشكل 1) للمسامير.
5. انثقب 2 مم ثقوب للمدخل/المخرج في نهايات القناة الرئيسية للوح PDMS استخدام اللكمات خزعة. وبالمثل، التسلخات 1 مم-ديميتر ثقوب في نهايات قناة تنفيس الهواء. انظر الشكل 1أ لتخطيط القناة وموقف هذه الثقوب.

3. الجمعية العامة للجهاز مع تلفيق في مكان لملء الفراغ والحاجز.

1. افتعال جمعية microchannel.
   1. تزج 10 × 20 مم رقم 4 كوفيرجلاس في محلول تنظيف تسخينها إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. أشطف كوفيرجلاسيس بالمياه مرتين وجاف في 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. بلازما-بوند لوح PDMS إلى كوفيرجلاس:
      1. ضع لوح PDMS (قناة ميزة الجانب الأعلى) وتنظيف 10 × 20 مم رقم 4 كوفيرجلاس في دائرة الفراغ المغطى الرش.
      2. بدء ضخ أسفل الدائرة إلى 60 "بنسلفانيا توليد" الهواء فراغ البلازما (20 mA) لمدة 30 ثانية.
      3. فورا تنفيس الدائرة. الانحياز السندات إلى جانب ميزة قناة PDMS لوح إلى كوفيرجلاس مع الحواف.
      4. ضع الطبقات المستعبدين في فرن 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   4. جعل الطبقات المستعبدين غطاء الصفحي استخدام حاوية معقمة. تعقيم لهم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
   5. في هود الصفحي، إدراج الدبابيس في الفتحة حيث غاياتهم تشكل جدار آخر من microchannel. ينبغي أن تكون دبابيس متجاورة مختلفة في الطول لتجنب الاتصال في كلا طرفي عمودي (انظر الشكل 1ب). تباعد كبير بين نهايات الرأسي الأفضل. مساحة (ن-1) × (عرض رقم pin) ممكن عندما يتم إعداد أنواع ن دبابيس ذات أطوال مختلفة دبوس (L في الشكل 2أ).
2. اختﻻق قاعدة ( الشكل 2ب).
   1. جعل أو قراءة ملف جزء من القاعدة وجعل اثنين من الملفات التحكم العددي (NC) (تتضمن toolpaths؛ وشملت كمواد تكميلية) باستخدام برامج CAD/CAM. يستخدم ملف NC التكميلي الأول 4 مم نهاية مطحنة والثانية قطرها 1 ملم في نهاية مطحنة.
   2. المشبك لوحة واضحة من 3 مم سميكة (البولي ميثيل ميثا اكريلات) بوليميثيلميثاكريلاتي على مصنع باستخدام الحاسب الآلي.
   3. فتح ملف NC الأول على وحدة تحكم الكمبيوتر مطحنة NC (الحاسب الآلي). تثبيت مطحنة نهاية 4 مم إلى مصنع للحاسب الآلي وموقع جزء صفر بلمس مطحنة نهاية للمجلس البولي ميثيل ميثا اكريلات. تشغيل التعليمة البرمجية NC لقطع المجلس.
      ملاحظة: أحياناً ضربة تلميح نهاية مطحنة مع الهواء المضغوط لإزالة الرقائق والتبريد.
   4. كرر 3.2.3 باستخدام ملف NC الثاني وطاحونة نهاية 1 مم.
   5. ديجريسى أجزاء تشكيلة مع المنظفات والجافة مع منشفة ورقية. رش الأجزاء مع الإيثانول 70% وتقديمهم إلى غطاء الصفحي.
3. افتعال ملء الفراغ دبوس وحاجز المرنة:
   ملاحظة: الخطوات 3.3.1-3.3.7 ينبغي إجراء أسيبتيكالي في غطاء الصفحي.
   1. تحضير حشو الفجوة بخلط الفازلين الأبيض ومسحوق تترافلوروايثيلين بنسبة 2:1 بالوزن. مجانسة الخليط باستخدام الخالطون الموجات فوق الصوتية.
   2. من أجل ملء الفراغ في محقن موزع. إدراج المكبس ودفعها لملء غيض المحاقن. إرفاق إبرة ودفع المكبس مرة أخرى حتى يتم تعبئة طرف الإبرة. وبالمثل، يعد حقنه موزع بالمكبس وابرة، وملء مع لاصق سيليكون.
   3. قم بتوصيل كل حقنه موزع هوائي باستخدام أنبوب محول. ضبط الضغوط dispense لاصق السيليكون وحشو للجيش الشعبي الكوري 250 و 280 الجيش الشعبي الكوري.
   4. الاستغناء عن لاصق السيليكون إلى حافة الجيب من القاعدة. ضع × 10 20 كوفيرجلاس رقم 4 مم على الجيب واضغط عليه بشدة السندات.
   5. الاستغناء عن لاصق سيليكون بعمق حوالي 1 مم رسم القطع اثنين على طول فتحتا الخارجي للقاعدة. الاستغناء عن ملء الفراغ بعمق حوالي 1 مم، رسم الأجزاء على طول الفتحة الأخرى.
   6. الاستغناء عن لاصق السيليكون إلى حافة الجيب آخر. مكان تجمع microchannel (3.1) في الجيب واضغط عليه بشدة السندات.
   7. كرر 3.3.5 لضمان أن كلا من ملء الفراغ ولاصق سيليكون تماما تضمين الدبابيس وأنه لا يوجد أي فتح في الفتحات.
   8. وضع الجهاز في حاوية معقمة مثل مربع فولاذ المقاوم للصدأ مع الغطاء. نقل الحاوية لتخمير هوميديفيد تسخينها إلى 38 درجة مئوية. في هود الصفحي، علاج الحاجز المرنة لمدة يوم واحد.
   9. نقل كل دبوس يصل إلى 1 مم على طول دبابيس المتاخمة لإطلاق سراح الدبابيس من الحاجز المرنة علاجه.
   10. تعقيم الجهاز مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

