JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

Abstract

فول الصويا (ماكس جليكاين (لام) مير.) هو أنواع محاصيل هامة، وأصبحت نموذجا البقول للدراسات الخاصة بالمسارات الجينية والبيوكيميائية. ولذلك، من المهم إقامة نظام تعبير الجيني عابر فعالة في فول الصويا. هنا، نحن تقرير بروتوكول بسيط لإعداد بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيقه للتحليلات الفنية عابرة. ووجدنا أن يترك أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا أدى إلى كميات كبيرة من بروتوبلاستس عالية الجودة. عن طريق تحسين أسلوب تحويل الكالسيوم توسطت شماعة، حققنا التحول عالية الكفاءة باستخدام فول الصويا أونيفولياتي بروتوبلاستس. هذا النظام يوفر نموذج كفاءة وتنوعاً للنظر في آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية من فول الصويا، وقد تساعد على تحسين فهم العمليات الخلوية والتنموية والفسيولوجية المتنوعة من البقوليات.

Introduction

بروتوبلاستس هي الخلايا النباتية التي تحتوي على جدران الخلايا إزالة. كما يحتفظون بمعظم الميزات وأنشطة الخلايا النباتية، بروتوبلاستس هي نظام نموذجا جيدا لمراقبة وتقييم الأحداث الخلوية المتنوعة، وهي أدوات قيمة لدراسة تهجين جسمية1 ومصنع التجدد2. بروتوبلاستس على نطاق واسع أيضا استخدمت محطة التحول3،،من45، نظراً لجدران الخلايا إلا تعرقل مرور الحمض النووي في الخلية. بروتوبلاستس تمتلك بعض الاستجابات الفسيولوجية والعمليات الخلوية للنباتات سليمة، ومن ثم تقديم قيمة أساسية في البحوث الأساسية لدراسة البروتين سوبسيلولار التعريب6،،من78، يعيش البروتين-بروتين تفاعلات9،10، ومروج النشاط11،،من1213 في الخلايا.

عزل محطة بروتوبلاستس أبلغ أولاً في عام 196014 وقد وضعت بروتوكولات للعزلة والتحول من بروتوبلاستس ومحسن. إجراءات موحدة لعزل جبلة مجردة ينطوي على قطع أوراق الشجر والهضم الأنزيمي لجدران الخلية، متبوعاً بالفصل بين بروتوبلاستس المفرج عنهم من الحطام الأنسجة غير هضمها. وتشمل استراتيجيات التحول انهانسر15،16،17،microinjection18، والمستندة إلى البولي إثيلين غليكول (شماعة)4،5،19 أساليب. وأبلغ مجموعة واسعة من الأنواع الناجحة لعزل جبلة مجردة، بما في ذلك الحمضيات20وكرنب21، الباذنجانية22 و23،أسر أخرى من نباتات الزينة24. بينما يتم استخدام أنواع الأنسجة المتنوعة في مختلف الأنواع، نظام التعبير عابر في نبات mesophyll جبلة مجردة (تيمب) المعزولة من أوراق النبات نموذج التمويل نبات كانت راسخة25 واعتمدت على نطاق واسع لتطبيقات متنوعة.

فول الصويا (ماكس جليكاين (L.) Merr.) واحد من أهم البروتين ومحاصيل النفط26. وخلافا نبات الأرز، والحصول على نباتات فول الصويا المعدلة وراثيا المعروف أن صعبة بل ومنخفضة الكفاءة. Tumefaciens المتبعة-قد استخدم تسلل وساطة شعبيا لدراسات التعبير الجيني عابر في خلايا البشرة في27 من التبغ وشتلة في نبات،من2829، في حين وقد استخدمت رهيزوجينيس المتبعة لتحول جذور شعر في30من فول الصويا. استخدمت دوونريجوليشن31،الجينات المستهدفة32 وعابرة التعبير33 نهج إسكات الجينات الناجمة عن الفيروس بطريقة منهجية. بروتوبلاستس توفر بديلاً قيماً وتنوعاً لهذه النهج. ويمكن الحصول على مواد سطحي لفول الصويا بروتوبلاستس والسماح بالتعبير التحوير سريعة ومتزامنة. ومع ذلك، عزل بروتوبلاستس فول الصويا في عام 198334الناجحة الأولى، هناك منذ التقارير المحدودة على تطبيق بروتوبلاستس في فول الصويا35،،من3637، 38، أساسا بسبب المحاصيل منخفضة نسبيا من فول الصويا بروتوبلاستس.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط وفعال للعزلة من فول الصويا بروتوبلاستس وتطبيقه لدراسات التعبير الجيني عابر. استخدام أوراق أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا، كنا قادرين على الحصول على كميات كبيرة من بروتوبلاستس الحيوية في غضون ساعات قليلة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن الأمثل طريقة تحول الكالسيوم توسطت شماعة بسيطة ومنخفضة التكلفة إيصال الحمض النووي في بروتوبلاستس فول الصويا بكفاءة عالية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-نمو النباتات

