Реконфигурируемые Microfluidic канал с Pin дискретизированы бортами

Резюме

Microfluidic канал с деформируемым бортами предлагает управление потоком, обработка частиц, канал измерения настройки и другие изменения конфигурации во время использования. Мы описываем метод для изготовления microfluidic канал с бортами из массива булавки, позволяющий изменить их форму.

Аннотация

Microfluidic компоненты должны иметь различные формы, чтобы реализовать различные ключевые microfluidic функций, таких как смешивание, разделения, улавливания частиц или реакции. Microfluidic канал, который искажает даже после изготовления при сохранении формы канала позволяет высокое пространственно-временных реконфигурации. В таких ключевых microfluidic функций, которые трудно достичь в существующих системах «реконфигурируемых» или «интегрированных» microfluidic требуется этот реконфигурации. Мы описываем метод для изготовления microfluidic канала с деформируемым боковины, состоящий из горизонтально выровненные массива концы прямоугольных контактов. Исполнительные контакты в продольном направлениях изменяет булавки конечные позиции и таким образом, форма дискретизированные канал боковинами. Контактный пробелов может привести к нежелательной утечки или адгезии к соседние булавки, вызванные мениска сил. Чтобы закрыть пробелы PIN-код, мы ввели углеводородов фторопласт на основе подвеска ретранслятор сопровождается эластомерных барьер. Это реконфигурируемых microfluidic устройство может генерировать сильный временные перемещения в канале потока, или может остановить поток в любом регионе канала. Эта функция будет способствовать, по требованию, обработки клеток, вязкие жидкости, газовых пузырей и не жидкости, даже если их существования или поведение неизвестно в момент изготовления.

Введение

Microfluidic устройства - микро размеров которые управляют небольшое количество жидкости и их потоков - предлагают миниатюризации биомедицинских процедур в формате «фишкой» с увеличения переносимости и, зачастую, доступность. Как описано в недавно обзор¹, различные компоненты microfluidic, состоящие из пробелов и положительные черты были разработаны для реализации основных и ключевых оптимизированных функций, таких как смешивание, разделения, улавливания частиц или реакции.

Хотя поведение многих microfluidic устройств определяется на этапе проектирования, некоторые виды microfluidic приборы позволяют после изготовления изменения их структуры или поведение. Здесь мы называем эту функцию «реконфигурации». Реконфигурации microfluidic систем обычно уменьшает время и затраты, необходимые для разработки устройств, или позволяет настраивать макет microfluidic или функций с течением времени.

Ранее описанный реконфигурируемых microfluidic приборы делятся на следующие три категории. Во-первых деформации эластомерных каналов позволяет скорости потока и направлениях, чтобы быть изменены во время использования. Чтобы получить реконфигурации, эластомерная каналов деформированы различные внешние и контролируемым силами пневматический прижим источников², приводы Брайля³или сжатия, уплотнение⁴. Во-вторых, реконфигурируемых устройств полагаются на модульной конструкции, такие как многослойная оптимизированных схем, модульные каналы с магнитным и на основе труб микрофлюидика⁵. В-третьих само устройство не реконфигурируемых, но микрокапель перевозки на электрод массивы (часто упоминается как цифровой микрофлюидика)^6,7 и висит на основе падение microfluidic приборы⁸ включить по требованию Переключение потоков или маршрут жидкости.

Тем не менее многие из этих изменения конфигурации ограничены на топологических и макроскопических уровнях. Например многие комплексные microfluidic приборы остановить поток или изменить направление потока, рушится микроканалов в предварительно определенных регионах. Однако позиции и количество регионов, чтобы свернуть не настраиваются. Хотя цифровые микрофлюидика имеет различные жидкости, обработки способности, возможных потоков должны быть во многом ограничены объем каждой капли. Кроме того когда клетки культивировали в таких капель клетки культуры средств массовой информации, дополнительные усилия необходимы для предотвращения испарения и диссипация газа от капель и избежать удара осмотического давления и внезапной рН изменения.