4-تقييم الجهاز موائع جزيئية

1. الكشف عن التسرب باستخدام الأسفار
   1. فتح microchannel استخدام أداة غرامة أو روبوت سطح مكتب. جعل عرض قناة متسقة في جميع أنحاء القناة قدر الإمكان.
   2. تمييع صبغة فلورسنت أخضر مع المياه في 10 ميكرون لجعل الحل الأسفار.
   3. إضافة حل الأسفار إلى أحد موانئ نهاية microchannel مع ميكروبيبيتور. هذه الخطوة سوف تملأ القناة مع الحل.
   4. وضع الجهاز موائع جزيئية وقطعتين من ورقة ماصة الرطب مع المياه في طبق بلاستيك كبير. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ ل 24 ساعة على الأقل.
   5. تسجيل الصور الفلورية الخضراء من microchannel مع مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا مجهر.
   6. افتح الصور الفلورسنت مع برنامج تحليل صورة مناسبة، وتؤكد أن هناك لا تسرب (الفلورية الخضراء) في الواجهة لملء الفراغ والدبابيس.
2. خلايا البذور إلى microchannel.
   1. إعداد سفينة ثقافة خلية التي تحتوي على خلايا المتلاقية 70-80% (اعتماداً على أنواع الخلايا). فصل وتعليق الخلايا في المتوسطة النمو.
   2. الطرد المركزي الخلايا (السرعة والوقت يعتمد على أنواع الخلايا)، ونضح المتوسطة.
   3. ريسوسبيند الخلايا مع كمية صغيرة من المتوسطة. عد الخلايا مع عداد خلايا وضبط كثافة الخلية من 1.5 × 10⁶ إلى⁷ 1.5 × 10 خلايا/مل.
   4. فتح microchannel استخدام أداة غرامة أو روبوت سطح مكتب (الشكل 1ب) جعل قناة واسعة مستقيم 400 ميكرون. ضبط مواقف دبوس لجعل الجدار كشقة في جميع أنحاء القناة قدر الإمكان. أضف تعليق خلية واحدة من ميناء microchannel نهاية وسد القناة.
   5. حدد موقع أحد الأطراف التي تعرف الجدار المنطقة للبدء في الثقافة. تحت مجهر مقلوب إغلاق اثنين دبابيس المتاخمة لإحاطة الخلايا في خلية ثقافة المنطقة.
   6. إغلاق دبابيس كل من بالترتيب من الداخلية إلى الخارجية بطرد كافة الخلايا من القناة. بلطف نضح تعليق من المنافذ نهاية، وإضافة المتوسطة لهم.
   7. احتضان الجهاز كما هو موضح في 4.1.4. عندما تكون الخلايا حوالي 70-80% المتلاقية، فتح ببطء pin لتوسيع مجال الثقافة.

