الحيوانات الأليفة تصوير نيوروينفلاميشن استخدام [11ج] اتفاق دارفور للسلام-713 في نموذج الفأر من السكتة الدماغية

Summary

التصوير "التصوير المقطعي بالبوزيترون" (PET) من ترانسلوكاتور البروتين 18 كاتشين (تسبو) يوفر وسيلة غير الغازية لتصور الدور الدينامي نيوروينفلاميشن في التنمية والتقدم لأمراض المخ. ويصف هذا البروتوكول autoradiography تسبو-الحيوانات الأليفة و السابقين فيفو للكشف عن نيوروينفلاميشن في نموذج الفأر من السكتة الدماغية.

Abstract

نيوروينفلاميشن أمر محوري لتتالي المرضية بعد السكتة الدماغية. عدم الغازية من أساليب التصوير الجزيئي لديها القدرة على تقديم رؤى الحرجة في ديناميات الزمانية ودور بعض التفاعلات نيورويموني في المخ. على وجه التحديد، تصوير "التصوير المقطعي بالبوزيترون" (PET) من ترانسلوكاتور البروتين 18 كاتشين (تسبو)، علامة على microglia تفعيلها والطرفية النقوي نسب الخلايا، يوفر وسيلة لكشف وتعقب neuroinflammation فيفو. نقدم هنا، طريقة لقياس دقة استخدام neuroinflammation [¹¹C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713)، الجيل الثاني واعدة تسبو-الحيوانات الأليفة راديوتراسير، في انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيدة (دمكاو) بالمقارنة مع الفئران التي تعمل بالشام. التصوير بالرنين المغناطيسي كان يؤديها 2 أيام بوست-دمكاو جراحة تأكيد السكتة الدماغية، وتحديد مكان احتشاء وحجم. وتم تصوير الحيوانات الأليفة/Computed "التصوير المقطعي" (CT) 6 أيام بوست-دمكاو لالتقاط الزيادة الذروة في مستويات تسبو عقب السكتة الدماغية. كوانتيتيشن صور الحيوانات الأليفة أجريت لتقييم الاستيعاب [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 في الدماغ والطحال من الفئران دمكاو والشام لتقييم المستويات المركزية والطرفية للالتهاب. في فيفو [¹¹ج] وأكد الإقبال على اتفاق دارفور للسلام-713 الدماغ استخدام السابقين فيفو أوتوراديوجرافي.

Introduction

السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي الخامس للوفاة وسبب رئيسي للعجز في الولايات المتحدة¹. السكتة الدماغية يمثل أغلبية ساحقة من هذه الحالات (~ 87 في المائة)، التي تحدث عندما يكون هناك انقطاع مترجمة في تدفق الدم إلى الدماغ (مثلاً، بجلطة دموية أو إيداع الدهنية). بعد ذلك خفضت إمدادات الأكسجين والمواد الغذائية إلى المناطق المتضررة وتبدأ سلسلة باثولوجي معقدة أسفر عن موت الخلايا العصبية داخل نواة السكتة الدماغية (احتشاء) بالإضافة إلى المناطق المحيطة بها. نيوروينفلاميشن عنصر حاسم في مسار يؤدي إلى هذا الضرر، مع كل خلايا المخ المقيم المناعي (ميكروجليا) والتسلل إلى الخلايا المناعية المحيطية (العَدلات وخلايا T وخلايا ب وحيدات/الضامة) يعتقد أن تسهم في هذا تتالي المدمرة^2،3. Microglia تفعيلها والضامة المركزية لهذه الاستجابة نيوروينفلاماتوري، مع ورود تقارير عن آثار ضارة ومفيدة على حد سواء بعد السكتة الدماغية². وبالتالي، لا بد لتقييم المساهمة في فيفو من هذه الخلايا بعد السكتة الدماغية.

الحيوانات الأليفة هي عمليات تقنية تصوير جزيئي 3 الأبعاد قوية تمكن التصور البيولوجي في الجسم الحي من خلال استخدام جزيئات محددة وصفت مع البوزيترون (β +) انبعاث النويدات المشعة مثل ¹¹ج، ¹³ن، ¹⁵س و ¹⁸f. هذا الأسلوب غير الغازية مزايا كثيرة أكثر الأساليب السابقين فيفو (مثلاً، إيمونوهيستوتشيميستري)، كما يتيح الحصول على المعلومات الجزيئية في الوقت الحقيقي، في مواضيع معيشية سليمة، ويسمح للتحقيق الطولي. تصوير الحيوانات الأليفة من تسبو، علامة على microglia تفعيلها والطرفية النقوي نسب الخلايا، توفر وسيلة لتحديد وتعقب استجابات الخلايا المناعية الفطرية داخل الجسم، ويمكن أن تستخدم لتقييم التهاب بعد السكتة الدماغية، واستجابة للعلاج التدخلات. تسبو، المعروف سابقا بمستقبلات البنزوديازيبين الطرفية من نوع، هو بروتين كاتشين 18 التي يعتقد أن تلعب دوراً في نقل الكولسترول وتوليف نيوروستيرويدس⁴. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أن تسبو متورطة في نيوروينفلاميشن وبقاء الخلايا العصبية^5،6، مع ورود تقارير عن زيادة التعبير في العديد من الاضطرابات العصبية التي تشمل التهاب بما في ذلك⁷من السكتة الدماغية، الخرف⁸،⁹ من مرض باركنسون والتصلب المتعدد¹⁰. تسبو الموجود على أغشية الميتوكوندريا الخارجي، ويتم التعبير عن درجة عالية في المحيط الخارجي، لا سيما في ستيرويد الأنسجة المرتبطة بها (مثل الغدد) ومع المستويات المتوسطة ينظر في القلب والكليتين والرئتين¹⁰. لكن في الدماغ صحية، ومستويات تسبو منخفضة وتقتصر أساسا على إطلاق^6،11. عند إصابة الخلايا العصبية، مثل التي لوحظت في السكتة الدماغية، مستويات تسبو في الجهاز العصبي المركزي (CNS) زيادة كبيرة. يمكن استغلال هذه الملاحظة upregulation من تسبو للصورة نيوروينفلاميشن الحية، مع مستويات التعبير توفير مؤشر دقيق لشدة التهاب. ومن ثم فإن الهدف من هذا الأسلوب دقة تحديد مقدار المساهمةفي فيفو نيوروينفلاميشن في نموذج السكتة الدماغية تسبو التنسيقي باستخدام الماوس

وقد وضعت عدة تسبو تتبع لتصوير الحيوانات الأليفة من نيوروينفلاميشن. هنا، وتصوير الحيوانات الأليفة تسبو يرد استخدام اتفاق دارفور للسلام-713 [¹¹ج]¹²، الجيل الثاني واعدة تسبو الراسم، التي أظهرت الإشارات المعززة للضوضاء وأقل إلزاماً غير محددة من أكثر تاريخيا المستخدمة [¹¹ج] PK11195 ¹³ . على سبيل مثال، تم اختيار نموذج الماوس دمكاو السكتة الدماغية لهذا الأسلوب¹⁴. يشمل هذا النموذج اوديما مؤقتة ودائمة ربط الشريان الدماغي الأوسط البعيدة، أسفر التنسيق الاسكيمية من قشرة سوماتوسينسوري. وهذا مفيد في البحوث السريرية قبل السكتة الدماغية الواجب إمكانية تكرار نتائج عالية من الأضرار الدماغية ومعدلات الوفيات المنخفضة المرتبطة بهذا النموذج. وحتى الآن، لم دراسات تصوير الحيوانات الأليفة تسبو التي يتعين الإبلاغ عنها في نموذج القوارض دمكاو. ومع ذلك، السابقة الحيوانات الأليفة التصوير باستخدام النموذج (ماكاو) انسداد الشريان الدماغي الأوسط، نموذج السكتة دماغية أكثر شديدة والمتغير، في كل من الفئران والجرذان، أفادت الدراسات التعبير تسبو زيادة من يوم 3 وذروة حول يوم 7 السكتة الدماغية بعد^{15، 17،،}من ¹⁶¹⁸. ومن ثم، أجرينا الحيوانات الأليفة التصوير بعد 6 أيام-دمكاو ليتزامن مع ارتفاع تسبو التعبير. [¹¹ج] تم تقييم الإقبال على اتفاق دارفور للسلام-713 في الدماغ في عن (إينفاركتيد) وكونترالاتيرال في نصفي الكرة الأرضية. الحيوانات الأليفة تسبو اقترن بالرنين المغناطيسي الهيكلية، مما يسمح للتحديد الدقيق لاحتشاء والمناطق كونترالاتيرال للفائدة (رويس). يصف لنا هنا يستند نظام أطلس ونهج دوروا يحركها التصوير بالرنين المغناطيسي لحساب امتصاص اتفاق دارفور للسلام-713 [¹¹ج]. وقيمت امتصاص راديوتراسير في الطحال أيضا التحقيق في مستويات هامشية من التهاب بين المجموعات. يحتوي هذا الأسلوب على إمكانات توفير رؤى الحرجة في ديناميات الزمانية المكانية ودور التفاعلات نيورويموني محددة في المخ وغيرها من الأمراض العصبية.

