ПЭТ томография Neuroinflammation с помощью ДПА-713 [11C] в мышиной модели ишемического инсульта

Резюме

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) изображений вступают белков 18 кДа (TSPO) предоставляет неинвазивные средства для визуализации динамичную роль neuroinflammation в развитии и прогрессировании заболеваний головного мозга. Этот протокол описывает TSPO-PET и ex vivo авторадиографии для обнаружения neuroinflammation в мышиной модели ишемического инсульта.

Аннотация

Neuroinflammation является центральным элементом патологических Каскад, после ишемического инсульта. Неинвазивная молекулярной визуализации методы имеют потенциал для обеспечения критической понимание временной динамики и роль некоторых neuroimmune взаимодействий в ход. В частности позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) изображений вступают белков 18 кДа (TSPO), маркером активированных Микроглия и периферийные клетки миелоидного линии, предоставляет средства для обнаружения и отслеживания neuroinflammation в естественных условиях. Здесь мы представляем способ точно подсчитать с помощью neuroinflammation [¹¹C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([¹¹C] ДПА-713), перспективным второго поколения TSPO-PET радиоиндикаторных, в дистальной средней мозговой артерии окклюзии (dMCAO) по сравнению с приводом Шам мышей. МРТ был пост dMCAO хирургии выполненных 2 дней для подтверждения инсульта и определить расположение инфаркте и объем. ПЭТ/компьютерная томография (КТ) изображений была проведена 6 дней пост dMCAO для захвата пик увеличение уровней TSPO, после инсульта. Был проведен количественный PET изображений для оценки поглощения [¹¹C] ДПА-713 в головном мозге и селезенке dMCAO и Шам мышей для оценки Центральной и периферической уровень воспаления. В естественных условиях [¹¹C] ДПА-713 мозга поглощение было подтверждено с помощью авторадиографии ex vivo .

Введение

Инсульт является пятой по значимости причиной смерти и одной из основных причин инвалидности в Соединенных Штатах¹. Ишемический инсульт представляет собой подавляющее большинство этих случаев (~ 87%), происходит, когда есть локализованные нарушения кровообращения головного мозга (например, сгусток крови или отложения). Впоследствии снижаются поставки кислорода и питательных веществ в пострадавшие районы и сложный патологический Каскад инициируется, приводящих к смерти нейронов в ядре инсульта (инфаркт) в дополнение к окрестностям. Neuroinflammation является одним из важнейших компонентов в путь, ведущий к этот ущерб, с обоих резидентов мозга иммунных клеток (микроглии) и проникновения периферийные клетки иммунной системы (нейтрофилов, Т-клетки, лимфоцитов и моноцитов/макрофагов) считается, что способствовать этому деструктивные Каскад^2,3. Центральное место в этой neuroinflammatory ответ, с сообщения о вредных и полезных эффектов, после ишемического инсульта²активированный Микроглия и макрофагов. Таким образом крайне важно оценить вклад в естественных условиях этих клеток после инсульта.

ПЭТ является мощным 3-мерной молекулярной визуализации метод, который позволяет визуализации биологических процессов в естественных условиях с использованием конкретных молекул, помечены Позитрон (β +) излучающих радионуклидов ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O и ¹⁸ф Этот неинвазивный метод имеет много преимуществ над ex vivo методы (например, иммуногистохимия) как он разрешает приобретение молекулярной информации в режиме реального времени, в живых субъектов и нетронутыми и позволяет для продольного исследования. ПЭТ томография TSPO, маркером активированных Микроглия и периферийные клетки миелоидного родословную, предоставляет средства для количественной оценки и отслеживания ответов innate иммунных клеток в теле и может быть использован для оценки воспаление после инсульта и ответ на терапевтические вмешательства. TSPO, ранее известный как рецепторов бензодиазепина периферической типа, является 18 kDa белок, который считается играть определенную роль в транспорт холестерина и синтез neurosteroids⁴. Кроме того данные свидетельствуют о том, что TSPO участвует в neuroinflammation и выживаемость нейронов^5,6, с докладами более выражения многих неврологических расстройств, связанных с воспалением, включая инсульт⁷, Деменция⁸, болезнь Паркинсона⁹ и рассеянный склероз¹⁰. TSPO расположен на наружной мембраны митохондрий и высоко выражается в периферии, особенно в стероидных связанных тканях (например, желез) и с промежуточными уровнями, видели в сердце, почках и легких¹⁰. Однако в здорового мозга, TSPO уровни являются низкими и главным образом ограничивается глии^6,11. После нейронных травмы, например, наблюдается в ход значительно увеличить уровни TSPO в центральной нервной системе (ЦНС). Это наблюдаемое upregulation TSPO может быть использована для изображения neuroinflammation в естественных условиях, с уровнями выражение, обеспечивая точным показателем тяжести воспаления. Таким образом цель данного метода является точно количественнов естественных условиях вклад neuroinflammation в мышиной модели ишемического инсульта, с помощью TSPO-ПС.

Были разработаны несколько TSPO Трейсеры для PET изображений neuroinflammation. Здесь, TSPO-PET изображения описываются с помощью ДПА-713 [¹¹C]¹², перспективным второго поколения TSPO трассировщика, который показал расширенной сигнал шум и снижение неспецифической привязки чем более исторически используется [¹¹C] PK11195 ¹³ . Например модель мыши dMCAO инсульта был выбран для этого метода¹⁴. Эта модель включает в себя временные краниотомии и постоянного лигирование дистальной средней мозговой артерии, что приводит к фокуса ишемии соматосенсорной коры. Это выгодно в инсульта доклинические исследования за высокую воспроизводимость ишемического повреждения и низкой смертности, связанный с этой моделью. На сегодняшний день, TSPO-PET изображений исследования еще не сообщили в dMCAO грызунов модели. Однако предыдущие PET изображений исследования с использованием модели средней мозговой артерии окклюзии (СМАо), более тяжелой и переменной модель инсульта, у мышей и крыс, сообщают TSPO выражение увеличится с 3 день и пик вокруг 7 день после инсульта^{15, 16,17,18}. Следовательно мы провели PET изображений 6 дней пост dMCAO совпадает с повышенными TSPO выражение. [¹¹C] ДПА-713 поглощения в мозге была оценена в ипсилатеральной (infarcted) и контралатерального полушарий. TSPO-PET была объединена с структурных МРТ, позволяя для точного разграничения инфаркте и контралатерального регионы интереса (ROI). Здесь мы описываем, как Атлас- и МРТ driven ROI подход для расчета поглощения ДПА-713 [¹¹C]. Радиоиндикаторных поглощения в селезенке также оценивали расследовать периферийных уровнях воспаления между группами. Этот метод имеет потенциал, чтобы обеспечить критическое понимание динамики пространственно-временных и роль конкретных neuroimmune взаимодействий в инсульта и других неврологических заболеваний.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии с административной панели на лабораторных животных уход (APLAC); в Стэнфордском университете, программы аккредитованы ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход. Перед началом этой процедуры три месяц старый самок мышей C57BL/6 прооперировали dMCAO после стандартной процедурой и стерильных условиях¹⁴.