النتائج

ويرد في الشكل 1بناء microchannel إعادة التشكيل. فرضت على الركازة زجاج دبابيس مستطيلة متعددة وقد اصطف حتى أن كانت على الجانب الطويل من الدبابيس في جهة الاتصال. ورقة PDMS باللكم الثقوب واستراحة من نفس العمق كارتفاع دبوس تغطي نهايات الدبابيس تشكيل الخزانات مدخل/مخرج قناة، والحد الأقصى للقناة، وجدار آخر مقابل جدار القناة التي تألفت من الدبابيس. وتشكل منطقة محاطة بدبابيس، وجدار (أحد وجوه الورقة PDMS)، والركيزة الزجاج قناة موائع جزيئية واحدة.

كما هو موضح سابقا، reconfigurability للنظام المقترح موائع جزيئية ويتحقق بالعديد من دبابيس صغيرة وضعت بالتوازي مع فجوات صغيرة جداً لكن غير صفرية. وكانت المشكلة في التقارير السابقة تدفق قوية تولدها تأثير الشعرية من خلال الثغرات. للتغلب على هذه المشكلة، امتلأت الثغرات أولاً ملء الفراغ. في هذا البروتوكول، كخليط ديسبيرس الهيدروكربونية لزج ومسحوق فلوروبوليمير ملء الفراغ. ومع ذلك، ملء الفراغ في حد ذاته أيضا تخضع لتأثير شعري. ولذلك، كما هو مبين في الشكل 1، قد microchannel إعادة التشكيل الناتج حشو الفجوة الهيدروكربونية/فلوروبوليمير وهو حاجز المرنة التي تشكلت حول المحيط الخارجي لملء الفراغ. رقيق في منتصف الدبابيس المسبق لاستيعاب كمية كافية لملء الفراغ التأكد من سمك وقوة من الحاجز المرنة بين دبابيس اثنين.

الشكل 2 A يظهر رسم دبوس التي تشكل جزء من جدار. وقد اختيرت الصف الفولاذ المقاوم للصدأ 316 ل المادية بسبب مقاومة للتآكل وانخفاض النض خصائص. ومع ذلك، عملية تخميل إضافية كان المطلوبة لجعل الثقافة الخلية دبابيس متوافق. يجب أن يكون رقم pin تلميح مستطيل التحديد دون نتوءات لتشكيل قطعة جدار بنجاح. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون pin "مؤشر" حيث أنه يمكن بسهولة نقل رقم التعريف الشخصي عن طريق دفع المقبض. لأن كل طرف لديه منتصف ضيقة، سمك الاستومر بين دبابيس كان كافياً لمقاومة القص الناتجة عن حركة دبوس. على عكس مناطق أخرى تضم الجهاز، ينبغي أن أمر تلفيق دبابيس، باستثناء الأوسط رقيق، من شركة متخصصة في التفريغ الكهربائي (EDM) بالقطع لأنه واحد من الأساليب الأكثر دقة وفعالية من حيث التكلفة من القطع الصغيرة أجزاء مصنوعة من المعادن الصلبة. أداء رقيق الأوسط بالنقش نفسك يقلل تكلفة الآلات وخطر الانحناء أو كسر أثناء القطع.

لتأكيد أن ملء الفراغ والحاجز المرنة، وفي نهاية المطاف السد من microchannel إعادة التشكيل يعمل بشكل صحيح، استخدم كشف التسرب بالأسفار. ويبين الشكل 3 صورة الأسفار من منطقة بالقرب من حافة الحاجز المرنة 3 أيام بعد microchannel كانت مليئة بالمياه التي تحتوي على صبغ الراسم الفلورسنت. وتوضح الصورة الأسفار أن السائل ملء القناة وصلت إلى عمق حوالي 200 ميكرون من الحافة المرئية للحاجز المرنة. ولكن السائل لم تصل إلى الفجوة حشو. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ لا تسرب لملء الفراغ من خلال الحاجز المرنة. وهذه الملاحظة تشير إلى أن تناسب ضيق بين منتصف الضيقة دبابيس والحاجز المرنة منع هجرة السائل من خلال الثغرات.