Protocol

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا "الفريق الإداري" في مختبر الحيوان الرعاية (أبلاك) في جامعة ستانفورد، برنامج معتمد من قبل جمعية التقييم والاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية. قبل هذا الإجراء، عمره ثلاثة أشهر C57BL/6 الفئران الإناث عملية جراحية دمكاو بعد الإجراء القياسي وظروف معقمة¹⁴.

1-الهيكلية التصوير بالرنين المغناطيسي (أيام 2 دمكاو بعد الجراحة)

1. فتح برنامج التشغيل (انظر الجدول للمواد) وإنشاء شراء عن طريق إنشاء امتحان جديد. حدد المترجم وتسلسلات T2 توربوراري في مستكشف لوح الألوان واسحب في إطار امتحان.
2. تأمين الجهاز التنفسي والحرارة المسابير للسرير الماوس باستخدام الشريط لينة، ووضع شريط من واقية ماصة الحشو على حد سواء لخلق بيئة معقمة.
3. نعلق سخان هواء إلى السرير الحيوانية وتشغيل المروحة حيث يكون الهواء الحار على وإبقاء الماوس ساخنة. استخدام نظام رصد الآلي لضمان درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس على المستويات المناسبة لمدة المسح الضوئي.
4. تخدير الماوس في دائرة التعريفي لاستخدام 3% إيسوفلوراني في البداية، ثم الحفاظ على 1-2% (2 لتر في الدقيقة، 100% O₂). التأكد من تشغيل منصة حرارة تحت قاعة التعريفي للدفء الماوس أثناء التعريفي. مجرد تخديره، تطبيق مواد التشحيم العين على الماوس لتفادي التجفيف وتشكيل تقرحات القرنية.
   1. قم بتشغيل نظام التخدير (إيسوفلوراني 1-2 ٪، 2 لتر في الدقيقة 100% O2) متصل بالماسح الضوئي بالرنين المغناطيسي ونقل الحيوان إلى السرير الماوس.
   2. موقف الماوس الرأس-عرضه على شريط لدغة ويكس أشرطة الإذن في المكان، مع التأكد من أنها لا تبرز خارج قطر السرير.
   3. الشرائح لفائف الترددات اللاسلكية على رأسه الماوس ودفع بلفائف وسرير إلى تتحمل، وضعه خصيصا إيسوسينتير.
   4. اكتساب المترجم لعرض موضع الماوس في جميع أبعاد 3 واستخدام هذه الصورة لتحديد الحجم توربوراري T2 (الشركة المصرية للاتصالات: 33 مللي ثانية، TR: القرار مم 0.083 × 0.92، شرائح 17، 2 دقيقة و 40 ثانية مجموع الوقت، 2,500 مرض التصلب العصبي المتعدد، المتوسطات 2) اقتناء. جراحة دمكاو يؤدي احتشاء في قشرة somatosensory¹⁴؛ ولذلك، كفالة تغطي هذه المنطقة في الصورة T2 المرجحة.
   5. إزالة الفئران من الماسح الضوئي واسترداد الفئران في غرفة دافئة.

2-PET/CT معايرات وسير برنامج الإعداد (6 أيام دمكاو بعد الجراحة)

1. إنشاء سير عمل تصوير في برنامج تشغيل الماسح الضوئي تشمل اقتناء توهين الأشعة المقطعية، 60 دقيقة C-11 اقتناء الحيوانات الأليفة الديناميكية (350-650 كيلو إلكترون فولط مستوى التمييز، نافذة صدفة ns 3.438)، والرسم البياني (إطارات 20: 5 × 15 ثانية، دقيقة 4 × 1، 11 × 5 دقيقة؛ ومع قتل الوقت التصحيح) وإعادة بناء 3DOSEM-OP (التكرار 2، 18 مجموعات فرعية) لإنشاء 128 × 128 x 159 الصور مع 0.776 × 0.776 × 0.96 حجم فوكسل مم.
2. أداء مصدر الأشعة السينية تكييف عبر لوحة المعايرة CT الموجود في الزاوية اليسرى العليا من الواجهة. هذه المعايرة يجب أن تنفذ أسبوعيا أو قبل الفحص إذا لم يستخدم هذا النظام في 48 ساعة الماضية.
3. أداء مركز الإزاحة (بوساطة) معايرات والظلام/الضوء (d/L).
   1. الصحافة الأشعة المقطعية معايرة زر (X) في الأعلى اليسار من الواجهة.
   2. حدد d/L ووساطة للملف الأشعة المقطعية التي كنت ستقوم بتشغيل إزالة السرير من الهزال وتشغيل معايرة d/L.
   3. إدراج السرير أداة معايرة الماسح الضوئي وتشغيل المعايرة C/O، مع التأكد من التحديد على الواجهة بالتبديل إلى "أداة معايرة" بدلاً من "70 مم لوح".
4. إزالة أداة المعايرة والعودة السرير الحيوانات الأليفة القياسية، مع التأكد من تغيير التحديد في الواجهة مرة أخرى إلى "70 مم لوح".
5. تأمين سرير تصوير 4-الماوس إلى ساحة الماسح الضوئي باستخدام الشريط وإرفاق أنابيب التخدير (الشكل 1أ). ضمان أن isoflurane يتدفق عبر الأنابيب، وهي أن هناك لا مكامن الخلل.
6. دفع السرير إلى الأمام حتى أنها في مركز مجال الرؤية (FOV)، أغلق باب الأشعة المقطعية والحصول على رأي الكشفية للأشعة المقطعية للتأكد من السرير في الموضع الصحيح.
7. القيام بمعايرة "قياسية" من الماسح الضوئي باستخدام فانتوم مصنعة داخلية تحتوي على جرعة معروفة لحل C-11 كمصدر إشعاع PET/CT.
   1. إعداد 20 مل حقنه مليئة الراسم جرعة مكافئة لإدارتها لماوس واحدة (~ 250-350 µCi/9-13 مبق للتتبع C-11 المخفف في المحلول الملحي).
   2. تسجيل النشاط في المعيار تستخدم معايرة جرعات وملاحظة وقت القياس.
   3. إجراء مسح PET/CT مستوى استخدام معلمات نفس الدقيقة التي سيتم استخدامها للفئران الصورة (كما هو موضح أعلاه). هذا الأسبوعي لإنشاء عامل تصحيح للماسح الضوئي ليتم تطبيقه على البيانات تصوير الحيوانات الأليفة.

