Method Article
Un canale di microfluidica con fianchi deformabili offre controllo di flusso, la gestione delle particelle, canale dimensione personalizzazione e altre riconfigurazioni mentre è in uso. Descriviamo un metodo per la realizzazione di un canale di microfluidica con fianchi costituiti da una matrice di pin che permette la loro forma da modificare.
Componenti microfluidici necessario disporre di varie forme per realizzare microfluidici chiave diverse funzioni come la miscelazione, separazione, intrappolamento delle particelle o reazioni. Un canale di microfluidica che deforma anche dopo fabbricazione pur mantenendo la forma del canale consente elevata riconfigurabilità spatiotemporal. La riconfigurabilità è necessaria in tali funzioni chiave microfluidici che sono difficili da raggiungere in sistemi microfluidici "riconfigurabili" o "integrata". Descriviamo un metodo per la realizzazione di un canale di microfluidica con una parete deformabile, costituito da una matrice allineata lateralmente delle estremità dei perni rettangolari. I perni nelle direzioni longitudinale di azionamento cambia le posizioni finali dei perni e così, la forma delle pareti laterali del canale discretizzato. Pin lacune possono causare perdite indesiderate o adesione ai pin adiacente causato dalle forze di menisco. Per colmare le lacune di pin, abbiamo introdotto degli idrocarburi-fluoropolymer basati su sospensione gap filler: accompagnati da una barriera elastomerica. Questo dispositivo microfluidico riconfigurabile può generare flusso forte temporale nel canale cilindrata, oppure può fermare il flusso in qualsiasi regione del canale. Questa caratteristica faciliterà, su richiesta, la manipolazione di cellule, liquidi viscosi, bolle di gas e non-fluidi, anche se la loro esistenza o comportamento è sconosciuto al momento della fabbricazione.
Dispositivi microfluidici - dispositivi micro-imprese che controllano le piccole quantità di liquido e flussi - offrono miniaturizzazione delle procedure biomediche in un formato di "chip" con maggiore portabilità e, spesso, convenienza. Come descritto in una recente recensione1, vari componenti microfluidici composto da spazi e caratteristiche positive sono stati sviluppati per realizzare funzioni fluidiche base e chiave quali la miscelazione, separazione, intrappolamento delle particelle o reazioni.
Mentre il comportamento di molti dispositivi microfluidici è determinato in fase di progettazione, alcuni tipi di dispositivi microfluidici consentono modifiche post-fabbricazione della loro struttura o il comportamento. Qui ci riferiamo a questa funzione come "riconfigurabilità". La riconfigurabilità dei sistemi microfluidici generalmente riduce i tempi e i costi necessari per la progettazione di un dispositivo, e/o consente la personalizzazione del layout di microfluidica o funzioni nel corso del tempo.
Precedentemente descritto riconfigurabile microfluidic dispositivi rientrano in tre categorie. Nel primo, deformazione dei canali elastomeriche permette le portate e le indicazioni per essere cambiato durante l'uso. Per ottenere la riconfigurabilità, elastomerici canali vengono deformati da varie forze esterne e controllabile come fonti di pressione pneumatica2, Braille attuatori3o compressione tenuta4. Nel secondo, riconfigurabile dispositivi si basano su disegni modulari, come il multistrato circuiti fluidici, modulari canali con magnetico interconnessioni e basati su tubazione microfluidica5. Nel terzo, il dispositivo stesso non è riconfigurabile, ma microdroplet trasporto su elettrodo matrici (spesso denominate digital microfluidica)6,7 e sospensione goccia-based microfluidic dispositivi8 attivare su richiesta commutazione del flusso o il percorso del fluido.
Tuttavia, molti di questi riconfigurazioni sono limitati a livello macroscopico e topologico. Ad esempio, molti dispositivi microfluidici integrato interrompono flusso o cambiare la direzione del flusso comprimendo microcanali in regioni predefinite. Tuttavia, la posizione e il numero delle regioni vengono compressi non sono riconfigurabili. Sebbene la microfluidica digitale ha una varietà di capacità di gestione dei fluidi, possibili flussi dovrebbero essere limitati in gran parte dal volume di ogni goccia. Inoltre, quando le cellule sono coltivate in tali goccioline di terreni di coltura cellulare, sforzo supplementare è necessaria per evitare evaporazione e dispersione di gas dalle goccioline e osmolalità shock e cambiamento di pH improvvisa.
Per realizzare la riconfigurabilità del livello di funzionalità di canale, abbiamo proposto un dispositivo microfluidico con pareti mobili che consisteva di matrici di elementi di macchine per la riconfigurazione dinamica li quando in uso9. Per formare una parete deformabile, piccoli perni rettangolari erano allineati affinché ciascuna estremità dei perni definito un segmento del fianco. I perni di scorrimento, ha permesso la deformazione del fianco che ha permesso di trasporto o campitura delle cellule, bolle e particelle all'interno del canale. Per ridurre al minimo il volume morto e massimizzare la riconfigurabilità, la distanza tra i perni adiacente doveva essere ridotto al minimo. Tuttavia, forte azione capillare agendo sulla piccola lacune tra i pin di collegamento all'interno e all'esterno il microchannel provoca perdite di liquidi entrando il divario di pin, causando evaporazione media, contaminazione batterica o citotossica e alla fine delle cellule morte. Pertanto, abbiamo sviluppato canali di reconfigurable microfluidici senza perdite discretizzato sidewall-tipo che resistere alle azioni cicliche pin e a lungo termine delle cellule cultura10.
In questo articolo, forniamo un protocollo per costruire microfluidici cella cultura dispositivo con una parete discretizzata che possa essere riconfigurata seguendo l'aumento graduale nella zona della coltura delle cellule. Ermeticità dei fianchi canale discreto è testato usando la formazione immagine di fluorescenza. La compatibilità di coltura cellulare e la capacità di patterning di cella vengono valutati mediante coltura cellulare su chip.
Questo sistema di microfluidica è adatto ogni volta che il canale appropriato design non può essere predeterminato e deve essere modificato su richiesta. Ad esempio, questo sistema potrebbe essere utilizzato per regolare la velocità di flusso e larghezza di canale basata sulla crescita delle cellule o migrazione, nematodi attivi flusso o trappola o altri piccoli oggetti che si comportano in modo imprevisto nel canale, o ad accettare vari campioni di raw o bioproducts che non sono stati ancora concepiti al momento della progettazione.
1. incisione di pin (Figura 2A)
2. fabbricazione di lastra in Silicone con serbatoi e uno spazio per i perni.
3. montaggio del dispositivo di montaggio sul posto dei Gap Filler e barriera.
4. valutazione del dispositivo microfluidico
Nella Figura 1viene illustrata la costruzione del microchannel riconfigurabile. Perni rettangolari multipli sono stati disposti su un substrato di vetro ed erano allineati in modo che il lato lungo i piedini era in contatto. Un foglio PDMS con perforato fori e un incavo della profondità stessa come l'altezza del perno coperto le estremità dei perni per formare i serbatoi di entrata/uscita canale, canale soffitto e parete laterale un altro fronte alla parete di canale che ha consistito dei perni. La regione circondata da pins, un muro (uno dei volti del foglio PDMS) e il substrato di vetro formano un canale microfluidico.
Come descritto in precedenza, la riconfigurabilità del sistema proposto microfluidica è raggiunto da molti piccoli perni posizionati in parallelo con le lacune molto piccole ma diverso da zero. Il problema nei rapporti precedenti era il forte flusso generato attraverso le lacune dall'effetto capillare. Per ovviare a questo problema, le lacune in primo luogo sono state riempite con un riempitivo. In questo protocollo, una miscela di dispersi di idrocarburi viscoso e polvere di fluoropolimero fu usata come un riempitivo. Tuttavia, il gap filler stesso è inoltre conforme all'effetto capillare. Di conseguenza, come mostrato nella Figura 1, il microchannel riconfigurabile risultante ha idrocarburi/fluoropolymer gap filler: sia una barriera elastomerica costituita intorno al perimetro esterno del gap filler. Diradamento la metà dei pin è necessario per ospitare una quantità sufficiente di riempitivo per assicurare lo spessore e la forza della barriera elastomerica tra due perni.
Figura 2 A Mostra un disegno di un perno che forma un segmento di muro laterale. Grado dell'acciaio inossidabile 316L è stato selezionato come il materiale grazie alla sua resistente alla corrosione e bassa lisciviazione proprietà. Tuttavia, un processo di passivazione supplementare è stato richiesto di rendere compatibile la coltura cellulare perni. Un perno deve avere una punta precisamente rettangolare senza bave per formare con successo un segmento di muro laterale. Inoltre, un perno deve avere una "maniglia" affinché il pin può essere spostato facilmente spingendo la maniglia. Perché ogni pin ha una sezione centrale stretto, lo spessore di elastomero tra i pin era abbastanza per resistere a taglio causato dal movimento del perno. A differenza di altre parti del dispositivo, la realizzazione di perni, ad eccezione di diradamento centrale, deve essere effettuata tramite una società specializzata in elettroerosione (EDM) perché è uno dei metodi più precisi e più redditizio di lavorazione piccola parti in metalli duri. Esecuzione di diradamento centrale da acquaforte te stesso riduce il costo di lavorazione e il rischio di piegamento o rottura durante la lavorazione.
Per confermare che il gap filler, la barriera elastomerica e alla fine la tenuta del microchannel riconfigurabile funzionare correttamente, la rilevazione di perdita di fluorescenza è stata utilizzata. La figura 3 Mostra un'immagine di fluorescenza della zona vicino al bordo della barriera elastomerica 3 giorni dopo il microchannel è stato riempito con acqua contenente colorante tracciante fluorescente. L'immagine di fluorescenza dimostra che il liquido di riempimento del canale ha raggiunto una profondità di circa 200 µm dal bordo visibile della barriera elastomerica. Tuttavia, il liquido non ha raggiunto il gap filler. Inoltre, è stata osservata nessuna perdita di gap filler: attraverso la barriera elastomerica. Questa osservazione indica che il molto stretto tra la stretta metà dei perni e barriera elastomerica ha impedito la migrazione di liquido attraverso le lacune.
Infine, abbiamo effettuato la coltura cellulare a lungo termine con la zona di coltura adattata espandendo gradualmente la parete laterale del dispositivo microfluidico riconfigurabile come mostrato in Figura 4A. A d 0, un piccolo numero di cellule sono stato confinato all'interno di uno spazio pari a una pin-larghezza e altre cellule sono state aspirate. A 2 d, le cellule sono state fissate alla superficie inferiore e iniziato a proliferare. Due perni sono stati ritratti in modo che tutte le cellule erano chiaramente visibili, anche se il confluency era ancora bassa. Alla 5D, le cellule hanno continuato a proliferare e la confluenza è aumentato. Alle 6 e 9 d, altri due perni sono stati ritratti per mantenere il underconfluent di cellule. L'effetto di graduale espansione della zona della coltura è illustrato nella Figura 4B. Ci erano cambiamenti improvvisi nella densità delle cellule il giorno che i piedini sono stati ritratti. Tuttavia, il tasso di crescita del conteggio delle cellule è stato mantenuto costante, mentre quello visto nella coltura cellulare tipico è esponenziale.