وأخيراً، أجرينا طويلة الأجل خلية ثقافة مع مجال الثقافة بتصرف تدريجيا توسيع جدار الجهاز موائع جزيئية إعادة التشكيل كما هو موضح في الشكل 4أ. في د 0، اقتصرت على عدد صغير من الخلايا داخل مساحة مساوية لإحدى الخلايا عرض رقم التعريف الشخصي وغيرها كانت يستنشق. 2 (د)، الخلايا كانت تعلق على السطح السفلي وبدأت تنتشر. وقد تراجع عن دبابيس اثنين حيث أن كل الخلايا كانت واضحة للعيان، على الرغم من كونفلوينسي لا يزال منخفضا. في د 5، تتكاثر الخلايا وزيادة كونفلوينسي. في 6 و 9 د، تم سحب اثنين دبابيس أخرى للحفاظ على أونديركونفلوينت الخلايا. ويبين الشكل 4بتأثير التوسع التدريجي في مجال الثقافة. كانت هناك تغيرات مفاجئة في كثافة الخلية في اليوم الذي تم سحبه في pin(s). غير أن معدل النمو في عدد خلايا أبقى ثابتة، في حين أن ينظر في ثقافة الخلية النموذجية من الأسى.

الشكل 1 : جهاز موائع جزيئية إعادة التشكيل مع جدار واحد دبوس ديسكريتيزيد. (أ) قطع الغيار وبناء جهاز موائع جزيئية إعادة التشكيل. الجهاز يحتوي على قناة واحدة على التوالي مع جدار واحد يتكون من نهايات 10 دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ إدراج ميزات microchannel PDMS/الزجاج. ملء الفراغ وعائقا يحول دون المرنة يمنع السائل من التسرب عبر الثغرات دبوس. إصلاح كوفيرجلاسيس، وملء الفراغ، والحاجز الاستومر إلى بوليميثيلميثاكريلاتي (البولي ميثيل ميثا اكريلات) قاعدة. (ب) الآلي مناور دبوس. هو ثابت المستجيب نهاية من ورقة من المعدن إلى روبوت سطح مكتب 3-المحور. لتحريك دبوس واحد، يدفع المستجيب نهاية نهايته الرأسي. دبابيس بأطوال مختلفة توضع في فاصل زمني من ثلاث مرات عرض رقم pin. يضمن أن الفاصل الزمني في نهاية المستجيب الأصحاب طرف واحد في وقت واحد مع إزالة ما يكفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : الرسم الميكانيكية تشكيلة الأجزاء المستخدمة في البروتوكول. الوحدات بالمليمترات؛ R يدل على بعد دائرة نصف قطرها؛ يشير الرمز مربعا (□) إلى ميزات مربعا؛ t تشير إلى سمك. (أ) ل 316 فولاذ المقاوم للصدأ pin كجزء من الجدار. ويمكن أمرت دبابيس وتشكيله كما هو موضح. رقيق الأوسط دبوس لجعل الأشكال الشبيهة بعظم الكلب لا ينعكس في هذا الرسم لأن هذا أمر لا كجزء من القطع ولكن تم تنفيذها كجزء من البروتوكول. (ب) قاعدة بوليميثيلميثاكريلاتي (البولي ميثيل ميثا اكريلات) الذي يحمل كوفيرجلاسيس، وملء الفراغ وحاجز المرنة في مكان ضد حركة دبوس. (ج) طبق الحفر المستخدمة في حفر في منتصف دبابيس. بناء صحن النقش، مستعبدين أربع قطع من الزجاج باستخدام لاصق سيليكون. ويوجه نمط كفاف من لاصق السيليكون على الطبق متبوعاً بوضع الدبابيس على الطبق كما هو موضح في الرسم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : Fluorescence الكشف عن التسرب من microchannel إعادة التشكيل من خلال الثغرات دبوس. يتم تراكب الصورة الفلورية الخضراء صبغة الفلورسنت ملء microchannel إعادة التشكيل على صورة تباين مرحلة هيكل الختم، الذي يتألف من حشو الفجوة (معتم) وحاجز المرنة (شفافة). حافة الحاجز الاستومر مرئياً كميزات مثل غضروف وتتم الإشارة إليها بخط منقط العلوي؛ الواجهة بين حشو الاستومر الحاجز والفجوة تظهر كميزات مثل غضروف الاتصال منطقة سوداء وهو مبين بخط منقط أسفل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : نمو الخلايا التدريجي والمستمر مع منطقة ثقافة الخلية المتغيرة في microchannel إعادة التشكيل. (أ) كوس-7 نمو الخلايا في منطقة ثقافة خلية محصورة بتحريك سيديوالس. (ب) النمو منحنى والوقت تطور كثافة كوس-7 خلايا محصورة في مجالات الثقافة متغير الحجم في microchannel إعادة التشكيل المبين في A). الأسهم الرأسية ثلاثة تدل على التوسع في مجال الثقافة الخلية في 2 و 5 و 6 د، على التوالي. بالإضافة إلى عدد الخلايا، يتم إظهار كثافة الخلية لمجالات الثقافة نفسها، مزودة فردياً لكل منحنى النمو الأسى، وتستخدم لتقدير الوقت مضاعفة المحلية (تي_د [ح]) يظهر في الإطارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

Microchannel ديسكريتيزيد دبوس قناة موائع جزيئية مميزة، ونعتقد أنها reconfigurability عالية من الواضح في شكل قناة بالمقارنة مع أي قنوات موائع جزيئية القائمة. وسيمكن البروتوكول قدمنا هنا أجهزة موائع جزيئية قادرة على ثقافة الخلية مع التوسع تدريجيا في خلية ثقافة المساحة السطحية للحفاظ الثقافات تحت كونفلوينسي لمدة طويلة. كما سيوفر الجهاز الزخرفة في القناة من الخلايا دون الزخرفة البروتينات على الركازة مسبقاً أو أي اعتبار آخر في الوقت التصميم أو تلفيق. وبالإضافة إلى ذلك، ينشئ هذا الجهاز موائع جزيئية إعادة التشكيل بسهولة تدفق قوية في قناة التشرد، الأمر الذي من شأنه أن يساعد تنفيذ معالجة هذه المواد الصعبة إلى تدفق موائع جزيئية الموجودة قليلة جداً التي يمكن التعامل مع الأجهزة. وهذا يعني أنه يمكن تقييم التفاعل بين الخلايا والكائنات الحية الدقيقة الأخرى، والغازات والسوائل الأخرى باستخدام هذا الجهاز بدون إدخال تعديلات كبيرة في تصميم الجهاز.

وقد نظرنا تطبيق ضغط لابلاس أو الضغط الهيدروليكي لمدخل واحد للقناة كأساليب مراقبة تدفق خارجي. لا نوصي بدفع السائل في طريق مسدود لأن فإنه سيتم إنشاء تدفق نحو قناة تنفيس الهواء من خلال الفجوات بين دبابيس والسقف/الكلمة للقناة. لا تتطلب عمليات السوائل العديد من هذه العمليات دبوس. على سبيل المثال، يمكن أن يتحقق الاختلاط بجرش السائل من طرف واحد (أي، نقل دبوس واحد فقط ذهابا وإيابا عدة مرات).

أهم أجزاء الجهاز هي المسامير. الدقة في الطول، التوازي، بيربينديكولاريتي ونوعية السطح مطلوبة من أجل الدبابيس، كما يجب أن تشكل من microchannel، يجب أن تتحرك بسلاسة، ويجب أن توجه حركة دبابيس المتاخمة. ولذلك، نوصي بأنه ينبغي الأمر بالدبابيس من شركة متخصصة في الآلات الدقيقة بتقديم رسم مشابه ل الشكل 2أ. قد يكون هناك الشركات التي تتطلب أبعاد هندسية إضافية وتوجيهات صريحة خشونة السطح. ومع ذلك، الدبابيس قابلة لإعادة الاستخدام إذا كانوا من التعامل معها بحذر وأحيانا تخمل مع حمض النيتريك.

أن الحاجز المرنة ميزة حاسمة أخرى، وتشكيلها هو الخطوة الأكثر أهمية في عمليات تصنيع الجهاز. سوف يلزم قاعدة التحديد تشكيلة للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتكرار. وضع الدبابيس على الحاجز أونكوريد أيضا خطوة حاسمة. يجب أن تبقى الدبابيس الانحياز، والمضمنة في ملء الفراغ والحاجز دون فقاعات الهواء. هذه الخطوات منع التسرب من خلال المسامير، التي مشكلة مشتركة مع هذا الجهاز موائع جزيئية.

القضايا المشتركة الأخرى في استخدام هذا الجهاز هي دبابيس أ) فريكتيونالي ضبط النفس، وموت الخلية ب)، وانخفاض معدل النمو. الأسباب المحتملة لهذه في) تشمل النقش (مدبب أو متموجة) تفاوت دبوس الأوسط ورداءة نوعية كفؤ السطحية، والأبعاد محفوراً بين ارتفاع الحافة دبوس وارتفاع طبقة مقاوم الضوء على قالب لألواح السيليكون. تعديل صياغة تنميش ودرجة الحرارة، والانفعالات قد تساعد في تحسين حركة دبوس. وبالإضافة إلى ذلك، ستوفر المحاكمة المناسب دون استخدام الشمع أو مادة لاصقة تلميحات لحل المشكلة. العوامل الممكنة في ب) يتم التخميل غير كافية من الدبابيس، أخطاء في اختيار المواد اللاصقة للحواجز المرنة، وعلاج غير مكتملة المواد اللاصقة. قد تتطلب بعض الخلايا طلاء داخل microchannel مع فيبرونيكتين أو بروتينات أو البوليمرات التي تعزز التصاق الخلايا الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، ستنخفض الأمثل في ممارسة ثقافة الخلية مثل تريبسينيزيشن والطرد المركزي الخلايا الميتة في microchannel.

واحدة من القيود المفروضة على البروتوكول تلفيق قدم أن واحدة فقط من سيديوالس ديسكريتيزيد. ستعزز تحسين reconfigurability القناة إذا كانت مبنية سيديوالس على حد سواء بدبوس صفائف. على الرغم من أنه يتطلب كمية مضاعفة من دبابيس وخطوات تصنيع أطول، وهذا خياراً قابلاً للتطبيق من الناحية الفنية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oven	Yonezawa	MI-100
10% Nitric Acid	Wako Chemicals	149-06845
Stainless steel pins	Micro Giken	N/A	0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM
Mold release agent	Fluoro Technology	FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Shin-Etsu Chemicals	KE-106
Negative epoxy photoresist	Nippon Kayaku	SU-8 3050
Coverglasses (Rectangular)	Matsunami Glass	26 x 60mm No.4
Acetone	Kanto Chemicals	01060-79
Glass slides (Large)	Matsunami Glass	76 x 52mm No.1
Silicone adhesive	Shin-Etsu Chemicals	KE-41
White petrolatum	Nikko Rica	Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder	Power House Accele	Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-thick)	Various	N/A
Pneumatic dispenser	Musashi Engineering	ML-5000XII
Hydrochloric acid	Kanto Chemicals	180768-00
Computer numerical control (CNC) mill	Pro Spec Tools	PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0100
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity )	Cotronics	Duralco 4460
Borisilicate glass vials	Various		To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass.
Sodium bicarbonate	Kanto Chemicals	37116-00
Ultrasonic cleaner	AS ONE	AS12GTU
Ultrasonic drill	Shinoda Tools	SOM-121	Used as a ultrasonic homogenizer.
Spin coater	Active	ACT-220DII
Hotplate	AS ONE	ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi)	Unno Giken	N/A	Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted.
2-methoxy-1-methylethyl acetate	Wako Chemicals	130-10505
UV spot light source	Hamamatsu	L8327	Ultraviolet source
Nitrogen	Various	N/A
Vacuum desiccator and pump	AS ONE	MVD-100, GM-20S
Scalpels	Various	No.11
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm)	Kai Medical	BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glass engraving pen	Various	N/A
Cleaning solution	Tama Chemicals	TMSC	Dilute 1:100 with deionized water
Sputter coater	San-yu Electron	SC-708	For plasma bonding.
Dispenser syringe (5 ml)	Musashi Engineering	PSY-5E
Plunger	Musashi Engineering	FLP-5E
Blunt needle (21G)	Musashi Engineering	PN-21G-B
Adapter tube	Musashi Engineering	AT-5E
Fermenter	Japan Kneader	PF100
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid)	Thermo Fisher	A33077
Large plastic dish	Greiner bio-one	688161
Absorbent paper	Asahi Kasei	BEMCOT M-1
Inverted microscope	Leica	DMi8
Microscope camera	Qimaging	Retiga 2000R
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)	GE Health Care	SH30021.01
Antibiotic-antimycotic solution	Thermo Fisher	15240-062
Trypsin/EDTA solution	Thermo Fisher	25200-056
Phosphate buffered saline (PBS)	GE Health Care	SH30256.01
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S1820
Cell counter	FPI	OC-C-S02
Cell culture vessel	VIOLAMO	VTC-D100
15 ml conical tube	Corning	352095
Shop microscope	PEAK	2034-20
Hand sprayer	FURUPLA	No.3530
Coverglasses (Rectangular)	Matsunami Glass	10 x 20mm No.4
CAD/CAM software	Autodesk	Inventor HSM
Nitrogen gas pressure regulator	AS ONE	GF1-2506-RN-V	Set to 0.1 MPa