3-مساحة الإعداد لتصوير PET/CT

1. إنشاء بيئة معقمة باستخدام مطهر مع فيروسيدي (انظر الجدول للمواد) ووضع الحشو ماصة واقية على جميع الأسطح.
2. تضمن على نحو كاف ملء خزانات isoflurane والأكسجين.
3. تحضير القسطرة الوريد ذيل بملء حقنه 1 مل (مزودة بطرف إبرة ز 27.5) مع كلوريد الصوديوم 0.9% (عقيمة المالحة) والتنظيف عن طريق جي 27.5، 24 سم الفراشة القسطرة. قطع أجنحة القسطرة قبل كانولاتينج للتأكد من أنها لا تحجب رأي الوريد الذيل والمساعدة مع سهولة نقل الفئران في الماسح الضوئي دون أن تحل محل القسطرة.
4. ضمان جميع المعدات الأساسية هو وضعت في محطة العمل بما في ذلك الحقن "تدفق" قطع غيار (مليئة بالمحلول الملحي المعقم)، تشحيم العين، ومسحات الإيثانول، ومصابيح الحرارة، أعد القسطرة (قبل مليئة بالمياه المالحة)، الشريط الجراحي، الغراء الأنسجة، والمحاقن الجرعة 0.5 مل، مقص، وأخف وزنا لختم القسطرة بعد التنسيب الناجحة في ذيل الوريد (الشكل 1ب).

4. إعداد الحيوان وكانوليشن

1. وزن الفئران لتحديد حجم الحد الأقصى المسموح به لأن يحقن كل الماوس (أي، حجم الراسم وأي يجب أن تدار المالحة لا تتجاوز 10% وزن الجسم).
2. تخدير الفئران في دائرة التعريفي لاستخدام 3% Isoflurane والحفاظ على نسبة 1-2% (2 لتر في الدقيقة 100% O₂).
3. تطبيق مواد التشحيم العين على كل الماوس وتأكيد أنيسثيتيزيشن عن طريق دواسة ريفلكس (قرصه تو). ضبط مستويات التخدير إذا لزم الأمر.
4. ضع الماوس على سرير ساخن مزودة بمخروط الآنف لتسليم إيسوفلوراني في 1-2% (2 لتر في الدقيقة 100% O₂).
5. في حين تم تخديره من الماوس، أداء ذيل المنطلق cannulation استخدام بروتوكول التالية:
   1. ضع الماوس على جانبها لفضح أحد الأوردة الجانبية، بينما يبقى رأسه في مخروط الآنف.
   2. ذيل باستخدام مصباح حرارة، مع الحرص على عدم إفراط أو حرق الذيل، ومسحه بمسح الكحول لتمدد الوريد وتعقيم الحقن الحارة.
   3. تصمد الإبرة مع المجسم مشطوف الحواف ومواءمتها مع الاتجاه بزاوية حادة.
   4. طفيفة الضغط لثقب الجلد والمستوى بالإبرة حتى أنها وفقا لهذا السياق.
   5. بلطف دفع بضعة ملليمترات في الماضي المجسم مشطوف الحواف حتى يدخل الإبرة في الوريد.
   6. تأكيد القسطرة في إدارة تدفق المياه المالحة صغيرة (10-20 ميليلتر). يجب ترك المحلول الملحي حقنه بسلاسة ويجب مسح على المنوال. إذا كان يتم ملاحظة أي ضغط المقاومة أو العودة، من المرجح القسطرة ليست في هذا السياق، وينصح بإعادة محاولة كانوليشن. إذا لوحظ تخثر الدم، استخدام الهيبارين (الهيبارين ألف وحدة كل مل المحلول الملحي) للإعداد كانوليشن والتنظيف.
      ملاحظة: قمنا بتقييم كانوليشن مع أو بدون الهيبارين في سلالة الماوس للفائدة، ونظرا للا تخثر الدم لوحظ، المحلول الملحي وحدة كان يستخدم كانوليشنز.
   7. تأمين القسطرة بذيل استخدام قطره صغيرة من الغراء الأنسجة، تليها الشريط الجراحي، لضمان بقاء القسطرة غير متحرك عند نقل الفئران للماسح الضوئي.
   8. إزالة المحاقن دافق من نهاية القسطرة وختم النهاية مع أخف، وضمان أن الباحث ليس القرب من أي إيسوفلوراني أو الإيثانول.
   9. كرر للفئران إضافية 3 حيث تكون جميع الفئران 4 المراد مسحها ضوئياً مقني وإعدادها.
6. بدوره على تدفق التخدير (2.5% إيسوفلوراني، 2 لتر/دقيقة 100% O₂) المرتبطة بالحيوانات الأليفة/CT وعناية الموقف الفئران المعرضة في الماسح الضوئي، ضمان القسطرة تظل في مكان ورئيس كل الماوس مستقيمة وآمنة داخل مخروط الآنف. الشريط الرأس والجسم من كل الماوس إلى السرير مع الشريط الجراحي لينة، ضمان التنفس غير مقيد بوضع الشريط. تسجيل موقف كل الماوس للسماح للموقع الصحيح وتخصيص فريق لتحليل الصور.
7. الحفاظ على الفئران ساخنة طوال فترة الإجراءات (مثلاً باستخدام مصباح الحرارة أو نظام ضخ الهواء الساخن لضمان إبقاء الفئران الحارة دون ارتفاع درجة الحرارة). رصد معدل التنفس لجميع الفئران، أما بصريا إذا الهزال فتح باستخدام، أو من خلال نظام رصد عن بعد استخدام منصات الجهاز التنفسي، وتغيير مستويات التخدير حسب الضرورة.

5-CT اقتناء

1. مجرد الحيوانات آمنة في السرير والتنفس مستقر، تشغيل الليزر عبر الشعر وتحرك فحص سرير وبذلك تتم محاذاتها مع دماغ الفئران الأربعة كافة. تحريك الماسح الضوئي موقف اقتناء (موقف 3) مع الأدمغة الفئران بالقرب من مركز فوف قدر الإمكان.
2. الحصول على صورة عرض الكشفية للفئران للتحقق من مركزها (استخدام فوف 200 ملم)، وضبط الموضع عن طريق سحب مربع فوف على الواجهة إذا لزم الأمر. انقر فوق "بدء تشغيل سير العمل" في برنامج الماسح الضوئي للبدء الأشعة المقطعية، تأكد من تحديد "عرض مطالبة المستخدم التفاعلي" حتى يمكن بدء التفحص الحيوانات الأليفة يدوياً قبل الحقن بالتتبع.

6. [إعداد اتفاق دارفور للسلام-713 الجرعة¹¹ج]

1. توليف [¹¹ج] كما سبق وصف اتفاق دارفور للسلام-713¹²، ضمان أنك ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) للتعامل مع المواد المشعة، بما في ذلك معطف مختبر، والقفازات، وجرعات الإصبع وهيئة الشخصية. تأكد من تغيير القفازات بانتظام لمنع التلوث الإشعاعي، وتزيد المسافة الخاصة بك من المصادر المشعة عندما يكون ذلك ممكناً.
2. استخدام الملقط لنقل القنينة radiotracer وراء درع الرصاص بعناية.
3. إعداد المحاقن الجرعة 0.5 مل لكل الماوس التي تحتوي على حوالي 250-350 µCi/9-13 مبق في حجم 100-200 ميليلتر لضمان جرعة كافية لمسح الحيوانات الأليفة دينامية 60 دقيقة (الجرعة التي تديرها وينبغي تحديد النظر في فترة نصف العمر للنظائر والجدول الزمني تصميم الدراسة، مع أن حجم اعتماداً على وزن الماوس).
4. قياس النشاط باستخدام معايرة جرعات تعيين C-11، يقع بالقرب من الموقع كانوليشن، وتسجيل أوقات القياس وحقن لتمكين تصحيح الاضمحلال. رسم يصل الجرعات قبل سيتم حقن نهايات التصوير المقطعي الحد من التدهور وضمان المستوى المطلوب للنشاط الإشعاعي في كل الماوس.
5. تحقق من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء في حقنه جرعة قبل قياس النشاط وضخ كل الماوس.

7. اقتناء الحيوانات الأليفة

1. بمجرد تقدم الفئران تلقائياً من الأشعة المقطعية للحيوانات الأليفة، قم بإعداد الجزء الخلفي من الماسح الضوئي لحقن [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 (الشكل 1ج). ضع الحشو ماصة واقية على افريز وتأكد من المقص وأخف من ناحية.
2. قص أنابيب القسطرة مختومة مع مقص، والتحقق من القسطرة خطوط واضحة من أي فقاعات، وتأكيد القنية لا تزال ضمن هذا السياق بأداء 10-20 ميليلتر دافق مالحة. تحميل المحاقن الجرعة المقاسة من الخطوة 6، 4 في كل من القسطرة 4، تتبع من الجرعات التي أعطيت لكل الماوس.
3. انقر فوق "موافق" عند الحيوانات الأليفة مسح مستعدة لبدء تشغيل أثناء بدء جهاز ضبط وقت ثانية 10 في وقت واحد. لقد اثنين من الباحثين في الجزء الخلفي من الماسح الضوئي مع الحقن بالجرعة في متناول اليد، لحقن جميع الفئران 4 في وقت واحد على جهاز ضبط الوقت الوصول إلى الصفر. مسح كل قسطرة مع 50-100 ميليلتر من المحلول الملحي (اعتماداً على طول أنابيب القسطرة – أي وحدة التخزين الميت) للتأكد من الجرعة الكاملة يدخل في السياق الذيل، وإعادة ختم الأنابيب مرة أخرى باستخدام أخف.
4. قياس المحاقن جرعة استخدام معايرة جرعات الحصول على قيمة النشاط إشعاعي المتبقي (أي الراسم تركت في المحاقن). يحيط علما بالقيم والوقت أن يتم تسجيلها.
5. بمجرد اكتمال التفحص، المنزل السرير الحيوانات الأليفة إلى الموضع الأصلي باستخدام الزر "الصفحة الرئيسية" الأفقي داخل الحركة لوحة التحكم. قم بإزالة الفئران من الماسح الضوئي وعناية القسطرة. الضغط برفق بموقع كانولاتيون لمنع النزيف.
6. قياس نشاط المتبقية في القسطرة تستخدم معايرة جرعات كما تم وصفه سابقا.
7. إذا كانت الفئران استرداد ضمان ويتم ذلك في بيئة دافئة (مثلاً، في مربع مع وسادة ساخنة تحت أو المحتوية على قفاز مليئة بالماء الدافئ) سهولة الاسترداد. إذا كان التخطيط إلى euthanize الفئران، وضع الفئران في دائرة التعريفي لتحتوي على إيسوفلوراني حتى تظل أنايسثيتيزيد قبل القتل الرحيم عبر التروية.
8. لإعادة بناء البيانات، افتح البرنامج إدارة مرحلة ما بعد المعالجة (انظر الجدول للمواد)، الذي سيتم تلقائياً إعادة بناء كل المسح الضوئي باستخدام الرسم البياني البيانات التي تم إنشاؤها من ملف lst.

8-الدماغ أوتوراديوجرافي

1. قبل التجربة، محو الفيلم أوتوراديوجرافي الرقمية بتعريض الأبيض الضوء لمدة 10-15 دقيقة وتبقى في منطقة خالية من النشاط الإشعاعي حتى الاستخدام.
2. إعداد المحاقن الجرعة 0.5 مل لكل الماوس التي تحتوي على حوالي 1.0-1.5 mCi/37-56 مبق لضمان جرعة كافية أوتوراديوجرافي.
3. قياس النشاط الإشعاعي في المحاقن الجرعة، تستخدم معايرة جرعات، قبل الحقن الحصول قراءة دقيقة للنشاط.
4. كانولاتي كما هو موضح سابقا، وحقن الفئران فورا في منطقة مناسبة للنشاط الإشعاعي.
5. إزالة القسطرة بعد الحقن وقياس الإشعاع المتبقية.
6. ترك الفئران في دائرة التعريفي ساخنة حتى تظل أنايسثيتيزيد قبل التروية والقتل الرحيم.
7. تنفيذ القتل الرحيم بينما هي شدة فظاعتها الفئران (الاستنشاق المستمر من 4% إيسوفلوراني، 2 لتر في الدقيقة 100% O₂) عبر برنامج تلفزيوني نضح والثنائية ثوراكوتومي 30 دقيقة بعد [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 الحقن.
   1. فتح تجويف البطن وقطع طريق الحاجز لفضح القلب.
   2. إدراج إبرة حقن فراشة قسطرة في البطين الأيسر للقلب، وقص الاذين الأيمن والسفلي الوريد الأجوف.
   3. نتخلل ببطء مع برنامج تلفزيوني (~ 20-30 مل) استخدام المحاقن 20 مل.
8. بعناية إزالة الدماغ من الجمجمة باستخدام الملقط، والمقص.
9. مكان الدماغ في العفن تجميد مليئة بالامثل خفض درجة حرارة السائل (OCT)، مما يجعل التأكد من الدماغ مستوى وتركزت داخل القالب، مع المصابيح شمي الموجهة نحو الشقوق في القالب (لتقديم المعالم والتوجه مرة واحدة في الدماغ تتم إزالة من العفن).
10. مكان العفن في الثلج الجاف لمدة 10-15 دقيقة أو حتى يصبح OCT معتمة.
11. فورا بوضع كل العفن في مجموعة مبضع كريوستات إلى-18 درجة مئوية، وحجته لمدة 10 دقائق قبل التركيب.
12. قشر بعيداً من العفن التجميد وجبل الدماغ إلى منصة مبضع باستخدام كمية صغيرة من أكتوبر الطازجة ك "الغراء".
13. ترك الدماغ المحملة في مبضع لتجميد لمدة 2 دقيقة.
14. شريحة من خلال الدماغ حتى موقع السكتة الدماغية المكشوفة (أي العائد على الاستثمار). استخدام صورة السيد لتحديد مكان احتشاء داخل الدماغ كل حيوان. دمكاو، وهذا ينبغي أن يكون دائماً في قشرة سوماتوسينسوري؛ ومع ذلك، قد تختلف طول الحد قليلاً.
15. قسم المنطقة الدماغ التي تغطي احتشاء، وضع 20 ميكرومتر سميكة المقاطع على الزجاج مجهر منزلقات المسمى بالعدد المناسب الماوس.
16. فتح كاسيت autoradiography وخط أسفل الكاسيت بورقة واحدة من التفاف ساران. ترتيب الشرائح القسم الجانب الأعلى على رأس التفاف ساران في الكاسيت، وتحيط علما بموقف كل شريحة. بشكل اختياري، تأخذ صورة لموضع الشرائح للمساعدة في تحليلها في وقت لاحق.
17. بلطف ضع طبقة أخرى من التفاف ساران في الأعلى (بعد انتظار ~ 2 دقيقة بعد جمع القسم الأخير من الدماغ-يسمح لها الجاف والتقيد بالشريحة) ثم ضعه بعناية الفيلم autoradiography الرقمية (أسفل الجانب الأبيض) أعلى الشرائح.
18. إغلاق الكاسيت محكم ويترك في ثلاجة-20 درجة مئوية، السماح للفروع إلى الاضمحلال في الفيلم لوقت تعرض كافية (~ 5-10 إنصاف).
19. مسح الفيلم بعد وقت التعرض باستخدام تصوير فوسفور لتوليد صورة رقمية للتحليل اللاحق.

9-تحليل صورة الحيوانات الأليفة ديناميكية

1. فتح برنامج تحليل الصور (انظر الجدول للمواد)، وانقر فوق الرمز "فتح البيانات" لتحميل صورة الأشعة المقطعية (كالمصدر) والرمز "إلحاق بيانات" لتحميل الحيوانات الأليفة الحيوية (كالمرجع).
2. القيام مراقبة الجودة بصرية للبيانات عن طريق المشغل السلاسل الزمنية في القائمة المنسدلة: حدد مرجع ("المرجع") و "العالمية" وتنطبق المناسبة min و max لمقياس اللون. تصور البيانات الديناميكية الحيوانات الأليفة الإطار حسب الإطار، التحقق من امتصاص النشاط الإشعاعي والتحقق من وجود أي اقتراح يفند ضمن المسح الضوئي.
3. إنشاء صورة الحيوانات الأليفة متوسط استخدام "عامل التشغيل الحسابي".
   1. اختر "تحديد المتوسط"، وإلغاء "المرجع" وضمان الإدخال 1 ("Inp1")، وإدخال 2 ("Inp2") وستار الإدخال ("البرنامج النووي العراقي" *-يشمل بقية الإطارات الحيوانات الأليفة في المسح الضوئي) هي المحدد لإنشاء كافة الإطارات الحيوانات الأليفة في متوسط.
   2. انتقل إلى علامة التبويب "إدارة البيانات" (مارك ألماني) واسحب الصورة متوسط يصل إلى موقف "input1" لأغراض التصور. توزيع مقياس اللون بالنقر فوق الحساب التلقائي في الأداة "دقيقة-ماكس".
4. سجل CT إلى ملف الحيوانات الأليفة متوسط استخدام الدالة "3D التلقائي" في القائمة المنسدلة "orientation إعادة والتسجيل النهائي".
   1. حدد "المرجع" و "Inp1"، واختر "جامدة"، "سريع"، "Inp1 للمرجع" التسجيل. التحقق بصريا من التسجيل في جميع أبعاد 3 وضبط يدوياً إذا لزم الأمر في علامة التبويب "دليل 3D" استخدام المهام "ترجمة" و "التناوب".
   2. عندما راضية عن التسجيل، حدد "Inp2" و "البرنامج النووي العراقي" *، وتنطبق على جميع الحيوانات الأليفة الإطارات بواسطة النقر فوق علامة الاختيار. انقر على الحق في الملفات الأشعة المقطعية والحيوانات الأليفة في إدارة الشؤون الإدارية وحفظ كالخام.
5. المحاصيل في الدماغ واحدة بالماوس في وقت واحد لتحليل المخ باستخدام الأشعة المقطعية كدليل: حدد "الاقتصاص" من القائمة المنسدلة-لأسفل واسحب حدود الصورة لاقتصاص رأس الماوس أدناه جذع الدماغ. إعادة توجيه صور الحيوانات الأليفة والتصوير المقطعي باستخدام وظيفة "إعادة التوجيه اليدوي 3D" كما هو موضح أعلاه حيث يكون الجمجمة مباشرة في جميع الأبعاد.
6. تحميل صورة السيد لأن الماوس (في تنسيق DICOM) باستخدام الزر "إلحاق بيانات" في الجزء العلوي الأيسر من الواجهة. نقل السيد استخدام "إعادة توجيه 3D اليدوي" ويصلح للجمجمة داخل صورة الأشعة المقطعية (تأكد من جميع الطرائق في نفس الاتجاه).
7. رسم المخ دوروا على السيد الصورة باستخدام "أداة دوروا 3D".
   1. إيقاف التصور الحيوانات الأليفة بإلغاء التحديد من ضمن علامة التبويب التحكم البصرية (VC) واستخدم فقط السيد والأشعة المقطعية لرسم العائد على الاستثمار.
   2. انقر فوق الزر على إضافة عائد الاستثمار "لإنشاء عائد جديد وتسميته" احتشاء ". حدد "أداة المفتاح"، غادر النقر لرسم الحدود العائد على الاستثمار، وفوق الحق في إغلاقه.
   3. تكرار خلال كافة شرائح تشمل السكتة الدماغية، مع التأكد من عدم القبض على أي من الجمجمة في العائد على الاستثمار، مع أفضل الممارسات إلى ترك فجوة فوكسل بين الحدود الجمجمة والسكتة الدماغية العائد على الاستثمار.
8. توليد عائد contralateral استخدام حجم احتشاء.
   1. إنشاء عائد جديد وتسميته "كونترالاتيرال". انقر على الحق في "عائدات الاستثمار احتشاء" وحدد "تصدير". اسحب العائد على الاستثمار إلى موقف 2 ("Inp1").
   2. مع فقط "Inp1" المحدد، تطبيق الوجه الصحيح يسار باستخدام الدالة "المشغل" ضمن القائمة "توجيه والتسجيل". وضع علامة في المربع "عائد الاستثمار"، اختر "العرض فقط"، ونقل العائد على الاستثمار الجديد يدوياً إلى منطقة مماثلة على الجانب كونترالاتيرال. حدد عامل التشغيل "الحساب" وتنطبق تكاثر عددي 2 دوروا جديدة، تسمح بالقياس الكمي المستقل من رويس.
   3. العودة إلى أداة دوروا ثلاثية الأبعاد. انتقل إلى علامة التبويب "الخبراء والتجريبية" وانقر فوق الزر "استيراد العائد على الاستثمار". حدد Inp1 من مربع الحوار تحميل وحدة التخزين الجديدة ك contralateral دوروا.
9. انقر على الحق في الصورة الأليفة متوسط وتحميل عليه وإعادة تشغيل الحيوانات الأليفة. توليد النتائج امتصاص الكمية باستخدام الرمز "تصدير نتائج" داخل الأداة دوروا 3D.
10. إجراء تحليل الدماغ تقسيم إضافي إذا رغبت في ذلك (أي، الآلي دوروا الجيل الحق مقابل مناطق نصف الكرة الدماغ الأيسر استخدام وحدة نمطية البرنامج المساعد أطلس الدماغ ماوس 3D للبرمجيات فيفوكوانت).
    1. إعادة تحميل الصور PET/CT المسجلة.
    2. استيراد أطلس الدماغ الماوس بالنقر على القائمة "وحدات متقدمة" وتحديد أداة أطلس الدماغ ثلاثي الأبعاد. حدد "كافة المناطق يمين/يسار" في "إعدادات متقدمة" وانقر فوق "تشغيل" لاستيراد 3D أطلس.
    3. يدوياً تناسب الأطلس داخل المخ باستخدام الجمجمة كحدود.
    4. إعادة تشغيل أطلس التأكد من أن "استيراد دوروا 3D" محدداً لإنشاء جدول بيانات النتائج لجميع رويس نصف الكرة الأيمن والأيسر 14 (لب، المخيخ، midbrain، بونس، اللحاء، الحصين، المهاد، تحت المهاد، المخطط، المكورة، والمصابيح شمي، كلثوم الإحضار والمسألة الأبيض).
11. قياس الامتصاص الراسم في الطحال باستخدام الماسح الضوئي يعمل البرنامج (انظر الجدول للمواد).
    1. تحميل ملفات صور الحيوانات الأليفة والتصوير المقطعي بتمييزها في قاعدة بيانات والنقر على "التحليل العام".
    2. انقر فوق علامة التبويب تسجيل واشترك سجل صور الحيوانات الأليفة والتصوير المقطعي النقر على أيقونة "تسجيل جامدة".
    3. انقر فوق علامة التبويب تحديد مقدار العائد على الاستثمار، وانقر على أيقونة "إنشاء العائد على الاستثمار" وتسميته الطحال.
    4. اختر أداة "المجال" رسم الطحال رويس باستخدام الملف الأشعة المقطعية للرجوع إليها، ضمان وجود أي تداخل مع الإقبال الكلي (باستخدام صورة الحيوانات الأليفة وإشارة لتجنب تسرب من الكلي).
    5. تحرير رويس للحفاظ على حجم العائد على الاستثمار متسقة بين الحيوانات.
12. حساب قيمة تصحيح قياسي للإقبال على التطبيع.
    1. تحميل بيانات PET/CT من الفحص القياسية وإنشاء اسطوانة دوروا يشمل محقنة 20 مل باستخدام أداة "دوروا 3D اليدوي".
    2. الحصول على مستوى النشاط الإشعاعي الواردة ضمن معيار استخدام الرمز جدول البيانات.
    3. استخدم هذه النتيجة nCi/cc والإشعاع المسجل الأصلي للمعيار (أي، قياس معايرة الجرعات القياسية في لجنة التحقيق الوطنية/cc) لإنشاء عامل تصحيح لقيم امتصاص الحيوانات الأليفة. فتقسيم النشاط إشعاعي القياسية المسجلة بمعايرة الجرعات بالنشاط الإشعاعي محسوبة من صورة الحيوانات الأليفة القياسية.
13. تستخدم الأنشطة الجرعة والوقت من القياسات لاضمحلال الصحيح إلى الوقت لاقتناء الحيوانات الأليفة لجميع الفئران (أي حساب النشاط الجرعة في بداية الفحص PET).
14. تكرار القيم المتبقية واستقطاع من الجرعة تسوس المصوبة لحساب النشاط الدقيق كل الحيوانات الواردة.
15. بعد تطبيق هذا التصحيح للانحلال، أيضا تطبيق التصحيح القياسي للتأكد من البيانات يتم على مستوى النشاط الصحيح. ضمان تطبيق هذه التصحيحات إلى النتائج ROI مرسومة يدوياً، والدماغ أطلس دوروا مناطق الدماغ ذات الصلة البيانات لموقع دمكاو (أي، اللحاء، والحصين والمخطط).
16. حساب في %ID/g لجميع رويس باستخدام المعادلة التالية: %ID/g = (ROI النشاط الإشعاعي في لجنة التحقيق الوطنية/cc/تسوس المصوبة بالجرعات الواردة في لجنة التحقيق الوطنية/cc) x 100. ارسم %ID/g كدالة للوقت باستخدام الرسوم البيانية برنامج لإنشاء منحنيات النشاط الوقت لكل عائد الاستثمار.
17. استخدم برنامج الماسح الضوئي لتوليد التصور والشكل في الصورة النهائية. تطبيع الصور وفقا للجرعة المصوبة تسوس تلقاها كل الماوس في وقت المسح، ضمان جميع الصور على نفس النطاق %ID/g.
    ملاحظة: وهذا ضروري لتمكين مقارنة دقيقة للصور من الفئران مختلفة و/أو الصور من دراسات أجريت في أيام مختلفة

10-أوتوراديوجرافي تحليل الصور

1. فتح الصورة الرقمية (ملف.gel) في برنامج إيماجيج. ضبط السطوع والتباين لعتبة بصريا الصورة وتنطبق لون مناسب "جدول البحث".
   ملاحظة: يشبه الملكي الأكثر دقة مقياس اللون المستخدمة في التنسيقي
2. استخدم إدارة العائد على الاستثمار لرسم رويس يدوياً حول احتشاء ومناطق كونترالاتيرال المقابلة.
3. استخدم الدالة مقياس لقياس كثافة بكسل يعني كل عائد الاستثمار وتصدير النتائج. رسم باستخدام البرمجيات الإحصائية.

النتائج

الفئران خضع للتصوير بالرنين المغناطيسي للتأكد من نجاح السكتة الدماغية، و [¹¹ج] أجرى اتفاق دارفور للسلام-713 "الحيوانات الأليفة" بتفحص الفئران 4 في وقت واحد. الحيوانات الأليفة، والتصوير المقطعي، وصور السيد كانت المشاركة المسجلة قبل رسم المخ رويس يدوياً والقيام بتحليل أطلس الدماغ انقسام شبه الآلية، للتحقيق في امتصاص الراسم في منطقتي عن كونترالاتيرال (الشكل 2).

صور الحيوانات الأليفة/CT ووقت النشاط المنحنيات (نشاط radiotracer صيدها كدالة للزمن) عرض زيادة [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 الإقبال في عن مقابل contralateral نصفي الكرة الأرضية (الشكل 3أ). التحديد الكمي للحيوانات الأليفة ديناميكية الدماغ الصور، باستخدام جمع البيانات من 50-60 دقيقة، كشفت عن زيادة كبيرة في الراسم امتصاص (% معرف/g) في عن (إينفاركتيد) مقارنة بنصف الكرة الغربي كونترالاتيرال في دمكاو، ولكن ليس في الفئران الشام مرسومة يدوياً باستخدام النهج العائد على الاستثمار (الشكل 3ب). كما لوحظ زيادة الإقبال في نصف الكرة الغربي عن بين الفئران دمكاو والشام. لم يلاحظ أي اختلافات كبيرة بين نصفي الكرة الأرضية، وكونترالاتيرال عن استخدام نهج نظام أطلس، يرجح أن سبب هذا الأطلس رويس يجري أكبر من حجم احتشاء (عادة ما تكون مقيدة لقشرة سوماتوسينسوري)، وبالتالي إضعاف إشارة. ومع ذلك، لوحظ عموما الإقبال المتزايد في دمكاو مقارنة بالشام لجميع رويس، الذي ينسجم مع التقارير السابقة باستخدام ماكاو نموذج الفئران، مما يدل على زيادة التعبير تسبو في مناطق خارج احتشاء¹⁹. وزيدت نسب عن/كونترالاتيرال في دمكاو مقابل الشام الفئران باستخدام كلا النهجين؛ ومع ذلك، هذا الفرق مهم فقط في القشرة باستخدام نهج نظام أطلس الدماغ بسبب تباين أكبر في النهج العائد على الاستثمار. يمكن التغلب على هذا عن طريق زيادة عدد الفئران في كل مجموعة. أظهر التقدير الكمي للإقبال على اتفاق دارفور للسلام-713 [¹¹ج] في الطحال لا توجد اختلافات كبيرة بين المجموعات (الشكل 4).

وأكد الدماغ الماوس دمكاو الحيوانات الأليفة نتائج التصوير السابقين فيفو عالية الدقة الرقمية أوتوراديوجرافي (الشكل 5). ولم يلاحظ زيادة [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 امتصاص في الأنسجة إينفاركتيد مع إشارة ضئيلة في أنسجة المخ السليمة المحيطة. كوانتيتيشن من هذه الصور كشفت عن نسب contralateral تتراوح من 1.4 إلى 2.09 في الفئران دمكاو.

رقم 1: الحيوانات الأليفة الماسح الضوئي وإنشاء مساحة العمل- كافة مساحات العمل مشمولة في الحشو واقية ماصة لخلق بيئة معقمة. (أ) بعد معايرات، تم تأمين سرير ماوس طباعة 3D، مجهزة للتصوير 4 الفئران في وقت واحد في الماسح الضوئي والمخروطات لجميع الفئران 4 المرفقة للتخدير. (ب) المعدات اللازمة لتصوير الحيوانات الأليفة أعدت مسبقاً، بما في ذلك القسطرة ز 27.5 مملوءة بالمياه المالحة وتشحيم العين، مسحات الإيثانول، ومصابيح الحرارة، الشريط الجراحي، الغراء الأنسجة، 0.5 مل جرعة محاقن، مقص وأخف وزنا. (ج) لحقن راديوتراسير، مكان الحقن تدفق المياه المالحة ومقص في الجزء الخلفي من الماسح الضوئي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: دوروا عن/Contralateral واليمين/اليسار-تقسيم نصف الكرة الدماغ عملية تحليل الصورة الأليفة أطلس- استخدمت برامج لتحديد استيعاب التتبع في مناطق كونترالاتيرال وعن الفائدة (رويس) يدوياً باستخدام تحليل الصور رسمها رويس واتباع نهج شبه الآلي 3D أطلس سبليتبرين. وتم التسجيل التلقائي PET/CT 3D متبوعاً بالتسجيل اليدوي للدماغ بالرنين المغناطيسي داخل الجمجمة الماوس المقابلة المحددة في صورة الأشعة المقطعية. استخدمت أداة دوروا ثلاثية الأبعاد لرسم يدوياً عن (أحمر) وكونترالاتيرال رويس (الأخضر) باستخدام احتشاء في التصوير بالرنين المغناطيسي كمرجع. للنهج سبليتبرين، تحميل أطلس الدماغ الماوس اليسار/اليمين--تقسيم ثلاثي الأبعاد وتركيبها داخل الجمجمة حسب تعريف الصورة CT. وشملت رويس الدماغ المستخدمة للقياس الكمي في هذا الأطلس الدماغ ماوس 3D اليسار اللحاء (رمادي داكن) واليسار الحصين (رده الذرة الزرقاء) واليسار المخطط (الوردي العميق)، حق القشرة (البندورة الحمراء)، حق الحصين (الأخضر) وحق سترياتيوم (سماوي). الإقبال على [¹¹ج] تم الحصول عليها في لجنة التحقيق الوطنية/cc 713 اتفاق دارفور للسلام في كل المنطقة وتم تحويلها بعد ذلك إلى %ID/g بتطبيع للجرعة تسوس تصحيح وقت المسح الضوئي لكل الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : الممثل في فيفو [¹¹ج] امتصاص الدماغ 713 اتفاق دارفور للسلام في دمكاو والفئران الشام. (A) الصور الديناميكية PET/CT وصيدها إثبات زيادة [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 الإقبال في القشرة عن الفئران التي خضعت دمكاو (n = 3) وزيادة طفيفة للشام (n = 3) تعمل الفئران، مع الفئران دمكاو مما يدل على أكبر بكثير التباين في نسبة حقن جرعة بين احتشاء والجانب كونترالاتيرال من الدماغ (%ID/g). (ب) كشف الحيوانات الأليفة الكمي (50-60 دقيقة قد لخص) امتصاص الزيادة الكبيرة في العائد على الاستثمار عن استخدام النهج العائد على الاستثمار وفي القشرة (Ctx) باستخدام نهج نظام أطلس سبليتبرين. تم العثور على لا اختلافات كبيرة في قرن آمون (HC) أو المخطط (Str). وشوهدت زيادة نسب عن إلى كونترالاتيرال باستخدام كل من التحليل والنهج لكن فقط معتدا به إحصائيا في Ctx استخدام نهج نظام أطلس الدماغ. * (ف < 0.05)، * * * (ف < 0.001) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4 الرقم: الممثل في فيفو [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 الطحال الإقبال في دمكاو والفئران الشام. (أ) [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 دينامية PET/CT الصور تظهر الطحال رويس في دمكاو (n = 3) والشام (n = 3) الفئران. (ب) تبين النتائج الكمية لا نتائج هامة في امتصاص الطحال بين الفئران دمكاو والشام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : الممثل Autoradiography النتائج. إظهار الصور الرقمية autoradiography زيادة [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 الإقبال في عن مقارنة بنصف الكرة كونترالاتيرال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

البروتوكول قدم وصف أسلوب للتقدير الكمي نيوروينفلاميشن في الفئران دمكاو والشام [¹¹ج] باستخدام اتفاق دارفور للسلام-713-التنسيقي الحيوانات الأليفة تسبو هو العلامات البيولوجية التصوير التحقيق الأكثر انتشارا لتصور وقياس neuroinflammation في فيفو حتى الآن. التعبير تسبو أوبريجولاتيد على إطلاق في الدماغ أثناء التهاب تسمح بالكشف غير الغازية والتحديد الكمي ل neuroinflammation. وعلاوة على ذلك، وأسلوب ترجمة العالية، يجعلها أداة قيمة في البحوث السريرية وقبل السريرية على حد سواء. هذا البروتوكول والنتائج الممثل تسليط الضوء على مدى ملاءمة استخدام [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 "الحيوانات الأليفة" لكشف ورصد التعديلات نيوروينفلاماتوري في المخ وغيرها من الاضطرابات العصبية في الجسم الحي.

في هذه الدراسة، أجريت جراحة دمكاو باستخدام الفئران الإناث C57BL/6 عمره 3 أشهر. واختير هذا النموذج كما أنه يؤدي إلى احتشاء استنساخه بدرجة عالية يقتصر على قشرة somatosensory، تقديم نموذج الاسكيمية التنسيق الدائم مع تقلب منخفض مقارنة بنماذج أخرى للسكتة الدماغية (مثلاً، الأوسط الدماغي الشرياني أسلوب الشعيرة انسداد (ماكاو))¹⁴. ويمتاز تصوير الحيوانات الأليفة من نماذج السكتة الدماغية التي تحتوي على منطقة مرجع داخلي في الدماغ لكل الحيوانات باستخدام رويس داخل نصف الكرة الغربي كونترالاتيرال. نظراً لأنه سيكون هناك بعض الالتهابات أن النتائج من الجراحة وحدها، من المهم أن تشمل الفئران التي أجريت له عملية جراحية الشام في تصميم الدراسة، حيث اوديما وأنجز التلاعب بالسحايا دون انسداد الشريان. اوديما وحدها يمكن أن يسفر عن اختلال الأنسجة العصبية الكامنة والأخذ بمسببات الأمراض المؤدية إلى الاستجابات المناعية مستقلة عن السكتة الدماغية²⁰. بعض التهاب بعد الجراحة شام فمن المتوقع، وينبغي أن تقيم بالتوازي مع دمكاو لاستبعاد إمكانية إشارة بسبب جراحة وحدها. لتجنب بما في ذلك الالتهاب الناتجة عن الجراحة دون السكتة الدماغية في التحليل المرتكز على المجموعة دمكاو، يجب أن تجري MR التصوير لتأكيد التنمية الناجحة السكتة الدماغية جراحة واحتشاء. التصوير بالرنين المغناطيسي كما يوفر إطار مرجعية هيكلية، وهو أمر ضروري لدقة رسم احتشاء ورويس contralateral. بالإضافة إلى ذلك، معالجة الصور دقيقة بما في ذلك تسجيل الصورة وتعريف دوروا ضرورية لضمان موثوقية القياس الكمي.

قيود إضافية يجب أن يوضع في الاعتبار عند العمل مع C-11 المسمى راديوتراسيرس لدراسات الحيوانات الأليفة وأوتوراديوجرافي. لا بد من النظر نصف عمر قصيرة (20.33 دقيقة) C-11، مع استخدامه عموما تقتصر على البحوث معاهد مع وصول سيكلوترون في الموقع. مسار النقل النشاط الإشعاعي المناسبة والجرعة الإدارة واكتساب الوقت-نقاط يجب أن تحدد مسبقاً مع خطة مفصلة معدّة سلفا لسير العمل للتجربة حيث أن الفريق يمكن أن يعمل بسرعة وكفاءة. تصميم وإعداد هذه الدراسة وضعت لاستيعاب تصوير فئران 4 في نفس الوقت لزيادة إنتاج البيانات التي يمكن الحصول عليها عند استخدام تتبع C-11. إذا كان ذلك ممكناً، فإنه من المستحسن أن يكون جميع الفئران مقني وفي منتصف تلك الأشعة المقطعية بحلول الوقت الذي يصل الراسم C-11 في مرفق التصوير لضمان تسوس راديوتراسير الحد الأدنى قبل الحقن. هذا البروتوكول خطوة بخطوة تجري أيضا أفضل فريق يحتوي على الباحثين 3 على الأقل للسماح ل cannulation سريعة وقياس الجرعات وحقن الراسم، المسح الحيوانات الأليفة وتمزيقها الدماغ قبل الانحلال الإشعاعي كبيرة. فهو يتطلب شخصين لإجراء بدء التفحص الحيوانات الأليفة وحقن الفئران 4 جميع في وقت واحد. والسبب ابتداء من اقتناء الحيوانات الأليفة فقط قبل الحقن ضمان الدوائية وديناميات توزيع الراسم في الدم والمناطق ذات الاهتمام بدقة وتماماً الملتقطة. قد يتطلب العديد من الخطوات النشطة من التدريب والممارسة لضمان التشغيل السلس للتجربة. على وجه الخصوص، هذا البروتوكول لا تعتمد على ذيل ناجحة المنطلق cannulation الفئران C57BL/6، الذي يمكن أن يكون صعباً بسبب الظلام الشعر موجودة على ذيولها، وقد أصبحت أكثر صعوبة بعد حدوث السكتة الدماغية، أو إذا كان التصوير نفس الفئران في نقاط زمنية متعددة .

وهناك اعتبار آخر لتصوير الحيوانات الأليفة يتضمن تسجيل دقيق راديوتراسير الجرعة وبقايا نشاط القياسات، بما في ذلك الموعد المحدد لقياس. هذا أمر ضروري لتصحيح الاضمحلال دقيق من الجرعة حقنه في وقت المسح الضوئي ويستخدم للحصول قياس دقيق لامتصاص الراسم (أي % معرف/ز) كل عائد الاستثمار. لا بد من معرفة المبلغ المحدد للنشاط الإشعاعي الذي كان حاضرا في كل الماوس في وقت المسح الضوئي لضمان تحليل صورة دقيقة. ولذلك، فمن المستحسن لمزامنة الساعات على الكمبيوتر الماسح الضوئي ومعايرة الجرعة لتجنب الخطأ عند استخدام النظائر المشعة قصيرة العمر مثل C-11.

أيضا يمكن أن تكون محدودة محبوبة دقة الصورة القياس الكمي بدقة الماسح الضوئي والتشكيل. ومن ثم من المهم لضمان دقة القياس الكمي للصور PET/CT، القيام بعمليات تفتيش مراقبة الجودة لمكونات كل من الأشعة المقطعية والحيوانات الأليفة من الماسح الضوئي. وتشمل ضوابط مراقبة الجودة CT تكييف مصدر الأشعة السينية والظلام/الضوء، ومركز قبالة التحديدات تعيين. قياس هذه التحديدات والصحيح لنظام الضوضاء، ويجب أن تكون قبل تنفيذه لاقتناء كما الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للماسح الضوئي. وينبغي أيضا إجراء معايرات للماسح الضوئي الحيوانات الأليفة. وهذا عادة ما ينطوي على مسح تفحص "ستاندرد/الحيوانات الأليفة الوهمية"، التي تحتوي على تركيز معلوم من النشاط الإشعاعي. عند إعداد المعايير، فمن الأفضل استخدام النظائر المشعة نفسها المستخدمة في الدراسة، وجرعة مماثلة لتلك التي تديرها لماوس واحدة في حجم مماثل للجسم على فأرة الحاسوب، والحصول على نفس المعلمات كتصوير الحيوانات. يستخدم 20 مل حقنه مليئة راديوتراسير المخفف في الماء للمعيار في هذا البروتوكول، مع نتائج التصوير PET اللاحقة المستخدمة لحساب عامل تصحيح استناداً إلى الجرعة الفعلية التي تقاس بكاشف معايرة. يمكن تطبيق نسبة التصحيح لتصوير البيانات المكتسبة من التجربة لضمان دقة القياس الكمي لامتصاص الراسم في المناطق ذات الاهتمام في صور الحيوانات الأليفة. وهذا يفسر نطاق البوزيترون النويدات المشعة بالإضافة إلى النظر في أي نشاط الخلفية هذا اليوم للمسح الضوئي. كما معايرة الجرعات جزءا لا يتجزأ من الجيل من هذا عامل التصحيح، يتحتم أن يتم أيضا معايرة هذه المعدات بصورة منتظمة طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

عند إجراء السابقين فيفو أوتوراديوجرافي من المهم اختيار نقطة وقت أمثل للقتل الرحيم بعد الحقن، لضمان ارتفاع إشارة-إلى-خلفية في region(s) للفائدة. ثلاثين دقيقة بعد حقن تم اختياره ل autoradiography اتفاق دارفور للسلام-713 [¹¹ج] باستخدام البيانات التي يحصل عليها من خلال تصوير الحيوانات الأليفة دينامية--أي في فيفو صيدها الحيوية كدليل، بينما تنظر أيضا في فترة نصف العمر القصير C-11 والوقت يشارك الفرع وفضح أنسجة المخ بعد الاستخراج. ونظرا لهذا، يجب أن يتم [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713 autoradiography على مجموعة منفصلة من الفئران للسماح بحقن جرعة اتفاق دارفور للسلام-713 [¹¹ج] أعلى ومدة 30 دقيقة وقت نقطة التروية والقتل الرحيم تحت التخدير. أداء صغيرة في فيفو محبوبة الدراسة التجريبية مع فئران 3-4 قبل إجراء السابقين فيفو أوتوراديوجرافي سوف تكون مفيدة لتحديد نقطة الوقت الأمثل أوتوراديوجرافي. وهناك اعتبار آخر السابقين فيفو أوتوراديوجرافي ما إذا كان استرداد الفئران بعد الحقن أو الاحتفاظ بها تخديره حتى القتل الرحيم. إبقائها على تخديره يحاكي ظروف الفحص ويضمن حركية التوزيع أو إفراز راديوتراسير لا تتغير بالانتعاش. وعلاوة على ذلك، يمنع هذا ضغوطا إضافية على الفئران عن طريق تجنب الاسترداد وتحريض اللاحقة. وأخيراً، سيكون إضافة مفيدة للبروتوكول السابقين فيفو لتقييم الأضرار الإقليمية في الدماغ الشرائح المستخدمة ل autoradiography عبر المناعي تلطيخ (بعد الانحلال الإشعاعي) لإنشاء صورة ذات دقة عالية لموقع احتشاء و وحدة التخزين.

كما توجد قيود بالاستخدام التتبع C-11 على أساس، يمكن بسهولة تعديل هذا البروتوكول للاستخدام مع F-18 (نصف دقيقة 109.77) على أساس تسبو الراسم، التي قد تكون أكثر انطباقاً على المواقع دون سيكلوترون في الموقع. بالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعة التصوير 4-الماوس. على الرغم من أن هذا الأسلوب ارتفاع الإنتاجية الأمثل عند استخدام تتبع C-11، يجوز تعديل هذا البروتوكول أيضا لأولئك الذين يستخدمون التصوير أسرة واحدة بالماوس. تخطيط دقيق ومتسق التدريب على تقنيات المبينة في هذا البروتوكول سيؤدي إلى توليد ثروة بيانات باستخدام [¹¹ج] اتفاق دارفور للسلام-713، التي يمكن تطبيقها بسهولة على التحقيق في دور نيوروينفلاميشن في مظاهر المرض و التدرج في نماذج أخرى القوارض من الاضطرابات العصبية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم الاستجابة في فيفو للمداواة immunomodulatory تستهدف microglia/الضامة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inveon PET/CT scanner	Siemens	Version 4.2
MRI scanner	Varian		7 Telsa
ParaVision software	Bruker	Version 6.0.1	MRI operating software
VivoQuant software	InVicro	Version 2.5	Image analysis software
Inveon Research Workspace software	Siemens	Version 4.2	Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Butterfly catheters	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G needle
1 mL syringes	BD
Insulin syringes	BD	329461	0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe	VWR	BD302831	BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Heat lamp	Fluker	27002	5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline	Pfizer	00409-4888-10	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets	ThermoFisher Scientific	1420662	Disposable absorbent padding
Iris scissors	World Precision Instruments	503708-12	11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape	3M Durapore	1538-0	1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed	In house		4 mouse PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Compressed gas
Autoradiography cassette	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film	GE Life Sciences	28-9564-78	Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades	ThermoFisher Scientific	30-508-35	MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome	Microm		HM 550
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid	VWR	25608-930	Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds	Poly sciences	18646A-1	Disposable paraffin molds
Saran wrap	Saran	25700001300
Disinfectant	Virkon S