1. структурные МРТ (2 дня пост dMCAO хирургия)

1. Откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалы) и приобретение, создав новый экзамен. Выберите локализатор и turborare T2 последовательностей в проводнике палитры и перетащите в окно экзамен.
2. Безопасного дыхания и тепла зонды для кровати мыши, с помощью мягкой ленты и место полоса защитного абсорбента, перетяжка над оба для создания стерильную среду.
3. Прикрепить нагреватель воздуха для животных кровати и включите вентилятор так, что теплый воздух на и держать мышь с подогревом. Использование автоматизированной системы мониторинга для обеспечения температуры тела и частота дыхания поддерживаются на соответствующих уровнях на время проверки.
4. Анестезировать мышь в камеру всасывание с помощью изофлюрановая первоначально, то сохранить 3% на 1-2% (2 Л/мин, 100% O₂). Убедитесь, что площадку тепла будет включен под индукции камеры чтобы согреться мыши во время индукции. После того, как под наркозом, смазать глаза к мыши, чтобы избежать высыхания и формирование язвы роговицы.
   1. Включите систему анестезии (изофлюрановая 1-2%, 2 Л/мин 100% O2) подключен к сканеру МРТ и передачи животное кровати мыши.
   2. Положение мыши головы подверженных на укус бар и исправить уха бары в месте, убедившись, что они не выступают за пределами диаметр кровати.
   3. Установите РФ катушки над головой мыши и продвиньте катушки и кровати в отверстие, поместив его специально для изоцентр.
   4. Приобрести локализатор для просмотра положение мыши в трех измерениях и использовать это изображение для определения объема для T2 turborare (TE: 33 МС, TR: 2500 ms, 2 средние, 17 ломтиками, разрешение 0.083 х 0,92 мм, общее время 2 мин 40 сек) приобретение. dMCAO хирургии результаты при инфаркте соматосенсорной коры¹⁴; Поэтому убедитесь, что этот регион рассматривается в T2-взвешенный образ.
   5. Удаление мышей от сканера и восстановить мышей в камере с подогревом.

2. ПЭТ/КТ калибровок и настройка рабочего процесса (6 дней пост dMCAO хирургия)

1. Создание изображений рабочего процесса в сканер-программное обеспечение включать приобретение затухания CT, 60-минутный C-11 динамической PET приобретение (350-650 кэВ уровень дискриминации, 3.438 окно совпадение ns), гистограммы (20 кадров: 5 x 15 сек, 4 x 1 мин, 11 x 5 мин; с Мертвые время коррекции) и реконструкция 3DOSEM-ОП (2 итераций, 18 подмножеств) для создания 128 x 128 x 159 изображений с 0.776 x 0.776 х 0,96 voxel Размер мм.
2. Выполните источник рентгеновского излучения, кондиционирования через панель калибровки CT, расположенный в верхнем левом углу интерфейса. Калибровка должна осуществляться еженедельно или перед сканированием если система не использовалась в течение последних 48 ч.
3. Выполняют темно/свет (г/л) и смещение центра (з) калибровок.
   1. Пресс CT калибровки кнопку (X) в правом верхнем слева от интерфейса.
   2. Выберите г/л и з для файла CT, вам будет запущен, удалите кровати из козловой и выполните калибровку г/л.
   3. Вставьте в сканер кровать инструмент калибровки и запустите c / калибровки, убедившись, что для переключения выделения на интерфейсе средству «калибровка» вместо «70 мм палитра».
4. Удалите средство калибровки и вернуть стандартные PET кровать, убедившись в том изменить выбор на интерфейсе обратно в «70 мм палитра».
5. Безопасный кровать изображений 4-мышь на платформу сканера, с помощью липкой ленты и прикрепить анестезии трубки (рис. 1А). Убедитесь, что изофлюрановая течет через трубы и что без перегибов.
6. Толкать, кровать вперед, так что в центре поля зрения (FOV), закройте дверь CT и получить разведчик вид CT для обеспечения кровати находится в правильном положении.
7. «Стандарт» калибровки ПЭТ/КТ сканера, с помощью собственного производства Фантом, содержащие известные доза раствора C-11 в качестве источника излучения.
   1. Подготовьте 20 мл шприц, заполнены с эквивалентна дозы трассирующими, который вводят один мышь (~ 250-350 Μки/9 - 13 MBq C-11 трассировщика, разбавленных в солевой раствор).
   2. Запишите действия в стандарте с помощью калибратора дозы и время измерения.
   3. Проведение ПЭТ/КТ стандарта, используя точные же параметры, которые будут использоваться для мышей изображения (как описано выше). Делаете это еженедельно для создания поправочный коэффициент для PET сканер, чтобы применить к визуализации данных.