Реализовать реконфигурации компонента уровня канала, мы предложили microfluidic устройство с подвижные боковые стенки, которые состояли из массивов элементов машин динамически перенастроить их в случае использования⁹. Сформировать деформируемого боковины, небольшие прямоугольные штифты были выстроены таким образом, чтобы каждый конец булавки определенный сегмент боковины. Скользящие контакты допускается деформация боковины, что позволило транспорта или патронирования клеток, пузырьков и частиц внутри канала. Чтобы свести к минимуму объем и максимизировать реконфигурации, расстояние между соседними штырями пришлось быть сведены к минимуму. Однако сильный капиллярность, действуя на небольших пробелов между штырями соединения внутри и вне микроканальные причины утечки жидкости ввода ПИН разрыв, вызывая СМИ испарения, бактериальной или цитотоксические загрязнение и в конечном итоге ячейки смерть. Таким образом мы разработали без утечек дискретизированный боковины тип реконфигурируемых microfluidic каналы, которые выдерживают действия циклических ПИН и долгосрочные культуры клеток¹⁰.

В этой статье мы предоставляем протокол для создания microfluidic клетки культуры устройства с дискретизированным боковины, которая может быть перенастроена после постепенного увеличения в области культуры клеток. Герметичность дискретных каналов боковинами проверяется с использованием изображений флуоресценции. Культура клетки совместимость и способность клеток патронирования вычисляются с помощью культуры клеток на чипе.

Эта система microfluidic подходит, когда соответствующий канал дизайн не может быть заранее и должны быть изменены по требованию. Например, эта система может использоваться для настройки канала ширины и потока показатель, основанный на рост клеток или миграции, поток или ловушка активных нематоды или других небольших объектов, которые ведут себя неожиданно в канале, или принять различные образцы сырья или биопродуктов, не были еще задуман в то время дизайна.

протокол

1. травление булавки (рисA)

1. Обезжирьте прямоугольных контактов путем погружения в ацетоне.
2. Пассивации булавки, погружая в 4 мл 10% азотной кислоты, а затем Нагрейте раствор при 65 ° C для 30 минут в духовке.
3. Sonicate контакты в дейонизированной воде 5 минут для удаления остатков кислоты и высушить бумажным полотенцем. Погружайте контакты в 0,5 мл смазочное средство для 2 h.Sonicate контакты в дейонизированной воде 5 минут.
4. Изготовить травления блюдо (рис. 2C).
   1. Нарисуйте или записаться две параллельные линии с 4 мм зазор на слайде стекла с помощью линейки.
   2. Применить химической устойчивостью и низкой вязкости клей для одной поверхности двух прямоугольных резать coverglasses.
   3. Бонд два разреза coverglasses на стеклянное скольжение на разрыв 4 мм. Используйте параллельные линии в качестве руководства.
5. Распределить две линии силиконового клея на блюдо травления (см. рис. 2C позицию и размер контура).
   Примечание: 3D-печати шаблон (файл STL модели включена в качестве дополнительного материала) поможет рисовать линии легко и точно.
6. Поставьте булавки на травления блюдо, так что 2 мм Лонг советы на их концах прямой погружаются в клей линии. Распределить клей снова, чтобы убедиться, что контакты полностью покрыты и нарисовать контур. Передать травления блюдо увлажненные ферментёра, нагревают до 38 ° C. Ждать на ночь, чтобы вылечить клей.
7. Добавьте 0,2 мл 0,5 М азотной кислоты 0,2 мл 5,0 М соляной кислоты медленно в стеклянный флакон.
   Предупреждение: Смесь, также известный как Aqua regia, очень агрессивных и взрывоопасных. Надевайте кислотостойкий резиновые перчатки и защитные очки и проявлять крайнюю осторожность при обработке кислот. Никогда не храните решение. Уменьшите азотной кислоты максимально уменьшить ее агрессивности.
8. Поместите блюдо травления на конфорку, нагревают до 65 ° C. 0.4 мл кислоты смеси залейте регионе открытые контакты. Подождите 10 минут и передача кислоты на стакан.
9. Нейтрализовать все оставшиеся кислоты, включая травление регион булавки с 5 мл раствора натрия гидрокарбонат 0,8 М в деионизированной воде.
10. Удалите контакты из блюдо травления, потянув булавки продольно с помощью пинцета. Sonicate контакты в дейонизированной воде 5 минут, после чего sonication в ацетоне в течение 5 мин.
11. Пассивации травлению региона контактов как в шаге 1.2.
12. Проверка ширины травлению булавки с микроскопом магазин с прицельной сетки. Отрегулируйте время травления, описанные в 1,7, так, чтобы ширина области травления составляет 0,2 ± 0,02 мм.
13. Перенести контакты стеклянный флакон с 5 мл 70% этанола. Принесите флакон для ламинарных капюшоном. Выбрать вверх штифты из флакона и дайте им высохнуть.