  1. زرع بذور فول الصويا 5-10 (ويليامز 82) في وعاء 13 سم في الدفيئة ظروف طويلة أيام (الخفيفة في 1,500 µmol m-2 s-116 ح) عند 25 درجة مئوية على مزيج التربة المخصصة لفول الصويا (1: نسبة 1:1 للتربة، البيرليت ونسف الرمال).

2-إعداد بلازميد الحمض النووي

  1. استخدام تلميح ماصة معقمة أو مسواك، اختيار مستعمرة واحدة أو الأسهم والغليسيرول المجمدة من كولاي يحمل بلازميد يحتوي على الجينات للفائدة وتطعيم أنه في 20 مل بيرتاني لوريا (رطل) المتوسطة السائل مع المضادات الحيوية المناسبة في قارورة 50 مل.
  2. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر. جمع البكتيريا سينتريفوجينج التعليق في 12,000 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. استخراج وتنقية بلازميد اتباع الإجراء الخاص بالشركة المصنعة لمجموعة الإعدادية بلازميد.

3-جبلة مجردة العزلة

  1. قص أوراق أونيفولياتي الموسعة حديثا من شتلة فول الصويا 10-اليوم القديم (الشكل 1).
    ملاحظة: اختيار الأوراق في مرحلة إنمائية مناسبة هو مفتاح النجاح لإعداد جبلة مجردة فول الصويا. فقط استخدام أوراق موسعة فقط في مراحل النمو المبكرة. كما يترك ناضجة، جدران الخلايا تصبح أكثر صعوبة لهضم.
  2. مع شفرة حلاقة جديدة، إزالة الضلع الأوسط من نبات أونيفولياتي وثم قص شرائط الرفات إلى 0.5-1 ملم.
    ملاحظة: سيعطي يترك أونيفولياتي اثنين يهضم في حل الإنزيم 10 مل بروتوبلاستس كافية لتحولات أكثر من 10.
  3. استخدام زوج من الملقط، نقل شرائط الورقة فورا لطف إلى 10 مل من محلول إنزيم الطازجة (الجدول 1) في أنبوب 15 مل. ارتشاح الفراغ شرائط الورقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان الشرائط ليف في حل الإنزيم مع الانفعالات لطيف (40 لفة في الدقيقة) تحت ضوء منخفض ح 4-6 في درجة حرارة الغرفة. التأكد من أن الحل إنزيم يتحول الأصفر والأخضر كما يتم الإفراج عن بروتوبلاستس. تحقق من أن الحل إنزيم/بروتوبلاستس تحت المجهر (X10).
    ملاحظة: بروتوبلاستس المفرج عنهم كروية الشكل، في حين الخلايا عسر الهضم غير منتظمة أو بيضاوية الشكل.
  5. نقل 10 مل حل الإنزيم/جبلة مجردة في أنبوب 50 مل بصب بلطف وإضافة 10 مل من محلول W5 (الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة لوقف عملية الهضم. عكس الأنبوب بلطف عدة مرات. صب بلطف الحل إنزيم/بروتوبلاستس على نايلون ميكرون 75 نظيفة وضعت على رأس أنبوب 50 مل لإزالة أنسجة نبات عسر الهضم.
  6. الطرد المركزي الحل من خلال تدفق إنزيم/بروتوبلاستس في 100 غرام x في أنبوب 50 مل لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة مصلية 10 مل دون إزعاج بيليه جبلة مجردة بلطف.
  7. ريسوسبيند بروتوبلاستس، وتمييع لتركيز من 2 × 105 مل-1 في حل W5 مبردة عند 4 درجة مئوية عن طريق العد عدد جبلة مجردة في هيماسيتوميتير تحت المجهر (x10). الحفاظ بروتوبلاستس على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  8. الطرد المركزي من التعليق في 100 غ س ل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإزالة بلطف الحل W5 باستخدام ماصة 1 مل دون إزعاج بيليه جبلة مجردة. ريسوسبيند بروتوبلاستس في الحل المعجل (الجدول 1) بتركيز 2 × 105 مل-1 في درجة حرارة الغرفة.

4-جبلة مجردة التحول

  1. جعل 100 ميليلتر مختبرين من بروتوبلاستس (2 × 104 بروتوبلاستس في 2 × 105 مل-1) في أنابيب ميكروسينتريفوجي التصاق منخفضة 1.5 مل استخدام تقطيعه 200 ميليلتر ماصة النصائح. وضع واحد قاسمة جانبا لتكون بمثابة مراقبة سلبية. إضافة 10 ميليلتر من بلازميد (10-20 ميكروغرام) إلى كل من قاسمة بقية من بروتوبلاستس.
  2. إضافة ببطء ميليلتر 110 الطازجة شماعة الحل (الجدول 1) على الجدار الداخلي للأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وثم برفق عكس وتدوير الأنبوبة حتى يصبح الحل متجانسة.
  3. احتضان هذا الخليط التحول في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. للتوقف عن التحويل وإضافة 400 ميليلتر من حل W5 ببطء إلى أنبوب 1.5 مل عند درجة حرارة الغرفة وعكس الأنبوب بلطف حتى يصبح الحل متجانسة. الطرد المركزي الأنبوب في 100 غرام لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية باستخدام ماصة.
  5. أضف 1 مل من محلول أي (الجدول 1) إلى الأنبوبة وريسوسبيند بلطف بيبيتينج 1-2 مرات. أضف 1 مل مصل العجل العقيمة (المجلد/المجلد) 5% في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا معطف السطح والحيلولة دون بروتوبلاستس من الالتصاق باللوحة.
  6. وبعد بضع ثوان، تجاهل مصل العجل باستخدام ماصة. نقل بروتوبلاستس ريسوسبينديد في بئر من لوحة الثقافة. وتغطي اللوحة مع غطاء.

5-جبلة مجردة الاحتضان والحصاد

  1. احتضان بروتوبلاستس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 يوما في الظلام.
    ملاحظة: لقد وجدنا أن حضانة يومين غلة أقوى إشارة بروتين فلورسنت بشكل عام بالمقارنة مع الاحتضان يوما واحداً، وأن إشارة البروتينات الفلورية قد تستمر لمدة تصل إلى 3-4 أيام.
  2. نقل الحل جبلة مجردة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي التصاق منخفضة 1.5 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 100 غ س ل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحصاد بروتوبلاستس. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة ونقل 10 ميليلتر بروتوبلاستس إلى شريحة زجاج.
  3. مراقبة الإشارات الفلورسنت تحت الأسفار أو مجهرية [كنفوكل]. استخدام بروتوبلاستس عدم تحويلها كمراقبة سلبية (ينبغي أن تراعي أي إشارة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم اختبار أجهزة مختلفة من فول الصويا 10-يوم قديمة لإعداد جبلة مجردة (الشكل 1)، ولوحظت غلة تحت المجهر (الشكل 2). كان لا يكاد يهضم جدران الخلايا من hypocotyl وابيكوتيل، وبقيت بعض الخلايا المتصلة ببعضها البعض (الشكل 2، ج 2). وف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذا البروتوكول لعزل بروتوبلاستس فول الصويا والتطبيق لدراسات التعبير عابر قد تم اختبارها بدقة، ويعمل بشكل جيد للغاية في المختبر. الإجراءات بسيطة وسهلة، وتتطلب معدات عادية وأقل تكلفة. لدينا بروتوكول ينتج كميات كبيرة من بروتوبلاستس موحدة وعالية الجودة بالمقارنة مع أساليب سبق الإبلاغ عنها<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل "برنامج بحوث الجينوم المصنع" من "المؤسسة الوطنية للعلوم" (NSF--بجرب--دائرة الرقابة الداخلية--1339388).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture PlatesUSA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

References

  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
  4. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  5. Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
  6. Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
  7. Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
  8. Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
  9. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  10. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16(2009).
  11. Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
  12. Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
  13. Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
  14. Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  15. Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
  16. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
  17. Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
  18. Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
  19. Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
  20. Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
  21. Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
  22. Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
  23. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
  24. Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14(2012).
  25. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).
  26. Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
  27. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
  28. Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
  29. Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19(2014).
  30. Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
  31. Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
  32. Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
  33. Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
  34. Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
  35. Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
  36. Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).
  37. Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
  38. Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).
  39. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
  40. Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved