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Resumo

Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

Resumo

Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma espécie de cultura importante e tornou-se um modelo de vegetal para os estudos das vias genéticas e bioquímicas. Portanto, é importante estabelecer um sistema de expressão de gene transiente eficiente em soja. Aqui, nós relatamos um protocolo simples para a preparação de protoplastas de soja e sua aplicação para análises funcionais transitórias. Nós achamos que o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja resultaram em grandes quantidades de protoplastas de alta qualidade. Otimizando um método de transformação PEG-cálcio-mediada, atingimos a eficiência elevada de transformação usando protoplastas de unifoliate de soja. Este sistema fornece um modelo eficiente e versátil para exame dos complexos mecanismos de regulamentação e sinalização em células vivas de soja e pode ajudar a melhor compreender diversos processos celulares, fisiológicos e de desenvolvimento das leguminosas.

Introdução

Protoplastas são células vegetais que possuem paredes celulares removidas. Como eles mantêm a maioria dos recursos e atividades das células vegetais, protoplastas são um bom modelo sistema para observar e avaliar diversos eventos celulares e são ferramentas valiosas para estudar a hibridação somática1 e regeneração2da planta. Protoplastas tem sido também amplamente utilizados para planta transformação3,4,5, desde paredes celulares caso contrário iria bloquear a passagem de DNA para a célula. Protoplastas de possuam algumas das respostas fisiológicas e processos celulares de plantas intactas, oferecendo, portanto, o valor fundamental na pesquisa básica para estudar a localização Subcellular da proteína6,7,8, de9,de interações proteína-proteína10e o promotor atividade11,12,13 em células vivem.

O isolamento dos protoplastas de planta foi primeiramente relatado em 196014 e os protocolos para isolamento e transformação de protoplastas foram desenvolvidos e optimizados. Um procedimento padrão de isolamento de protoplastos envolve o corte de folhas e digestão enzimática das paredes celulares, seguido de separação de protoplastas lançados de restos de tecido não-digeridos. Estratégias de transformação inclui electroporation15,16, microinjeção17,18e baseadas em polietileno glicol (PEG)4,5,19 métodos. Uma grande variedade de espécies têm sido relatados bem sucedida para o isolamento de protoplastos, incluindo cítricas20, Brassica21, Solanaceae22 e outras famílias de plantas ornamentais23,24. Enquanto o tecido diversos tipos são usados em várias espécies, um sistema de expressão transiente em protoplastos de mesofilo de Arabidopsis (TEAMP) isolado de folhas da planta modelo Arabidopsis thaliana tem sido bem estabelecida25 e amplamente adotado para diversas aplicações.

Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma das mais importantes proteínas e óleo para as culturas26. Ao contrário de Arabidopsis e arroz, obtenção de plantas transgênicas de soja é conhecido por ser um pouco difícil e baixa eficiência. Agrobacterium tumefaciens-mediada por infiltração foi usada popularmente para estudos de expressão transiente gene nas células epidérmicas em tabaco27 e mudas em Arabidopsis28,29, Considerando que Agrobacterium rhizogenes tem sido usado para transformação de raízes peludas na soja30. Abordagens de silenciamento de gene induzida por vírus têm sido utilizadas para downregulation de alvo genes31,32 e transiente expressão33 de forma sistêmica. Protoplastas fornecem uma alternativa valiosa e versátil para essas abordagens. Protoplastas podem ser obtidos de materiais na superfície do feijão de soja e permitam a expressão do transgene rápida e sincronizada. No entanto, desde o isolamento de sucesso inicial de protoplastas de soja no 198334, houve limitados relatórios sobre a aplicação da protoplastas em soja35,36,37, 38, principalmente devido à relativamente baixos rendimentos de protoplastas de soja.

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficiente para o isolamento de protoplastas de soja e sua aplicação para estudos de expressão transiente de gene. Usando o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja, fomos capazes de obter grandes quantidades de protoplastas vitais dentro de algumas horas. Além disso, otimizamos a um método de transformação de PEG-cálcio-mediada que é simples e de baixo custo para entregar o DNA nas protoplastas de soja com alta eficiência.

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Protocolo

1. o crescimento das plantas

  1. 5-10 sementes de soja (82 Williams) em uma panela de 13 cm em estufa sob condições de longo-dia (16 h de luz em 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C, a mistura de solo personalizada da porca para soja (a 1: proporção de 1:1 de areia do solo, perlite e torpedo).

2. preparação do ADN do plasmídeo

  1. Usando a ponta da pipeta estéril ou palito de dente, escolher uma única colônia ou estoque de glicerol congelados de Escherichia coli , carregando o plasmídeo contendo o gene de interesse e inoculá-lo em 20 mL de meio líquido de Luria-Bertani (LB) com antibióticos apropriados em um balão de 50 mL.
  2. Incube o frasco a 37 ° C durante a noite em uma coqueteleira. Recolha as bactérias por centrifugação a suspensão a 12.000 x g, à temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante. Extrair e purificar o plasmídeo seguindo o procedimento do fabricante de um kit de preparação do plasmídeo.

3. isolamento de protoplastos

  1. Corte recém-expandido unifoliate folhas de plântulas de soja 10 dias de idade (Figura 1).
    Nota: A seleção das folhas em uma fase do desenvolvimento é a chave para o sucesso de preparação de protoplastos de soja. Só use folhas apenas expandidas em estágios iniciais do desenvolvimento. Como folhas maduras, paredes celulares tornam-se mais difícil de digerir.
  2. Com uma lâmina de barbear fresca, retire a nervura central da folha unifoliate e em seguida, corte os restos em 0,5-1 mm tiras.
    Nota: Duas folhas unifoliate digeridas em 10 mL de solução de enzima dará protoplastas suficientes para mais de 10 transformações.
  3. Usando um par de pinças, transferência a folha retira imediatamente e suavemente em 10 mL de solução recentemente preparada de enzima (tabela 1) em um tubo de 15 mL. Vácuo infiltrar a folha tiras para 15 min à temperatura ambiente.
  4. Incube as tiras de folha na solução enzimática com agitação suave (40 rpm) sob condições de pouca luz para 4-6 h à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução de enzima ficar verde-amarelo, como os protoplastas são liberados. Verifique se a solução de enzima/protoplastas sob o microscópio (X10).
    Nota: Os protoplastas lançados são esféricos, enquanto as células não digeridas tem forma oval ou irregular.
  5. Transferir a 10 mL da solução de enzima/protoplastos em um tubo de 50ml derramando suavemente e adicionar 10 mL de solução de W5 (tabela 1) à temperatura ambiente para parar a digestão. Inverta o tubo suavemente várias vezes. Despeje delicadamente a solução enzimática/protoplastas em uma malha de nylon limpo 75 µm colocada em cima de um tubo de 50 mL para remover os tecidos da folha não digerido.
  6. Centrifugue a solução de fluxo através da enzima/protoplastas em 100 g de x no tubo de 50 mL por 1-2 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta sorológica 10ml sem perturbar o sedimento de protoplastos.
  7. Ressuspender os protoplastas e diluir para uma concentração de 2 x 105 mL-1 , na solução de W5 refrigerada a 4 ° C, contando número de protoplastos em um hemacytometer sob o microscópio (x10). Manter os protoplastas no gelo por 30 min.
  8. Centrifugar a suspensão de 100 g de x para 1-2 min à temperatura ambiente e remova cuidadosamente a solução W5 usando uma pipeta de 1ml sem perturbar o sedimento de protoplastos. Ressuspender os protoplastas em solução MMG (tabela 1) na concentração de 2 x 105 mL-1 , à temperatura ambiente.

4. transformação de protoplastos

  1. Faça 100 alíquotas µ l de protoplastas (2 x 104 protoplastas em 2 x 105 mL-1) em tubos de microcentrifuga de baixa adesão de 1,5 mL usando sem cortes pontas de pipetas 200 µ l. Colocar uma alíquota de lado para servir como controle negativo. Adicione 10 µ l de plasmídeo (10-20 µ g) em cada uma das parte alíquota do resto dos protoplastas.
  2. Lentamente, adicionar 110 µ l de solução recentemente preparada de PEG (tabela 1) na parede interna do tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e depois inverta suavemente e rodar o tubo até que a solução se torne homogênea.
  3. Incube a mistura de transformação à temperatura ambiente por 15 min.
  4. Para parar a transformação, lentamente adicione 400 µ l de solução W5 no tubo de 1,5 mL à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea. Centrifugar o tubo a 100 g para 1-2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante com uma pipeta.
  5. Adicionar 1 mL de solução WI (tabela 1) para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando 1 - 2 vezes. Adicione 1 mL de soro de 5% (vol/vol) bezerro estéril em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços para revestir a superfície e evitar os protoplastas de degola para a placa.
  6. Após alguns segundos, descarte o soro de vitela com uma pipeta. Transferi os protoplastas ressuspensão em um poço da placa de cultura. Cubra o prato com uma tampa.

5. protoplastos incubação e colheita

  1. Incube os protoplastas à temperatura ambiente durante 1-2 dias no escuro.
    Nota: Achamos que dois dias de incubação rende mais forte sinal de proteína fluorescente, em geral, em relação à incubação de um dia, e que o sinal de proteína fluorescente pode durar até 3-4 dias.
  2. Transferi a solução de protoplastos para um tubo de microcentrifugadora de baixa adesão de 1,5 mL. Centrifugar o tubo a 100 x g por 1-2 min à temperatura ambiente a colheita protoplastas. Remover o sobrenadante com uma pipeta e transferir 10 protoplastas µ l numa lâmina de vidro.
  3. Observe o sinal fluorescente sob fluorescência ou microscopia confocal. Use protoplastas não-transformadas como controlo negativo (nenhum sinal deve ser observado).

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Resultados

Diferentes órgãos de soja 10 dia de idade foram testados para a preparação de protoplastos (Figura 1) e rendimentos foram observados ao microscópio (Figura 2). Paredes celulares do hypocotyl e epicotyl foram mal digeridas, e algumas células ficaram anexadas ao outro (Figura 2B, 2C). No cotilédone (Figura 2D) e raiz (Figura 2A<...

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Discussão

Este protocolo para a isolação de protoplastas de soja e o aplicativo para estudos de expressão transiente tem sido exaustivamente testado e funciona muito bem em nosso laboratório. Os procedimentos são simples e fáceis e exigem equipamento normal e custo mínimo. Nosso protocolo produz grandes quantidades de protoplastas uniforme, de alta qualidade em comparação com métodos anteriormente relatados34,35,36,

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa do genoma de plantas da National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture PlatesUSA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

Referências

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