3. workspace Setup для ПЭТ/КТ

1. Создайте стерильную среду с помощью дезинфицирующего средства с вирулицидной (см. Таблицу материалы) и размещение защитного абсорбирующего обивка на всех поверхностях.
2. Убедитесь, что танки изофлюрановая и кислорода заполнены должным образом.
3. Подготовьте хвост вен катетеры, заполнив (оснащены кончик иглы 27,5 G) 1 мл шприц с 0,9% натрия хлорида (стерильного физиологического раствора) и промывки через 27,5 G, катетер бабочка 24 см. Отрежьте крылья катетера до cannulating чтобы убедиться, что они не блокируют зрения хвост вен и помочь с легкостью перемещения мыши в сканер без перемещения катетера.
4. Убедитесь, что все необходимое оборудование выкладывается на рабочей станции, включая запасные «скрытой» шприцы (заполнены с стерильного физиологического раствора), глаза смазкой, этанол тампоны, тепла лампы, подготовленный катетеры (предварительно заполнены соленой), хирургическая лента, ткань клей, 0,5 мл доза шприцы, ножницы и легче для герметизации катетер после успешного размещения в хвост вен (1 рис.B).

4. животных подготовка и катетеризации

1. Взвешивание мышей, чтобы определить максимальный объем разрешено вводить в каждую мышь (т.е. объем трассировочных и любой физиологическим управляемых должна не превышать 10% от веса тела).
2. Анестезировать мышей в камеру всасывание с помощью 3% изофлюрановая и поддерживать на 1-2% (2 Л/мин 100% O₂).
3. Смазать глаза каждой мыши и подтвердить анестезии через педали рефлекс (мыс сжатие). При необходимости отрегулируйте уровень анестезии.
4. Поместите курсор мыши на кровать с подогревом оснащен носовой конус для доставки изофлюрановая на 1-2% (2 Л/мин 100% O₂).
5. В то время как мыши наркоз, выполняют катетеризации вен хвост, используя следующий протокол:
   1. Поместите мышь на его стороне выставить один боковых жилок, а головы остается в носовой конус.
   2. Теплый хвост с помощью тепла лампы, соблюдая осторожность, чтобы не перегреть или сжечь хвост и тампон с алкоголем wipe расширяются вены и стерилизовать укола.
   3. Задержать иглой с скос и привести его в соответствие с вен под острым углом.
   4. Слегка надавливайте прокол кожи и уровень из иглы, так это соответствует Вену.
   5. Аккуратно вставьте вперед на несколько миллиметров мимо скоса таким образом игла входит в Вену.
   6. Подтвердите, что катетер находится в управляющей небольшой (10-20 мкл) флеш физиологического раствора. Солевой раствор должен оставить шприц гладко и Вену следует очистить. Если любое сопротивление или обратно давление наблюдается, вполне вероятно, катетер находится не в духе и повторной попытки катетеризации является целесообразным. Если наблюдается свертывание, используйте гепарина (1000 единиц гепарина на мл физиологического раствора) для установки катетеризации и промывка.
      Примечание: Мы оценили катетеризации с и без гепарина в мыши штамм интереса, и поскольку не свертывания было отмечено, солевых только была использована для cannulations.
   7. Закрепите катетер к хвосту, используя небольшую каплю клея ткани, следуют Хирургическое ленты, чтобы обеспечить, что катетер остается неподвижным при передаче мышей к сканеру.
   8. Удаление скрытой шприц из конца катетера и печать конце с светлее, обеспечение исследователь не вблизи любой изофлюрановая или этанола.
   9. Повторите для 3 дополнительных мышей, так что все 4 мышей проверяемых канюлированной и готовы.
6. Включите анестезии потока (2,5% изофлюрановая, 2 Л/мин 100% O₂) подключены к PET/CT и тщательно позиции мышей склонны в постели сканера, обеспечивая катетеры остаются в силе и каждой мыши голову прямой и безопасной внутри носовой конус. Лента голову и тело каждой мыши к кровати с мягкими хирургическая лента, обеспечивая дыхание не ограничивается размещение ленты. Запишите позицию каждой мыши, чтобы обеспечить правильное расположение и выделение группы для анализа изображений.
7. Держите мышей с подогревом во всей процедуре (например, с помощью тепла лампы или воздушный насос системы для обеспечения мышей являются теплые без перегрева). Контролировать частоту дыхания всех мышей, визуально при использовании открытого козловой или посредством системы дистанционного мониторинга с помощью дыхательных колодки и изменить уровень анестезии при необходимости.

5. CT приобретение

1. Как только животные безопасны в постели и дыхания является стабильным, включите лазерный крест волосы и шаг сканирования кровати так, чтобы они согласовывались с мозга всех четырех мышей. Перемещение кровать сканера приобретение позиции (позиция 3) с мозги мышей как близко к центру ПЗ как можно.
2. Приобрести Скаутский изображение мышей, чтобы проверить их положение (использование 200 мм ПЗ) и отрегулировать положение, перетащив поле ПЗ на интерфейсе, при необходимости. Нажмите кнопку «Начать бизнес-процесс» в программное обеспечение сканера, чтобы начать КТ, обязательно выберите «Показывать запросы интерактивного пользователя» так ПЭТ-сканирование может запускаться вручную до трассирующими инъекций.

6. [¹¹C] подготовка доза ДПА-713

1. Синтезировать [¹¹C] ДПА-713 как описано¹², обеспечивая вы носите соответствующие СИЗ (средства индивидуальной защиты) для обработки радиоактивности, включая лаборатории пальто, перчатки и персональные дозиметры палец и тела. Обеспечить вас изменить перчатки регулярно для предотвращения радиоактивного загрязнения и увеличить ваши расстояние от радиоактивных источников, когда это возможно.
2. Используйте щипцы для тщательно передачи радиоиндикаторных флакон за щитом свинца.
3. Подготовьте шприцы 0,5 мл доза для каждой мыши, содержащий около 250-350 Μки/9-13 MBq в объёме 100-200 мкл обеспечить дозы достаточно для 60-минутной динамических ПЭТ-сканирование (доза управлением должна определяться рассматривает период полувыведения изотопа и время линии Исследование дизайна, с объемом в зависимости от веса мыши).
4. Мера активности с помощью калибратора дозы равным C-11, расположенный в непосредственной близости к месту катетеризации и записывать время измерения и инъекции, чтобы включить коррекцию распада. Составить дозы, как раз перед КТ концы ограничить распада и обеспечивать желаемый уровень радиоактивности будут вводиться в каждой мыши.
5. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха в шприц дозы до измерения активности и впрыскивать в каждой мыши.

7. PET приобретение

1. После того, как мышь автоматически заранее от CT PET, создан в задней части сканера для инъекций ДПА-713 [¹¹C] (рис. 1C). Поместите защитный абсорбирующего обивка на выступ и убедитесь, что ножницы и легче имеются в наличии.
2. СНиП запечатанном катетер, трубка с ножницами, проверить катетер линии четко любую пузыри и подтвердить канюли находится еще в Вену, выполнив 10-20 мкл физиологическим флеш. Загрузите измеренной дозы шприцы из шага 6.4 в каждый из 4 катетеры, следить за какие дозы было уделено каждой мыши.
3. Нажмите кнопку «OK», когда ПЭТ-сканирование готов начать одновременно начиная 10 секундный таймер. У двух исследователей на задней панели сканера с дозы шприцы в руке, придать все 4 мыши одновременно на таймер достигает нуля. Очистить каждый катетер с 50-100 мкл концентрированного солевого раствора (в зависимости от длины трубки катетера — т.е., объем) чтобы убедиться, полной дозы входит ключе хвост и вновь запечатать труб, еще раз используя зажигалку.
4. Измерьте дозу шприцы с помощью калибратора дозы для получения значения остаточная радиоактивность (любой трассирующими оставил в шприц). Принять к сведению значений и времени, которое они записываются.
5. После завершения сканирования, Главная панель управления PET кровать в исходное положение с помощью горизонтальных «домашнюю» кнопку внутри движения. Удаление мышей от сканера и тщательно удалить катетер. Осторожно примените давление на сайт катетеризации, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение.
6. Измерение остаточной активности в катетер с помощью калибратора дозы как описано ранее.
7. Если мышь для восстановления обеспечить это делается в теплой среде (например, в поле с подогревом площадку под или содержащие перчатка с теплой водой) для облегчения восстановления. Если вы планируете усыпить мышей, место мышей в камеру индукции, содержащие изофлюрановая, так что они по-прежнему анестезированные до эвтаназии через перфузии.
8. Для восстановления данных, откройте постобработки управляющего программного обеспечения (см. Таблицу материалы), который автоматически восстановит каждого сканирования с помощью гистограммы данных, созданный из файла lst.

8. мозга авторадиографии

1. До эксперимента стереть фильм цифровой авторадиографии, подвергая его белый свет на 10-15 мин и держать в зоне радиоактивности до использования.
2. Подготовьте 0,5 мл доза шприцы для каждой мыши, содержащие примерно 1,0-1,5 МРП/37-56 MBq обеспечить дозы для авторадиографии.
3. Измерения радиоактивности в дозе шприц, с помощью калибратора дозы, до инъекции, чтобы получить точное чтение деятельности.
4. Иглу как описывалось ранее и придать мыши непосредственно в районе подходит для радиоактивности.
5. Удаление катетера после инъекции и измерить остаточная радиоактивность.
6. Оставьте мышей в камере с подогревом индукции, так что они остаются анестезированные до перфузии и эвтаназии.
7. Выполняют эвтаназии, а мышей глубоко беспокоить (постоянное вдыхание 4% изофлюрановая, 2 Л/мин 100% O₂) через PBS перфузии и двусторонних торакотомия 30 мин после [¹¹C] ДПА-713 инъекции.
   1. Откройте брюшной полости и прорваться через диафрагму подвергать сердце.
   2. Вставьте иглу настой катетер бабочка в левый желудочек сердца, и СНиП правое предсердие и нижней полой вены.
   3. Медленно perfuse с PBS (~ 20-30 мл) с помощью 20 мл шприца.
8. Осторожно удалите мозг от черепа с помощью щипцов и ножницы.
9. Место мозга в замораживании формы заполнены с оптимального раскроя температуры жидкости (OCT), что делает уверен, что мозг является уровень и по центру в пределах формы, с обонятельные луковицы, ориентированные на вырезы в форме (для предоставления ориентиры и ориентации раз мозга удаляется от плесени).
10. Место плесень на сухой лед для 10-15 минут или до тех пор, пока Окт становится непрозрачной.
11. Сразу же место каждой формы в наборе микротом криостата до-18 ° C и сбалансировать за 10 мин до монтажа.
12. Очистить от замораживания плесень и смонтировать мозг микротом платформы, используя небольшое количество свежих OCT как «клей».
13. Оставляют подключенный мозга в микротом заморозить на 2 мин.
14. Срез мозга до инсульта расположение является подвергаются (т.е., ROI). Используйте образ MR найти инфаркте внутри мозг каждого животного. Для dMCAO это должно постоянно находиться в соматосенсорной коры; Однако длина штриха может незначительно отличаться.
15. В разделе региона мозга, охватывающих инфаркте, размещение 20 мкм толстые разделов на стеклянных скольжениях микроскопа помечены соответствующим мыши число.
16. Откройте авторадиографии кассету и линии в нижней части кассеты с одного листа Саран wrap. Организовать слайды раздел стороной вверх на вершине Саран wrap в кассету и принять к сведению позицию каждого слайда. При необходимости сделайте снимок размещения слайдов для оказания помощи с последующего анализа.
17. Осторожно поместите другой слой Саран пленку на вершине (после ожидания ~ 2 мин после сбора последней секции мозга - позволяет ему высушить и присоединиться к слайду) и тщательно место цифровой авторадиографии фильм (белый лицевой стороной вниз) на вершине слайды.
18. Плотно закройте кассету и оставить в холодильнике-20 ° C, позволяя разделы гнить на пленке для адекватного Выдержка (~ 5-10 половина жизнь).
19. Проверить фильм после времени экспозиции, с использованием светомассы тепловизор для создания цифрового изображения для последующего анализа.

9. динамическое изображение PET анализ

1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы) и нажмите на значок «открыть данных» для загрузки изображения КТ (в качестве источника) и значок «Добавление данных» для загрузки динамический PET (как ссылка).
2. Выполните визуальный контроль качества данных через оператор рядов в раскрывающемся меню: выберите ссылку («предложение») и «глобальный» и применить соответствующие min и max на цветовой шкале. Визуализация динамических данных PET кадра, проверка радиоактивности поглощение и проверки для любого движения смешивает внутри сканирования.
3. Создайте изображение средняя PET с помощью «арифметический оператор».
   1. Выберите «Средний выбран», снимите флажок «Ссылка» и обеспечения ввода 1 («Inp1»), ввода 2 («Inp2») и ввода звезда («ИЯФ *»-включает в себя остальные кадры ПЭТ сканирования) выбираются для создания в среднем всех фреймов Питомца.
   2. Перейдите на вкладку «Диспетчер данных» (DM) и перетащите средний изображение до позиции «input1» для целей визуализации. Распространять на цветовой шкале, щелкнув на автоматические вычисления в средстве «мин макс».
4. Зарегистрируйте CT в среднем PET файл, используя функцию «автоматическое 3D» в раскрывающемся меню «повторно orientation/регистрация».
   1. Выберите «ссылка» и «Inp1» и выберите «жесткой», «быстрый», «Inp1 Ref» регистрация. Визуально проверить регистрацию в трех измерениях и вручную отрегулировать при необходимости на вкладке «ручной 3D», с помощью функции «перевод» и «вращение».
   2. Когда удовлетворены с регистрацией, выберите «Inp2» и «ИЯФ *» и применяется ко всем кадрам PET, щелкнув флажок. Щелкните правой кнопкой мыши на КТ и ПЭТ файлы в DM и сохранить как сырье.
5. Обрезать мозг одной мыши в то время для анализа мозга с помощью КТ как направляющий выступ: выберите «Обрезка» из раскрывающегося меню и перетащите границы изображения, чтобы обрезать головы мыши ниже ствола мозга. Переориентировать ПЭТ и КТ изображения, используя функцию «ручной 3D переориентация», как описано выше, так что череп находится прямо во всех измерениях.
6. Загрузить в MR изображения для мыши (в формате DICOM) с помощью кнопки «добавить данные» на верхней левой части интерфейса. Перемещение с помощью «ручной 3D переориентация» Мистер и подходят к черепу в пределах изображения КТ (убедитесь, что все формы находятся в ту же ориентацию).
7. Обратить инсульта ROI на MR изображение, используя инструмент «3D ROI».
   1. Выключить PET визуализации, сняв его в закладке контроллер visual (VC) и использовать только MR и CT рисовать ROI.
   2. Нажмите на «добавить ROI» кнопку для создания новой ROI и назовите его «инфаркте». Выберите инструмент «сплайн», левой кнопкой мыши для рисования границы ROI и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закрыть его.
   3. Повторите через все срезы, охватывающих инсульт, не забудьте захватить любой из черепа в ROI, с наилучшей практикой, чтобы оставить voxel зазор между границей черепа и инсульта ROI.
8. Генерировать контралатеральной ROI, с использованием тома при инфаркте.
   1. Создайте новый ROI и ярлык «контралатеральной». Щелкните правой кнопкой мыши на ROI инфаркте и выберите «экспорт». Перетащите ROI в положение 2 («Inp1»).
   2. Только «Inp1» выбран применить левый правый флип, используя функцию «оператор» в меню «переориентация/регистрация». Поставьте галочку в поле «ROI», выберите «только просмотр» и вручную переместить новые ROI в идентичных регион на контралатеральную сторону. Выберите оператор «арифметика» и применить скалярного умножения 2 новых ROI, позволяя независимые количественная оценка ROI.
   3. Возвращение в средстве 3D ROI. Перейдите на вкладку «эксперт и экспериментальных» и нажмите на кнопку «Импорт ROI». Выберите Inp1 из диалогового окна для загрузки нового тома как контралатеральной ROI.
9. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении средняя PET и выгрузить его и включите животное. Генерировать результаты количественных поглощения, используя значок «Экспортировать результаты» в средстве 3D ROI.
10. Выполните анализ дополнительных Сплит мозга, при желании (т.е., автоматизированные ROI поколения права по сравнению с левым полушарием мозга полушария регионов с использованием 3D мыши мозга Атлас плагин модуля для Vivoquant программного обеспечения).
    1. Повторно загрузите зарегистрированные PET/CT изображения.
    2. Импорт Атлас мозга мыши, выбрав в меню «Расширенные модули» Атлас инструмент 3D мозга. Выберите «все регионы влево/вправо» в разделе «Дополнительные настройки» и нажмите кнопку «выполнить» для импорта 3D атлас.
    3. Вручную установите Атлас в головном мозге, используя череп как границы.
    4. Повторно запустите Атлас, убедившись, что «импорт 3D ROI» установлен для создания таблицы результатов для всех 14 ROIs левого и правого полушария (продолговатого мозга, мозжечок, мозга, Понс, коры, гиппокампа, таламуса, гипоталамуса, Полосатое тело, pallidum, обонятельные луковицы, мозолистого тела и белого вещества).
11. Количественно трассирующими поглощения в селезенке, используя операционной программного обеспечения сканера (см. таблицу материалы).
    1. Загрузите файлы изображений ПЭТ и КТ, выделив их в базе данных и нажав на «общий анализ».
    2. Нажмите на вкладку регистрации и совместного регистра ПЭТ и КТ изображений, нажав на иконку «жесткой регистрация».
    3. Нажмите на вкладку количественная оценка ROI, нажмите на значок «Создать ROI» и назовите его селезенки.
    4. Выберите инструмент «сфера» рисовать селезенки ROIs с помощью файла CT для справки, обеспечение того, что нет никакого дублирования с поглощения почек (с использованием PET изображений и сигнала во избежание распространения из почек).
    5. Редактируйте ROIs поддерживать последовательную ROI тома между животными.
12. Вычислить значение стандартной коррекции для поглощения нормализации.
    1. Загрузить данные ПЭТ/КТ из стандартной проверки и создания цилиндра ROI, охватывающих 20 мл шприц, используя средство «ручной 3D ROI».
    2. Получите уровень радиоактивности, содержащихся в стандарте, используя значок таблицы.
    3. Используйте этот результат nCi/cc и оригинальных заносимого радиоактивности для стандарта (например, измерения дозы калибратор стандарта в nCi/cc) для создания поправочный коэффициент для PET усвоение ценностей. То есть разделите радиоактивности стандарте записан калибратор дозы по радиоактивности, рассчитывается от PET изображений стандарта.
13. Использование мероприятий дозы и время измерений для распада правильное время PET приобретение для всех мышей (т.е. рассчитать дозу активности в начале ПЭТ-сканирование).
14. Повторите для остаточная стоимость и вычесть из распада исправленные дозы вычислить точное активности каждого животного получены.
15. После применения этого распада коррекции, также применять стандартной коррекции, чтобы убедиться, что данные находятся на уровне деятельности. Убедитесь, что эти поправки применяются вручную нарисованные ROI результаты, и областей мозга Атлас ROI данных соответствующих мозга для dMCAO местоположения (то есть, коры, гиппокамп и Полосатое тело).
16. Рассчитать %ID/g для всех трансформирования, используя следующее уравнение: %ID/g = (ROI радиоактивности в nCi/cc / распад исправленные дозы, полученной в nCi/cc) x 100. Участок %ID/g как функцию от времени, с использованием графического программного обеспечения для создания время активности кривые для каждого ROI.
17. Используйте программное обеспечение сканера для визуализации и рисунок поколения окончательное изображение. Нормализовать изображения согласно распада исправленные дозы, полученной по каждой мыши во время сканирования, обеспечивая все изображения находятся на той же шкале %ID/g.
    Примечание: это необходимо для точного сопоставления изображения из разных мышей и/или изображений от исследований, выполненных в разные дни

10. авторадиографии анализ изображений

1. Откройте в ImageJ программного обеспечения цифровой изображение (файл .gel). Отрегулируйте яркость и контрастность для визуально порог изображение и применить соответствующий цвет «таблица подстановки».
   Примечание: Королевский наиболее точно напоминает цвет шкала, используемая в ПЭТ.
2. Используйте диспетчер ROI вручную рисовать ROIs вокруг инфаркте и соответствующую контралатеральной регионов.
3. Используйте функцию мера для количественного определения средней пиксель интенсивности каждого ROI и экспортировать результаты. Печать с использованием статистического программного обеспечения.

Результаты

Мышей прошли МРТ для проверки успешного инсульта и [¹¹C] ДПА-713 PET осуществлялась путем сканирования 4 мышей одновременно. ПЭТ, КТ и изображения МРТ были совместно зарегистрированные до вручную рисования мозга трансформирования и выполнение анализа Атлас мозга полуавтоматические Сплит, расследовать трассирующими поглощения в регионах ипсилатерального и контралатерального (рис. 2).

ПЭТ/КТ изображений и кривые времени активности (ПВР радиоиндикаторных деятельность как функцию от времени) отображения увеличение [¹¹C] ДПА-713 поглощения в ипсилатеральные против контралатеральной полушарии (рисA). Количественная оценка динамических изображений мозга PET, используя суммируются данные из 50-60 мин, показали значительное увеличение трассирующими поглощения (% ID/g) в ипсилатеральной (infarcted) по сравнению с контралатеральной полушарии в dMCAO, но не в Шам мышей с использованием вручную нарисованные ROI подход (рис. 3B). Увеличение поглощения наблюдалось также в ипсилатеральные полушарии между dMCAO и Шам мышей. Статистически значимых различий между ипсилатерального и контралатеральной полушарии были замечены с использованием подхода, Атлас, вероятно из-за Атлас трансформирования, будучи больше, чем размер infarct (обычно ограничивается соматосенсорной коры), поэтому разбавления сигнал. Однако общее увеличение поглощения в dMCAO, по сравнению с фиктивным было отмечено для всех трансформирования, которая выравнивает с предыдущими докладами с помощью СМАо модели мышей, демонстрируя рост TSPO выражение в регионах за пределами инфаркте¹⁹. Ипсилатеральные/контралатеральной показатели были увеличены в dMCAO против Шам мышей с использованием обоих подходов; Однако эта разница была только в коре головного мозга с использованием подхода Атлас мозга из-за больших разница в подходе РУА. Это может быть преодолено путем увеличения числа мышей в каждой группе. Количественная оценка [¹¹C] ДПА-713 поглощения в селезенке показал статистически значимых различий между группами (рис. 4).

Мозг dMCAO мыши PET изображений результаты были подтверждены радиоавтографией ex vivo высоким разрешением цифровые (рис. 5). Увеличение [¹¹C] ДПА-713 поглощение было отмечено в infarcted ткани с незначительным сигнала в окружающие ткани здорового мозга. Количественный эти изображения показали ипсилатеральные контралатеральной коэффициенты от 1.4 до 2,09 dMCAO мышей.

Рисунок 1: PET сканер и Workspace Set-up. Все рабочие были покрыты защитной абсорбирующего обивка для создания стерильную среду. (A) после калибровки, кровать мышь 3D-печати, оборудованных для визуализации 4 мышей одновременно был обеспечен в сканер и головных конусов для всех 4 мышей, прилагается к анестезии. (B) необходимое оборудование для томографии PET готовились заранее, включая заполнены соленой 27,5 G катетеры, глаз смазки, этанол тампоны, тепла лампы, хирургическая лента, ткань клей, 0,5 мл доза шприцы, ножницы и зажигалку. (C) для инъекций радиоиндикаторных, место физиологического раствора флеш шприцы и ножницы на задней панели сканера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Ипсилатеральные/контралатеральной ROI и правой/левой Сплит полушария мозга Атлас PET изображений анализа процесса. Анализ изображений, что программное обеспечение используется для определения трассировщик поглощения в регионах ипсилатерального и контралатерального интерес (ROI) с помощью вручную обращается трансформирования и полуавтоматические 3D атлас дроблением подход. Автоматическая регистрация 3D PET/CT была проведена следуют ручной регистрации мозга МРТ в пределах соответствующего мыши черепа, определенных в КТ изображения. Средство 3D ROI был использован вручную рисовать ипсилатеральной (красный) и контралатерального (зеленый) трансформирования, используя инфаркте на МРТ как ссылка. Дроблением подход Атлас мозга 3D мышь влево/право Сплит был загружен и установлен внутри черепа, как определено CT изображения. Мозг ROIs используется для количественной оценки в этой 3D мыши мозга атлас включены слева коры (темно-серый), слева гиппокампа (Василек синий), слева стриатума (глубокий розовый), право коры (красный помидор), право гиппокампа (зеленый) и право Striatium (голубой). Поглощение [¹¹C] ДПА-713 в каждом регионе был получен в nCi/cc и впоследствии был преобразован в %ID/g путем нормализации дозы распада исправлены во время сканирования для каждой мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Представитель в Vivo [¹¹C] поглощения ДПА-713 мозга в Шам мышей и DMCAO. (A) динамический PET/CT изображения и ОДУ продемонстрировать увеличение [¹¹C] ДПА-713 поглощения в ипсилатеральные коры мышей, которые прошли DMCAO (n = 3) и незначительное увеличение для Шам (n = 3) действовали мышей, мышей DMCAO, демонстрируя значительно больше контраст в дозе вводят процент между инфаркте и контралатеральную сторону мозга (%ID/g). (B) ПЭТ количественной (50-60 мин суммируются) показали значительное увеличение поглощения в ипсилатеральные ROI, с использованием подхода ROI и в коре (СТХ) с использованием подхода дроблением Атлас. Никаких существенных различий были найдены в гиппокампе (HC) или стриатума (Str). Увеличение соотношения ипсилатеральные к контралатеральной были замечены с использованием обоих анализа подходов, но только был статистически значимым в Ctx, используя подход «Атлас» мозг. * (p < 0,05), *** (p < 0,001) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Представитель ДПА-713 селезенки поглощения In Vivo [¹¹C] в dMCAO и Шам мышей. (A) [¹¹C] ДПА-713 динамические PET/CT изображения показаны селезенки ROIs в dMCAO (n = 3) и Шам (n = 3) мышах. (B) количественные результаты демонстрируют без существенных результатов в селезенке поглощения между dMCAO и Шам мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Результаты представитель авторадиографии. Авторадиографии цифровые изображения демонстрируют увеличение [¹¹C] ДПА-713 поглощения в ипсилатеральные по сравнению с контралатеральной полушарии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Представленные протокол описывает метод для количественной оценки neuroinflammation в dMCAO и Шам мышей с использованием [¹¹C] ДПА-713-ПС. TSPO-PET является наиболее широко исследованы изображений biomarker для визуализации и измерения neuroinflammation в естественных условиях до настоящего времени. Выражение TSPO является upregulated на глии в мозг во время воспаления, позволяющие неинвазивного обнаружения и количественного определения neuroinflammation. Кроме того это весьма переводимые техника, что делает его ценным инструментом в доклинических и клинических исследований. Этот протокол и представитель результаты подчеркивают пригодности использования [¹¹C] ДПА-713 PET для выявления и мониторинга neuroinflammatory изменения в инсульта и других неврологических расстройств в естественных условиях.

В этом исследовании dMCAO операция была проведена с использованием 3-месячного самок мышей C57BL/6. Эта модель была выбрана как это приводит к весьма воспроизводимый при инфаркте, ограничивается соматосенсорной коры, предоставляя модель постоянного фокуса ишемии с низкой изменчивости, по сравнению с другими моделями инсульта (например, средний церебральной артериальной метод окклюзии (СМАо) накаливания)¹⁴. PET изображений моделей инсульта имеет то преимущество, содержащих внутреннюю ссылку региона в головном мозге для каждого животного, используя ROIs в контралатеральной полушарии. Поскольку некоторые воспаления, что результаты от только хирургическое, важно включить мышей, которые Шам прооперировали в дизайн исследования, согласно которому краниотомии и манипуляции мозговых оболочек без окклюзии артерии была выполнена. Краниотомия только может привести к срыву основной нейронной ткани и внедрение патогенов, ведущих к иммунных реакций независимо от инсульта²⁰. Некоторые воспаление после операции Шам поэтому ожидается и должны оцениваться параллельно с dMCAO исключить возможность сигнала благодаря только хирургическое. Чтобы избежать, включая воспаление, в результате операции без обводки в dMCAO когортный анализ, Мистер изображений должны проводиться для подтверждения успешного инсульт хирургия и инфаркте развития. МРТ также обеспечивает структурной опорный кадр, который важно точно нарисовать инфаркте и контралатерального ROIs. Кроме того для обеспечения надежной количественной оценки необходимы обработки точных изображений, включая изображения регистрации и определения рентабельности инвестиций.

Дополнительные ограничения должны иметь в виду при работе с C-11 надписью radiotracers для ПЭТ и авторадиографии исследований. Важно рассмотреть короткий период полураспада (20,33 минут) C-11, с его использованием, обычно ограничивается научно-исследовательских институтах с доступом на месте циклотрона. Маршрут перевозки соответствующие радиоактивности, дозы администрации и моменты времени приобретения должны определяться заранее с заранее подготовленные подробный план рабочего процесса эксперимента так что команда может работать быстро и эффективно. Проектирование и установка этого исследования была конспектирована для размещения изображений 4 мышей одновременно для увеличения доступной для вывода данных при использовании трассирующими C-11. Если возможно желательно, чтобы у всех мышей канюлированной и посреди их КТ к тому времени C-11 трассировщик прибывает на объекте изображений для обеспечения минимальной радиоиндикаторных распада до инъекции. Этот шаг за шагом протокол также лучше всего осуществляется командой, содержащие по крайней мере 3 исследователей для быстрой катетеризации, измерения дозы, трассирующими инъекции, ПЭТ и мозга резании до значительного радиоактивного распада. Он требует двух человек одновременно проводить инициации ПЭТ-сканирование и инъекции всех 4 мышей. Для начала PET приобретение просто до инъекции причина чтобы убедиться, что Фармакокинетика и динамика распределения трассировщика в крови и регионы интереса точно и полностью записываются. Многие шаги может потребовать активную подготовку и практику для обеспечения гладкого проведения эксперимента. В частности этот протокол зависит успешный хвост катетеризации вен мышей C57BL/6, в которых может быть затруднено из-за темных волос на их хвосты и может стать более сложной после инсульта или если изображений же мышей на несколько моментов времени .

Еще одно соображение для PET изображений включает в себя тщательное запись радиоиндикаторных дозы и остаточного измерений активности, в том числе точное время измерения. Это имеет важное значение для точного распада коррекции дозы вводят во время сканирования и используется для получения точного измерения поглощения трассировщик (т.е. % ID/g) для каждого ROI. Это необходимо знать точное количество радиоактивности, который присутствовал в каждой мыши во время сканирования для обеспечения анализа точных изображений. Поэтому рекомендуется синхронизировать часы на компьютере сканер и доза калибратор чтобы избежать ошибки при использовании короткоживущих изотопов, например C-11.

Точная количественная оценка PET изображение также может быть ограничена точность сканера и настройки. Поэтому для обеспечения точной количественной ПЭТ/КТ изображений, важно проводить проверки контроля качества для ПЭТ и КТ компонентов сканера. CT проверок контроля качества включают в себя рентгеновского источника кондиционирования, Темный/свет и центр покинуть набор калибровок. Эти калибровок измерять и правильно для системы шум и должна быть выполненной до приобретения как рекомендованный производителем сканера. Следует также выполнять калибровок для PET сканер. Обычно эта процедура включает сканирование Сканирование «стандартные / PET Фантом», с известной концентрацией радиоактивности. При подготовке стандарта, это лучше всего использовать же радиоизотопных, используемые в данном исследовании, сопоставимых дозы, ведении одной мыши в томе похож на тело мыши и же приобретения параметры как животных изображений. 20 мл шприц, наполненный радиоиндикаторных разводят в воде используется для стандарта в этом протоколе, результатами последующих PET изображений используется для вычисления поправочный коэффициент, основанный на фактических дозы, измеряется калибровки детектора. Коэффициент коррекции может применяться для визуализации данных, полученных в ходе эксперимента для обеспечения точной количественной трассирующими поглощения в регионах, представляющих интерес в PET изображений. Это объясняет Позитрон спектр радионуклидов помимо рассмотрения любой фоновой активности на день проверки. Как доза калибратора является неотъемлемой частью поколения этой поправочный коэффициент, важно, что это оборудование также регулярно калибруется согласно указаниям производителя.

При проведении ex vivo авторадиографии важно подобрать оптимальный момент для эвтаназии после инъекции, чтобы обеспечить высокий сигнал для фона в регион(ы) интерес. Тридцать минут после инъекции был выбран для авторадиографии ДПА-713 [¹¹C] с использованием данных, полученных во время динамических изображений ПЭТ -т.е., в естественных условиях динамической ОДУ как руководство, а также учитывая короткий период полураспада C-11 и время участие раздел и подвергать ткани мозга после извлечения. Учитывая это, радиоавтография ДПА-713 [¹¹C] должна производиться на отдельном когорте мышей для инъекций более высокие дозы ДПА-713 [¹¹C] и в 30 минутах время точка для перфузии и эвтаназии под наркозом. Выполнение небольших в естественных условиях экспериментальное исследование ПЭТ с 3-4 мышей до проведения ex vivo авторадиографии будет полезно для определения оптимального времени точки для авторадиографии. Дополнительное рассмотрение для ex vivo авторадиографии, следует ли восстановить мышей после инъекции или держать их под наркозом до эвтаназии. Держать их под наркозом имитирует условия проверки и обеспечивает кинетики распределения или экскрецию радиоиндикаторных не изменяются путем восстановления. Кроме того это предотвращает дополнительную нагрузку на мышах, избегая восстановления и последующее всасывание. Наконец, полезным дополнением к ex vivo протокола будет заключаться в оценке региональных ущерб в мозг ломтики для авторадиографии через иммуногистохимическое окрашивание (после радиоактивного распада) для создания изображения с высоким разрешением при инфаркте местоположения и объем.

Как есть ограничения с использованием C-11 на основе трассировщика, этот протокол можно легко изменить для использования с F-18 (период полураспада 109.77 мин) на основе TSPO трассировщика, который может быть более применимо к места без занятия циклотрона. Кроме того этот протокол описывает использование изображений настройки 4-мышь. Хотя этот метод высокая пропускная способность является оптимальным при использовании трассирующими C-11, этот протокол также может быть изменена для тех, кто с помощью мыши изображений кровати. Тщательное планирование и последовательное обучение методам, изложенные в настоящем Протоколе приведет к генерации большой объем данных с помощью [¹¹C] ДПА-713, который легко может быть применен к зонд роль neuroinflammation в проявлении болезни и Прогрессия в других грызунов модели неврологических расстройств. Кроме того этот метод может использоваться для оценки в vivo ответ иммуномодулирующих терапии, ориентированных на микроглии/макрофагов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inveon PET/CT scanner	Siemens	Version 4.2
MRI scanner	Varian		7 Telsa
ParaVision software	Bruker	Version 6.0.1	MRI operating software
VivoQuant software	InVicro	Version 2.5	Image analysis software
Inveon Research Workspace software	Siemens	Version 4.2	Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Butterfly catheters	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G needle
1 mL syringes	BD
Insulin syringes	BD	329461	0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe	VWR	BD302831	BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Heat lamp	Fluker	27002	5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline	Pfizer	00409-4888-10	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets	ThermoFisher Scientific	1420662	Disposable absorbent padding
Iris scissors	World Precision Instruments	503708-12	11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape	3M Durapore	1538-0	1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed	In house		4 mouse PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Compressed gas
Autoradiography cassette	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film	GE Life Sciences	28-9564-78	Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades	ThermoFisher Scientific	30-508-35	MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome	Microm		HM 550
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid	VWR	25608-930	Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds	Poly sciences	18646A-1	Disposable paraffin molds
Saran wrap	Saran	25700001300
Disinfectant	Virkon S