Figura 1 : Dispositivo microfluidico riconfigurabile con un perno-discretizzati sidewall. (A) parti e la costruzione di un dispositivo microfluidico riconfigurabile. Il dispositivo ha un canale rettilineo con una parete laterale formata dalle estremità dei 10 perni in acciaio inox inseriti PDMS/vetro microchannel caratteristiche. Gap filler: e una barriera elastomerica evita liquido fuoriuscita attraverso le lacune di pin. Vetrini, riempitivo e la barriera di elastomero sono fissati un polimetilmetacrilato (PMMA) base. (B) automatizzato pin manipolatore. Un effettore finale composta da un foglio di metallo è fissato un desktop robot a 3 assi. Per spostare un pin, l'effettore finale spinge la sua fine verticale. Perni con diverse lunghezze sono collocati a intervalli di tre volte la larghezza del perno. L'intervallo che assicura il fine dell'effettore compagni un pin in una sola volta con spazio sufficiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Disegno meccanico dei pezzi lavorati utilizzati nel protocollo. Unità sono espresse in millimetri; R indica una quota di raggio; il simbolo quadrato (□) indica caratteristiche quadrati; t indica lo spessore. (A) un perno in acciaio inox 316 L come una parte del fianco. Pin può essere ordinato e lavorati come descritto. Assottigliamento del mezzo perno per fare cane osso-come forme non viene riflessa in questo disegno perché questo non è stato ordinato come parte della lavorazione, ma è stato effettuato come parte del protocollo. (B) una base di polimetilmetacrilato (PMMA) che trattiene i vetrini, riempitivo e barriera elastomerica in posizione contro il movimento di perno. (C) un piatto di incisione che è usato per incidere la metà dei perni. Per costruire un piatto di acquaforte, quattro pezzi di vetro sono incollati con adesivo siliconico. Uno schema di distribuzione di adesivo siliconico viene disegnato sul piatto seguito dalla disposizione dei pin sul piatto come mostrato nel disegno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Rilevazione della fluorescenza di perdita da un microchannel riconfigurabile attraverso le lacune pin. Immagine di fluorescenza del colorante fluorescente verde il microchannel riconfigurabile di riempimento è sovrapposta su un'immagine di contrasto di fase della struttura sigillo, che è costituito da un riempitivo (opaco) e barriera elastomerica (traslucida). Un bordo della barriera elastomero è visibile come menisco-come le caratteristiche ed è indicato con una linea tratteggiata superiore; l'interfaccia tra elastomero barriera e gap filler è indicato come menisco-come le caratteristiche che a contatto con l'area nera ed è indicato dalla linea tratteggiata inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Crescita progressiva e continua delle cellule con zona di coltura di cella variabile in un microchannel riconfigurabile. (A) crescita delle cellule COS-7 in una zona di coltura cellulare confinata muovendo i fianchi. (B) crescita curva e tempo evoluzione della densità di cellule COS-7 confinate in zone della coltura di dimensioni variabili nel microchannel riconfigurabile mostrato nella A). Tre frecce verticali indicano espansione della zona della coltura delle cellule a 2, 5 e 6 d, rispettivamente. Oltre al conteggio delle cellule, densità delle cellule sono indicati per le stesse zone di coltura, montati singolarmente a ogni curva di crescita esponenziale e utilizzato per stimare il tempo di raddoppiamento locale (td [h]) mostrato nei frame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il pin-discretizzati microchannel è un canale di microfluidica full-optional, e crediamo che ha ovviamente elevata riconfigurabilità nella forma del canale rispetto a qualsiasi esistenti canali microfluidici. Il protocollo che abbiamo fornito qui consentirà dispositivi microfluidici capaci di coltura cellulare con gradualmente ampliando cella cultura superficie per mantenere le culture sotto confluency per una lunga durata. Il dispositivo fornirà anche nel canale campitura delle cellule senza patterning proteine substrato in anticipo o qualsiasi altra considerazione al momento della progettazione o di fabbricazione. Inoltre, questo dispositivo microfluidico riconfigurabile genera facilmente forte nel canale spostamento flusso, che contribuirebbe a implementare la gestione di tali materiali di difficile--flow che pochissimi microfluidici esistenti dispositivi in grado di gestire. Ciò significa che l'interazione tra le cellule e altri microrganismi, gas e altri fluidi-non può essere valutato utilizzando questo dispositivo senza grandi modifiche nella progettazione del dispositivo.
Abbiamo considerato l'applicazione di pressione di Laplace o pressione idrostatica a un ingresso del canale come metodi di controllo di flusso esterno. Non è consigliabile che spinge il liquido in un vicolo cieco perché genererà flusso verso il canale di sfiato di aria attraverso le lacune tra i pin e il pavimento/soffitto del canale. Molte operazioni di fluido non richiedono operazioni pin. Ad esempio, di miscelazione è possibile schiacciare il liquido da un pin (cioè, un solo pin in movimento avanti e indietro diverse volte).
Le parti più critiche del dispositivo sono i perni. Precisione di lunghezza, parallelismo, perpendicolarità e qualità di superficie sono necessari per le spine, come essi devono formare un microchannel, deve muoversi agevolmente e deve guidare il movimento di pins adiacenti. Pertanto, si consiglia che i perni devono essere effettuati tramite una società specializzata in lavorazioni meccaniche di precisione inviando un disegno simile alla Figura 2A. Ci possono essere le aziende che richiedono ulteriori dimensionamento geometrico e indicazioni esplicite rugosità superficiale. Tuttavia, i perni sono riutilizzabili se sono maneggiati con cura e occasionalmente passivati con acido nitrico.
La barriera elastomerica è un'altra caratteristica fondamentale, e la sua formazione è il punto più critico nei processi di fabbricazione del dispositivo. Una base con precisione lavorata sarà necessari per ottenere risultati affidabili e ripetibili. Appoggiando i dentini sulla barriera non polimerizzata è anche un passo fondamentale. I perni devono essere tenuti ben allineati e incorporato nel gap filler e la barriera senza bolle d'aria. Questi passaggi evitare perdite attraverso i perni, che è un problema comune con questo dispositivo microfluidico.
Altri problemi comuni nell'utilizzo di questo dispositivo sono perni) con accoppiamento per attrito sobri e morte delle cellule b) e tasso di crescita bassa. Possibili cause per questi in un) includono irregolare acquaforte (conico o ondulati) del perno centrale, qualità scadente del disadattato acidato superficie e dimensionale tra l'altezza della punta di perno e l'altezza dello strato di photoresist su uno stampo per lastre in silicone. Regolazione della formulazione di mordenzante, temperatura e l'agitazione può contribuire a migliorare il movimento del perno. Inoltre, prova di montaggio senza l'utilizzo di cera o adesivo fornirà suggerimenti per risolvere il problema. Possibili fattori in b) sono insufficienti passivazione dei perni, errori nella selezione degli adesivi per barriere elastomeriche e polimerizzazione incompleta degli adesivi. Alcune cellule possono richiedere il rivestimento interno del microchannel con fibronectina o altre proteine o polimeri che promuovono l'adesione delle cellule. Inoltre, ottimizzazione nella pratica di coltura delle cellule come trypsinization e centrifugazione diminuirà le cellule morte nel microchannel.
Una delle limitazioni del protocollo presentato fabbricazione è che solo una delle pareti laterali viene discretizzata. La riconfigurabilità del canale migliorerà ulteriormente se entrambi i fianchi sono costruiti da matrici di pin. Anche se richiede il doppio dei perni e passi di lavorazione più lunghi, si tratta di una soluzione tecnicamente praticabile.
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Questa ricerca è stata sostenuta da KAKENHI (20800048, 23700543).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oven | Yonezawa | MI-100 | |
10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
Spin coater | Active | ACT-220DII | |
Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
Nitrogen | Various | N/A | |
Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
Scalpels | Various | No.11 | |
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
Glass engraving pen | Various | N/A | |
Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon