Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Résumé

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Résumé

Soja (Glycine max (L.) Merr.) est une espèce de culture importante et est devenu un modèle de légumineuses pour l’étude des voies génétiques et biochimiques. Par conséquent, il est important de mettre en place un système d’expression de gène transitoire efficace chez le soja. Nous rapportons ici un protocole simple pour la préparation des protoplastes de soja et sa demande d’analyses fonctionnelles en régime transitoire. Nous avons constaté que les jeunes feuilles unifoliées de semis de soya résulte en grande quantité des protoplastes de haute qualité. En optimisant une méthode de transformation PEG-calcium-négociée, nous avons atteint l’efficacité de transformation élevés à l’aide de protoplastes unifoliées soja. Ce système fournit un modèle efficace et polyvalent pour l’examen des mécanismes de réglementation et signalisation complexes dans les cellules de soja direct et peut aider à mieux comprendre divers processus cellulaires, physiologiques et du développement des légumineuses.

Introduction

Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont enlevé les parois cellulaires. Qu’ils conservent la plupart des fonctions et activités des cellules végétales, les protoplastes sont un système de bon modèle d’observer et d’évaluer les divers événements cellulaires et sont des outils précieux pour étudier l’hybridation somatique¹ et²de la régénération des plantes. Protoplastes ont été également largement utilisés pour usine de transformation^3,4,5, puisque les parois cellulaires bloquerait sinon le passage de l’ADN dans la cellule. Les protoplastes possèdent certaines des réponses physiologiques et des processus cellulaires des plantes intactes, offrant ainsi une valeur fondamentale dans la recherche fondamentale pour étudier les protéines subcellulaire localisation^6,7,8, interactions de protéine-protéine^9,10et promoteur activité^11,12,13 en vivent les cellules.

L’isolement de protoplastes végétaux a été pour la première fois en 1960¹⁴ et les protocoles d’isolement et de transformation des protoplastes ont été développés et optimisés. Une procédure normalisée d’isolement de protoplastes implique le découpage des feuilles et la digestion enzymatique des parois cellulaires, suivi par séparation des protoplastes libérés de débris tissulaires non digérés. Stratégies de transformation comprend électroporation^15,16, microinjection^17,18et à base de polyéthylène glycol (PEG)^4,5,19 méthodes. Un large éventail d’espèces ont été signalées avec succès pour l’isolement de protoplastes, y compris les agrumes²⁰, Brassica²¹, Solanaceae²² et autres plantes ornementales familles^23,24. Tandis que les types de tissus différents sont utilisés dans diverses espèces, un système d’expression transitoire dans Arabidopsis protoplast de mésophylle (TEAMP) isolé des feuilles de la plante modèle Arabidopsis thaliana a été bien établi²⁵ et largement adopté pour diverses applications.

Soja (Glycine max (L.) Merr.) est l’une des plus importantes protéines et huile cultures²⁶. À la différence des Arabidopsis et le riz, obtention de plants de soja transgénique est connu pour être plutôt difficile et faible efficacité. Agrobacterium tumefaciens-médiation infiltration a été populairement utilisée pour des études d’expression génétique transitoire dans les cellules épidermiques en tabac²⁷ et semis dans Arabidopsis^28,29, alors que Agrobacterium rhizogenes a été utilisé pour la transformation des racines velues en soja³⁰. Les silencieux approches gène induite par le virus ont été utilisés pour downregulation de cible gènes^31,32 et transitoires expression³³ de façon systémique. Protoplastes fournissent une alternative utile et polyvalente à ces approches. Les protoplastes peuvent provenir de matériaux hors sol de soja et permettent l’expression du transgène rapide et synchronisée. Cependant, depuis l’isolement succès initial des protoplastes de soja dans les 1983³⁴, on a signalé limitée sur l’application des protoplastes de soja^{35,36,37, 38}, principalement en raison des rendements relativement bas de protoplastes de soja.

Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour l’isolement de protoplastes de soja et son application pour des études d’expression génétique transitoire. À l’aide de jeunes feuilles unifoliées de semis de soya, nous avons pu obtenir de grandes quantités de protoplastes vitales en quelques heures. En outre, nous avons optimisé une méthode de transformation PEG-calcium-négociée qui est simple et bon marché pour livrer l’ADN dans des protoplastes de soja à haut rendement.

Protocole

1. la croissance des plantes

1. Semer les graines de soja de 5-10 (82 Williams) dans un pot de 13 cm en serre dans des conditions de jours longs (16 h de lumière à 1 500 µmol m^-2 s^-1) à 25 ° C sur le mélange de sol personnalisé pour le soya (1:1:1 ratio de sable sol, de perlite et de torpilles).

2. préparation d’ADN plasmidique

1. À l’aide d’une pointe de pipette stérile ou un cure-dent, choisir une seule colonie ou stock de glycérol congelés de e. coli portant le plasmide contenant le gène d’intérêt et il inoculer dans 20 mL de milieu liquide de Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés dans un ballon jaugé de 50 mL.
2. Incuber le ballon à 37 ° C durant la nuit sur un agitateur. Récolter les germes par centrifugation de la suspension à 12 000 x g à température ambiante pendant 5 min et jeter le surnageant. Extraire et purifier le plasmide suivant la procédure par le fabricant d’un kit de préparation de plasmide.

3. isolement de protoplastes

1. Couper les feuilles unifoliées nouvellement agrandis d’un vieux de 10 jours, semis de soya (Figure 1).
   Remarque : Sélection de feuilles à un stade de développement approprié est la clé du succès pour la préparation de protoplastes de soja. Utilisez uniquement des feuilles juste élargis aux premiers stades du développement. Que les feuilles matures, les parois cellulaires deviennent plus difficiles à digérer.
2. Avec une lame de rasoir fraîche, enlever la nervure centrale des feuilles unifoliées et puis couper les restes dans 0,5 à 1 mm des bandes.
   Remarque : Deux feuilles unifoliées digérés dans 10 mL de solution d’enzyme donnera des protoplastes suffisantes pour plus de 10 transformations.
3. La feuille à l’aide d’une paire de pinces, transfert des bandes immédiatement et délicatement dans 10 mL de solution d’enzyme fraîchement préparée (tableau 1) dans un tube de 15 mL. Infiltration sous vide la feuille bandes pendant 15 min à température ambiante.
4. Incuber les bandes de feuilles dans la solution enzymatique avec agitation modérée (40 t/mn) sous une lumière faible pendant 4-6 h à température ambiante. Veiller à ce que la solution enzyme vire au jaune-vert comme les protoplastes sont libérés. Vérifier la solution d’enzyme/protoplastes au microscope (X10).
   Remarque : Les protoplastes libérés sont sphériques en forme, tandis que les cellules non digérées ont une forme ovale ou irrégulière.
5. Transférer les 10 mL de solution d’enzyme/protoplaste dans un tube de 50 mL en versant doucement et ajouter 10 mL de la solution W5 (tableau 1) à température ambiante pour arrêter la digestion. Retourner doucement le tube quelques fois. Verser doucement la solution d’enzyme/protoplastes sur une maille de nylon propre 75 µm placée au dessus d’un tube de 50 mL pour enlever les tissus foliaires non digérés.
6. Centrifuger la solution intermédiaire enzyme/protoplastes à 100 x g dans le tube de 50 mL pour 1-2 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL sans déranger le culot de protoplastes.
7. Remettre en suspension les protoplastes et diluer jusqu'à une concentration de 2 x 10⁵ mL^-1 dans une solution W5 réfrigérée à 4 ° C en comptant le nombre de protoplaste sur un Hémacytomètre sous le microscope (x10). Garder les protoplastes sur glace pendant 30 min.
8. Centrifuger la suspension à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante et retirer doucement la solution W5 en utilisant une pipette 1 mL sans déranger le culot de protoplastes. Remettre en suspension les protoplastes dans la solution MMG (tableau 1) à une concentration de 2 x 10⁵ mL^-1 à la température ambiante.

4. transformation de protoplaste

1. Faites 100 µL d’extraits de protoplastes (2 x 10⁴ protoplastes à 2 x 10⁵ mL^-1) à tubes de microcentrifuge de faible adhérence 1,5 mL utilisant uncut pointes de pipette 200 µL. Placer une aliquote de côté pour servir de témoin négatif. Ajouter 10 µL de plasmide (10 à 20 µg) dans chaque portion aliquote reste de protoplastes.
2. Ajouter lentement 110 µL de la solution fraîchement préparée de PEG (tableau 1) sur la paroi interne du tube microtubes 1,5 mL et puis retourner doucement et faites pivoter le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène.
3. Incuber le mélange de la transformation à température ambiante pendant 15 min.
4. Pour arrêter la transformation, lentement ajouter 400 µL de solution W5 dans le tube de 1,5 mL à température ambiante et retourner doucement le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène. Centrifuger le tube à 100 g pour 1-2 min à température ambiante et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.
5. Ajouter 1 mL de solution WI (tableau 1) dans le tube et remettre en suspension par pipetage doucement 1 ou 2 fois. Ajouter 1 mL de sérum de veau stérile (vol/vol) de 5 % dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits à recouvrir la surface et empêcher les protoplastes de coller à la plaque.
6. Après quelques secondes, jeter l’aide d’une pipette de sérum de veau. Transférer les protoplastes resuspendues dans un puits de la plaque de culture. Couvrir le plat avec un couvercle.

5. protoplaste incubation et récolte

1. Incuber les protoplastes à température ambiante pendant 1 à 2 jours dans l’obscurité.
   NOTE : Nous avons constaté que deux-jours d’incubation génère un signal de la protéine fluorescente en général par rapport à un jour d’incubation, et que le signal de la protéine fluorescente peut durer jusqu'à 3-4 jours.
2. Transférer la solution de protoplastes dans un tube microtubes de 1,5 mL faible adhérence. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante pour récolter des protoplastes. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et transférer 10 µL des protoplastes sur une lame de verre.
3. Observer le signal fluorescent sous fluorescence ou microscopie confocale. Utilisez des protoplastes non transformées comme contrôle négatif (aucun signal ne doit être observé).

Résultats

Différents organes de soja vieux de 10 jours, ont été testés pour la préparation de protoplaste (Figure 1) et les rendements ont été observés au microscope (Figure 2). Les parois cellulaires de l’hypocotyle et épicotyles sont difficilement digérés, et certaines cellules sont restés attachés les uns aux autres (Figure 2 b, 2C). Cotylédon (Figure 2D...

Discussion

Ce protocole pour l’isolement de protoplastes de soja et de l’application aux études d’expression transitoire a été testé et fonctionne très bien dans notre laboratoire. Les procédures sont simples et faciles et nécessitent des équipements ordinaires et coût minimum. Notre protocole génère de grandes quantités de protoplastes uniforme et de grande qualité par rapport aux méthodes rapportées antérieurement^34,35,36...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
Cellulase CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
Mannitol	ICN Biomedicals	152540
CaCl2	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	Sigma Aldrich	D5545-5G
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
nylon mesh	carolina	652222N
Tissue Culture Plates	USA Scientific	CC7682-7506
Razor Blades	Fisher	12-640
hemacytometer	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
EZNA plasmid miniprep kit	Omega	D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Centrifuge 5810	eppendorf	5811000827
Centrifuge 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller	Jencons	14526-202
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss	N/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450
15 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1018-P
50 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1060-P
Newborn Calf Serum	Thermo Scientific	16010159
Soil	Ingram's Nursery
perlite	Vigoro	100521091
Torpedo Sand	JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)	Fisher	BP1427-500