2. Изготовление плит силикона с водохранилищ и пространство для контактов.

1. Изготовить форму пространства для контактов и фиксированной боковины типичный литографированный процессами.
   1. Герб обезжиренной стекла слайд с 1 мл отрицательных эпоксидной фоторезиста, используя coater спин на 1000 об/мин. Сухие фоторезиста на горячей плите 95 ° C на 15 мин повторить этот шаг один раз.
   2. Спиновые пальто третий слой же фоторезист при 2000 об/мин на слайде стекла с покрытием фоторезиста. Сухие фоторезиста на конфорку 95 ° C за 30 мин.
   3. Подвергайте слое фоторезиста 450 МДж/см² 365 Нм ультрафиолетового света от источника УФ пятно света через photoplotted фильм. Выпекать подвергаются фоторезиста на 95 ° C плитой на 15 мин разработка фоторезиста путем опрыскивания растворителем (2-метокси-1-methylethyl ацетат), с помощью ручной опрыскиватель и укладка феном с газом азота.
   4. Место стекла слайд с рисунком фоторезиста в нижней части пластиковых блюдо.
2. Вылейте форполимера полидиметилсилоксан (PDMS) на плесень толщиной 3 мм. Debubble форполимера PDMS в вакуумного эксикатора-800 кПа за 10 мин.
3. Вылечить PDMS форполимер в духовке при температуре 65 ° C для 1 h. Demold частично вылечить PDMS плиты с помощью скальпеля. Полностью вылечить PDMS в духовке при температуре 120° C в течение 1 ч.
4. Вдоль руководящего шаблон обрежьте прочь неровными краями от PDMS плиты с же скальпель. Сделать как точные и чистой сократить как можно скорее, особенно на поверхности, которая определяет слот вставки(см. рис. 1)для закрепления.
5. Перфорировать 2 мм в диаметре отверстия на входе/выходе в концы главного русла PDMS плиты с помощью биопсии ударов. Аналогичным образом перфорации 1 мм диметром отверстия на концах канала дефлектора воздуха. Посмотреть Рисунок 1A для канала макет и положение этих отверстий.

3. сборка устройства с изготовлением на месте разрыва наполнителя и барьер.

1. Изготовить микроканальные Ассамблеи.
   1. Погружайте 10 × 20 мм № 4 coverglass в моющий раствор, нагретый до 60 ° C в течение 10 мин.
   2. Дважды промыть coverglasses деионизированной водой и высушить на 120 ° C в течение 10 мин.
   3. Плазма Бонд PDMS плиты для coverglass:
      1. Место PDMS плиты (канал функция стороной вверх) и уборка 10 × 20 мм № 4 coverglass в вакуумной камере распыления нанесения покрытий.
      2. Начать, насосные вниз камеры до 60 Па генерировать воздуха вакуумным плазмы (20 мА) для 30 s.
      3. Сразу же вентиляционные камеры. Бонд, стороне канала функция PDMS плиты для coverglass с их края выровнены.
      4. Место кабального слоев в 65 ° C духовке 10 мин.
   4. Принесите кабального слои для ламинарных капюшоном с помощью стерильного контейнера. Стерилизуйте их с ультрафиолетовым светом за 30 мин.
   5. В ламинарных капюшоном Вставьте контакты в слот так, что их концы образуют другие боковине микроканальные. Соседние булавки должны быть разными в длину, чтобы избежать контакта концах вертикального (см. рис. 1Б). Большое расстояние между вертикальной концы является предпочтительным. Пространство (N-1) × (PIN-код ширина) возможен, когда готовятся N виды контактов с различными PIN-код длины (L в рисунке 2A).
2. Изготовить основание ( рис. 2B).
   1. Сделать или прочитать файл часть базы и сделать два числового программного управления (ЧПУ) файлы (содержащие траектории; включена в качестве дополнительного материала) с помощью CAD/CAM программного обеспечения. Первый дополнительный файл NC использует 4 мм в диаметре концевая фреза и второй, диаметром 1 мм конец мельницы.
   2. Зажим 3 мм толстой ясно полиметилметакрилата (PMMA) Совет на CNC мельницы.
   3. Откройте первый файл NC на контроллере мельницы NC (ЧПУ) компьютера. Установите 4 мм концевая фреза CNC мельницы и найдите часть нулевой, прикоснувшись концевая фреза ПММА Совету. Запуск кода ЧПУ сократить Совет.
      Примечание: Иногда удар кончик мельница конца с помощью сжатого воздуха для охлаждения и чип удаления.
   4. Повторите с помощью второго файла NC и 1 мм концевая фреза 3.2.3.
   5. Обезжирить обтачиваемые детали с моющим средством и вытрите насухо бумажным полотенцем. Спрей частей с 70% этанола и довести их до ламинарных капюшоном.
3. Изготовить ПИН ретранслятор и эластомерные барьер:
   Примечание: 3.3.1 - 3.3.7 следует действия консерванта в ламинарных капюшоном.
   1. Подготовьте ретранслятор, смешивая Белый вазелин и порошок из политетрафторэтилена в соотношении 2:1 по весу. Гомогенизации смеси с использованием ультразвуковой гомогенизатора.
   2. Ретранслятор наливайте в распылитель шприц. Вставьте поршень и нажмите, чтобы заполнить кончик шприца. Прикрепите иглы и снова нажмите поршень, пока не будет заполнено кончик иглы. Аналогичным образом подготовить шприц распылитель с плунжером и иглы и заполнить с силиконовым клеем.
   3. Подключите каждый шприц к Пневматический распылитель с использованием адаптера трубки. Отрегулируйте давление дозировки для силиконового клея и наполнителя до 250 кПа и 280 кПа.
   4. Отказаться от силиконового клея на край кармана базы. Место 10 × 20 мм № 4 coverglass на кармане и нажмите его твердо установить связь.
   5. Отказаться от силиконового клея на глубину примерно 1 мм, чтобы привлечь двух сегментов вдоль два внешних разъема базы. Отказаться от ретранслятор на глубину примерно 1 мм, чтобы нарисовать сегменты вдоль другой слот.
   6. Отказаться от силиконового клея к краю другой карман. Поместите сборку микроканальные (3.1) на кармане и нажмите его твердо установить связь.
   7. Повторите 3.3.5 для обеспечения что дежурный и силиконовый клей полностью внедрить булавки и что нет никакого открытия в слоты.
   8. Поместите устройство в стерильный контейнер как коробка из нержавеющей стали с крышкой. Переноса контейнера на увлажненные ферментёра, нагревают до 38 ° C. В ламинарных капюшоном вылечить эластомерных барьер на один день.
   9. Переместите каждый контакт до 1 мм вдоль прилегающих контакты чтобы освободить контакты вылечить эластомерных барьер.
   10. Стерилизуйте устройство с ультрафиолетовым светом за 30 мин.

4. Оценка Microfluidic устройства

1. Обнаружение утечки с помощью флуоресцирования
   1. Откройте с помощью тонкой или рабочего стола робот микроканальные. Чтобы ширина канала как несогласованной канала как можно скорее.
   2. Разбавьте зеленый Люминесцентную краску с дейонизированной водой на 10 мкм, чтобы сделать раствор флуоресценции.
   3. Добавьте решение флуоресценции в один из портов конце микроканальные с micropipettor. Этот шаг будет заполнить канал с решением.
   4. Поставьте устройство microfluidic и два кусочка фильтровальной бумаги мокрой деионизированной водой в большой пластиковый блюдо. Инкубируйте блюдо на 37 ° C и 5% CO₂ для по крайней мере 24 часа.
   5. Запись зеленый флуоресценции образы микроканальные с инвертированным микроскопом люминесцентные с камеры микроскопа.
   6. Откройте флуоресцентного изображения с помощью программного обеспечения анализа соответствующего изображения и убедитесь, что нет никакой утечки (зеленая Флуоресценция) на стыке ретранслятор и контакты.
2. Семя ячейки микроканальные.
   1. Подготовка судна культуры клеток, содержащих вырожденная клетки 70-80% (в зависимости от типов клеток). Отсоединение и приостановить клетки в среднего роста.
   2. Центрифуга клетки (скорость и время зависят от типов клеток) и аспирационная среды.
   3. Ресуспензируйте клетки с небольшим количеством средних. Подсчет количества ячеек с счетчик соматических клеток и отрегулируйте плотность клеток от 1,5 × 10⁶ до 1,5 × 10⁷ кл/мл.
   4. Откройте microchannel, с помощью тонкой или рабочего стола робот (рис. 1Б) чтобы сделать прямо 400-мкм широкий канал. Корректировка позиции ПИН сделать боковины как плоская на протяжении канала как можно скорее. Добавить один из конца порта микроканальные суспензию клеток и заполнить канал.
   5. Найдите один из контактов, которые определяет боковины региона начать культуры. Соответствии с инвертированным микроскопом закройте два соседние булавки подложить клетки в регионе культуры клеток.
   6. Закройте все контакты в порядке от внутренней к внешней изгнать всех клеток из канала. Аккуратно аспирационная подвеска от конца портов и в них добавить средне.
   7. Инкубируйте устройство, как описано в 4.1.4. Когда клетки являются около 70-80% вырожденная, медленно открыть ПИН-кода для расширения области культуры.

Результаты

Строительство реконфигурируемых микроканальные показан на рисунке 1. Несколько прямоугольных контактов были размещены на стеклянной подложке и были выстроены таким образом, чтобы длинной стороне булавки были в контакте. PDMS лист с перфорированные отверстия и перерыв той же глубины, как высота ПИН охватывает концы булавки для формирования канала впускных/выпускных коллекторов, каналов потолок и другой боковины напротив стены канала, которая состояла из контактов. Региона, окруженный булавки, стена (одна из граней PDMS листа) и стеклянной подложке образуют один microfluidic канал.

Как описывалось ранее реконфигурации предлагаемого microfluidic системы достигается многими небольшими контактами, помещены параллельно с очень небольшой, но не нулевой пробелы. Проблема в предыдущих докладах был сильный поток, порожденных капиллярного эффекта через пробелы. Для преодоления этой проблемы, пробелы впервые были заполнены с наполнителем разрыв. В этом протоколе дисперсные смесь вязкой углеводородов и фторопластовые порошок был использован как ретранслятор. Однако дежурный само по себе является также предметом капиллярного эффекта. Таким образом как показано на рисунке 1, результирующий реконфигурируемых микроканальные имеет углеводородов/фторопластовые ретранслятор и эластомерные барьер, сформированных вокруг внешнего периметра ретранслятор. Истончение середины контакты необходимо разместить достаточное количество ретранслятор для обеспечения толщины и прочности эластомерных барьера между двух контактов.

Рисунок 2 A показывает рисунок pin, который образует сегмент боковины. Из нержавеющей стали марки 316L был выбран в качестве материала за счет его коррозионно стойкие и низкой выщелачивания свойства. Однако дополнительные пассивации процесс был обязан совместить штыри клеточной культуры. PIN-код должен иметь именно прямоугольные наконечник без заусенцев успешно формировать сегмент боковины. Кроме того PIN-код должен иметь «ручки», так что ПИН-код можно легко перемещать, нажимая ручку. Потому что каждый контакт имеет узкий среднего, толщина эластомер между штырями было достаточно, чтобы выдержать сдвига, вызванных движением PIN-код. В отличие от других частей, включая устройства изготовление булавки, за исключением среднего истончение, следует заказать компания, специализирующаяся на Электроэрозионная обработка (модель EDM), потому что это один из самых точных и экономически эффективных методов обработки малых части, сделанные из твердых металлов. Выполнение среднего истончение путем травления себя снижает стоимость обработки и риск изгиба или нарушение во время обработки.

Чтобы подтвердить, что ретранслятор, эластомерная барьер и в конечном итоге водонепроницаемости реконфигурируемых микроканальные функционировать должным образом, был использован обнаружения утечек, флуоресценции. Рисунок 3 показывает флуоресценции изображение района вблизи края эластомерных барьер 3 дня после микроканальные был заполнен водой, содержащей флуоресцентные трассирующими красителя. Флуоресценции изображение показывает, что жидкость заполнения канала, достигли глубины около 200 мкм от края видимой эластомерных барьера. Однако жидкость не достигли разрыв наполнителя. Кроме того было отмечено отсутствие утечки наполнителя разрыв через эластомерных барьер. Это наблюдение указывает, что плотное прилегание между узкой середины булавки и эластомерные барьер причины миграции жидкости через пробелы.

Наконец мы провели долгосрочные культуры клеток в области культуры, адаптированы, постепенно расширяя боковины реконфигурируемых microfluidic устройства как показано на рисунке 4A. На 0 d небольшое количество клеток были ограничены в пространстве, равный одному ПИН ширина и другие клетки были наддува. На 2 d клетки были прикреплены к нижней поверхности и начал растет. Два контакта были отозваны так, что все клетки были хорошо видны, хотя confluency по-прежнему низок. В 5 d клетки продолжают размножаться и confluency увеличилось. На 6 и 9 d два других провода были отказался держать underconfluent клетки. Эффект постепенного расширения зоны культуры показана на рисунке 4B. Там были внезапные изменения в плотность клеток на тот день, когда контакты были отозваны. Однако темпы роста числа клеток был неизменным, в то время как видели в типичных клеточной культуре это экспоненциальный.

Рисунок 1 : Реконфигурируемых microfluidic устройство с одной боковине ПИН дискретизированы. (A) части и строительство реконфигурируемых microfluidic устройства. Устройство имеет один прямой канал с одной боковине, образованный концы 10 контактов из нержавеющей стали, вставляется стекло PDMS микроканальные функции. Ретранслятор и эластомерные барьер предотвращает жидкости от утечки через щели PIN-код. Coverglasses, дежурный и эластомера барьера крепится к полиметилметакрилата (PMMA) базы. (B) автоматизированный манипулятор ПИН. Конец эффектор, сделанные из листа металла крепится к 3-осевой робот обои. Чтобы переместить один контактный, конец эффекторных толкает его вертикальный конец. Контакты с различными длинами размещаются с интервалом в три раза ширину PIN-код. Интервал гарантирует, что конец эффекторных товарищей один PIN-код в одно время с достаточный зазор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Чертеж обрабатываемых деталей, используемых в протоколе. Значения указываются в миллиметрах; R означает радиус измерения; квадратный символ (□) указывает квадратных функции; t указывает толщину. (A) ПИН из нержавеющей стали 316 L как части боковины. Контакты можно заказать и обрабатываемых как описано. Истончение ПИН Ближнему сделать собаке кость как формы не отражается на этом рисунке, потому что это не было приказано как часть обработки, но была выполнена как часть протокола. (B) полиметилметакрилата (PMMA) база, которая держит coverglasses, дежурный и эластомерные барьер в место против движения PIN-код. (C) травления блюдо, которое используется для etch в середине булавки. Чтобы построить травления блюдо, четыре части стекла связаны с помощью силиконового клея. Шаблон контур силиконовый клей рисуется на блюдо, следуют размещение контактов на блюдо, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Флуоресценции обнаружения утечек из реконфигурируемых микроканальные через контактный пробелы. Флуоресценции изображение зеленого флуоресцентного красителя, заполнение реконфигурируемых микроканальные накладывается на контраст изображения фазы уплотнение структуры, которая состоит из ретранслятор (непрозрачными) и эластомерные барьер (прозрачный). Край барьера эластомер виден как мениска подобные функции и обозначается верхней пунктирной линией; интерфейс между барьер и разрыв наполнителя эластомеров показано как мениска подобные функции, которые связаться черную область и обозначается Нижняя пунктирная линия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Рост постепенного и непрерывного клеток с переменной ячейкой зона культуры в реконфигурируемых микроканальные. (A) COS-7 рост клеток в области культуры клеток, ограничивается путем перемещения боковых стен. (B) рост кривой и время эволюция плотность COS-7 клеток в зонах культуры переменного размера в реконфигурируемых microchannel, показано в A). Три вертикальные стрелки обозначают расширение области культуры клеток в 2, 5 и 6 d, соответственно. Помимо число ячеек плотность ячеек отображаются для тех же областях культуры, оборудованы индивидуально для каждой кривой экспоненциального роста и используется для оценки местное время удвоения (t_d [h]), показан в рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Микроканальные дискретизированы ПИН — это полнофункциональный microfluidic канал, и мы считаем, что он имеет очевидно высокой реконфигурации в формы канала, по сравнению с любыми существующими каналами microfluidic. Протокол, который мы представили здесь позволит microfluidic приборы способны клеточной культуры с постепенно расширяет площадь поверхности культуры клеток сохранить культур под confluency течение длительного времени. Устройство будет также оказывать в канал патронирования клеток без кучность белков на субстрат заранее или другие рассмотрения во время проектирования или производства. Кроме того это устройство реконфигурируемых microfluidic легко создает сильное смещение в канале потока, который поможет реализовать обработку таких сложных для потока материалов, что очень немногие существующие microfluidic устройства может справиться. Это означает, что взаимодействие между клетки и других микроорганизмов, газов и других не жидкости можно оценить с помощью этого устройства без больших изменений в конструкции устройства.

Мы рассмотрели, применяя Лапласа давления или гидростатического давления для одного входного канала как методы контроля внешнего потока. Мы не рекомендуем нажимать жидкости в тупик, потому что он будет генерировать потока к канал дефлектора воздуха через щели между булавки и потолка/пола канала. Многие жидкости операции не требуют таких операций PIN-код. Например смешивание может быть достигнуто путем затирания жидкости на один контакт (т.е. перемещение только один PIN-код и обратно несколько раз).

Наиболее важные части устройства являются булавки. Точность в длине, параллельности, перпендикулярности и качество поверхности необходимы для ножек, как они должны образовывать microchannel, должны двигаться плавно и должны направлять движение соседние булавки. Поэтому мы рекомендуем, что контакты должны быть заказаны от компании, которая специализируется на точность обработки, представив Рисунок похож на Рисунок 2A. Там могут быть компании, которые требуют дополнительных геометрических размеров и явные шероховатость поверхности направления. Однако контакты являются многоразовыми, если они обработаны с осторожностью и иногда пассивируется с азотной кислотой.

Эластомерные барьер является еще одной критической чертой, и его формирования является наиболее важным этапом в процессе изготовления устройства. Именно механической базы необходимо будет получить надежные и повторяемые результаты. Размещение булавки на неотвержденных барьер также является важным шагом. Контакты должны храниться хорошо согласованы и встроенных в дежурный и барьер без пузырьков воздуха. Эти меры предотвращения утечки через контакты, который является общей проблемой microfluidic устройства.

Другие распространенные проблемы в использовании этого устройства являются) Фрикционная сдержанных контактов и b) клеточную смерть и низкие темпы роста. Возможные причины возникновения этих) включают неравномерное (коническая или волнистые) травления ПИН среднего, плохое качество травления поверхности и размеров несоответствия между контактный наконечник и высотой слое фоторезиста на плесень для плит силикона. Корректировка etchant формулировка, температуры и агитации может помочь улучшить движение PIN-код. Кроме того судебное разбирательство, монтаж без использования воска или клей будет предоставлять подсказки, чтобы решить эту проблему. Возможные факторы b) являются недостаточно пассивация булавки, ошибки в подборе Клеи эластомерные барьеров и неполной полимеризации клея. Некоторые клетки могут потребовать покрытия внутри микроканальные фибронектин или других белков или полимеров, которые способствуют клеточной адгезии. Кроме того оптимизация в практике культуры клеток trypsinization и центрифугирования будет уменьшаться мертвых клеток в микроканальные.

Один из недостатков протокола представленной изготовления является, что только один из боковин дискретизируются. Если обе боковины построены массивам контакт реконфигурации канала будет совершенствовать. Хотя она требует удвоить количество контактов и больше изготовления шаги, это технически жизнеспособной альтернативой.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oven	Yonezawa	MI-100
10% Nitric Acid	Wako Chemicals	149-06845
Stainless steel pins	Micro Giken	N/A	0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM
Mold release agent	Fluoro Technology	FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Shin-Etsu Chemicals	KE-106
Negative epoxy photoresist	Nippon Kayaku	SU-8 3050
Coverglasses (Rectangular)	Matsunami Glass	26 x 60mm No.4
Acetone	Kanto Chemicals	01060-79
Glass slides (Large)	Matsunami Glass	76 x 52mm No.1
Silicone adhesive	Shin-Etsu Chemicals	KE-41
White petrolatum	Nikko Rica	Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder	Power House Accele	Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-thick)	Various	N/A
Pneumatic dispenser	Musashi Engineering	ML-5000XII
Hydrochloric acid	Kanto Chemicals	180768-00
Computer numerical control (CNC) mill	Pro Spec Tools	PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0100
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity )	Cotronics	Duralco 4460
Borisilicate glass vials	Various		To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass.
Sodium bicarbonate	Kanto Chemicals	37116-00
Ultrasonic cleaner	AS ONE	AS12GTU
Ultrasonic drill	Shinoda Tools	SOM-121	Used as a ultrasonic homogenizer.
Spin coater	Active	ACT-220DII
Hotplate	AS ONE	ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi)	Unno Giken	N/A	Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted.
2-methoxy-1-methylethyl acetate	Wako Chemicals	130-10505
UV spot light source	Hamamatsu	L8327	Ultraviolet source
Nitrogen	Various	N/A
Vacuum desiccator and pump	AS ONE	MVD-100, GM-20S
Scalpels	Various	No.11
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm)	Kai Medical	BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glass engraving pen	Various	N/A
Cleaning solution	Tama Chemicals	TMSC	Dilute 1:100 with deionized water
Sputter coater	San-yu Electron	SC-708	For plasma bonding.
Dispenser syringe (5 ml)	Musashi Engineering	PSY-5E
Plunger	Musashi Engineering	FLP-5E
Blunt needle (21G)	Musashi Engineering	PN-21G-B
Adapter tube	Musashi Engineering	AT-5E
Fermenter	Japan Kneader	PF100
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid)	Thermo Fisher	A33077
Large plastic dish	Greiner bio-one	688161
Absorbent paper	Asahi Kasei	BEMCOT M-1
Inverted microscope	Leica	DMi8
Microscope camera	Qimaging	Retiga 2000R
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)	GE Health Care	SH30021.01
Antibiotic-antimycotic solution	Thermo Fisher	15240-062
Trypsin/EDTA solution	Thermo Fisher	25200-056
Phosphate buffered saline (PBS)	GE Health Care	SH30256.01
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S1820
Cell counter	FPI	OC-C-S02
Cell culture vessel	VIOLAMO	VTC-D100
15 ml conical tube	Corning	352095
Shop microscope	PEAK	2034-20
Hand sprayer	FURUPLA	No.3530
Coverglasses (Rectangular)	Matsunami Glass	10 x 20mm No.4
CAD/CAM software	Autodesk	Inventor HSM
Nitrogen gas pressure regulator	AS ONE	GF1-2506-RN-V	Set to 0.1 MPa