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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.

Zusammenfassung

Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) ist eine wichtige Kulturarten und eine Hülsenfrucht-Modell für das Studium der genetischen und biochemischen Wege geworden. Daher ist es wichtig, eine effiziente transiente gen Expressionssystems in Soja zu etablieren. Hier berichten wir ein einfaches Protokoll für die Vorbereitung der Sojabohne Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Funktionsanalysen. Wir fanden, dass große Mengen an hochwertigen Protoplasten jungen unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen führte. Durch die Optimierung der PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode, erreichten wir hohe Transformationseffizienz mit Soja unifoliate Protoplasten. Dieses System bietet ein effiziente und vielseitige Modell für die Prüfung von komplexen regulatorischen und Signalisierung Mechanismen im live Soja Zellen und können helfen besser zu verstehen, diverse zelluläre, Entwicklungsstörungen und physiologische Prozessen von Leguminosen.

Einleitung

Protoplasten sind Pflanzenzellen, die Zellwände entfernt haben. Sie pflegen die meisten Funktionen und Aktivitäten von Pflanzenzellen, Protoplasten sind ein gutes Modellsystem zur Beobachtung und Auswertung der vielfältigen zelluläre Ereignisse, und wertvolle Tools für die somatische Hybridisierung1 zu studieren und Werk Regeneration2. Protoplasten wurden für Werk Verwandlung3,4,5, ebenfalls weit verbreitet genutzt, da Zellwände sonst den Durchgang von DNA in die Zelle blockieren würde. Protoplasten besitzen einige der physiologischen Reaktionen und zelluläre Prozesse der intakten Pflanzen, daher bietet Grundwert in der Grundlagenforschung, Protein subzelluläre Lokalisation6,7,8zu studieren, Protein-Protein Interaktionen9,10und Promotor-Aktivität11,12,13 in Leben Zellen.

Die Isolation der Pflanze Protoplasten wurde erstmals 196014 gemeldet und die Protokolle für Isolation und Transformation von Protoplasten entwickelt und optimiert wurden. Ein Standardverfahren der Protoplasten Isolation beinhaltet das Schneiden der Blätter und enzymatische Verdauung der Zellwände, gefolgt von Trennung von freigegebenen Protoplasten von Gewebe nicht verdaut Schutt. Transformationsstrategien umfasst Elektroporation15,16, Mikroinjektion17,18und Polyethylenglykol (PEG)4,5,19 Methoden. Eine Vielzahl von Arten gemeldet wurden erfolgreich für die Protoplasten Isolierung, einschließlich Zitrusfrüchte20, Brassica21, Solanaceae22 und anderen Zierpflanzen Familien23,24. Während verschiedene Gewebetypen in verschiedenen Arten verwendet werden, wurde ein System von transienten Expression in Arabidopsis Mesophyll Protoplasten (TEAMP) aus den Blättern der Modellpflanze Arabidopsis Thaliana isoliert gut etablierte25 und weit verbreiteten für vielfältige Anwendungen.

Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) gehört zu den wichtigsten Protein und Öl Nutzpflanzen26. Im Gegensatz zu Arabidopsis und Reis transgene Sojapflanzen zu erhalten gilt eher schwierig und geringe Effizienz. Agrobacterium Tumefaciens-vermittelten Infiltration ist im Volksmund für transiente Genexpressionsstudien in der Epidermiszellen in Tabak27 und Sämlinge in Arabidopsis28,29, verwendet worden, während Transformation von behaarten Wurzeln in Soja30 Agrobacterium Rhizogenes bestritten. Virusbedingte Gen-Silencing-Ansätze wurden für Herabregulation von Ziel Gene31,32 und transiente Expression33 in einer systematischen Art und Weise genutzt. Protoplasten bieten eine wertvolle und vielseitige Alternative zu diesen Ansätzen. Protoplasten können Soja die oberirdische Materialien entnommen werden und ermöglichen schnelle und synchronisierte Transgene Ausdruck. Jedoch, seit die erste erfolgreiche Isolierung der Sojabohne Protoplasten in 198334gab es nur Berichte über die Anwendung von Protoplasten in Soja35,36,37, 38, in erster Linie aufgrund der relativ niedrigen Erträgen von Soja Protoplasten.

Hier beschreiben wir eine einfache und effiziente Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Genexpressionsstudien. Junge unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen konnten wir große Mengen an lebenswichtigen Protoplasten innerhalb weniger Stunden zu erhalten. Darüber hinaus haben wir einen PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode optimiert, die einfache und kostengünstige, DNA in Soja Protoplasten mit hohem Wirkungsgrad zu liefern ist.

Protokoll

1. Wachstum der Pflanzen

  1. Säen von 5-10 Soja (Williams 82) in einem 13 cm-Topf im Gewächshaus unter Bedingungen der langen Tage (16 h Licht bei 1.500 µmol m-2 s-1) bei 25 ° C auf die benutzerdefinierte Erdmischung für Soja (1:1:1 Verhältnis von Erde, Perlite und Torpedo Sand).

2. Vorbereitung von Plasmid DNA

  1. Mit einem sterilen Pipettenspitze oder Zahnstocher, wählen Sie eine einzelne Kolonie oder gefrorenen Glycerin Lager von E. Coli tragen das Plasmid enthält das gen des Interesses und in 20 mL Luria-Bertani (LB) flüssigen Medium mit geeigneten Antibiotika in ein 50 mL Fläschchen zu impfen.
  2. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C über Nacht in einen Shaker geben. Sammeln Sie die Bakterien, indem die Federung bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verworfen. Extrahieren Sie und zu reinigen Sie das Plasmid des Herstellers Verfahren ein Plasmid Prep Kit.

(3) Protoplasten Isolierung

  1. Schneiden Sie neu erweiterten unifoliate Blätter von 10 - Tage alten Sojabohnen Keimlinge (Abbildung 1).
    Hinweis: Auswahl von Blättern in einer entsprechenden Entwicklungsstadium ist der Schlüssel zum Erfolg für Sojabohnen Protoplasten Vorbereitung. Verwenden Sie nur gerade erweitert Blätter in frühen Entwicklungsstadien. Als ältere Blätter werden Zellwände schwieriger um zu verdauen.
  2. Mit einer frischen Rasierklinge entfernen der Mittelrippe aus der unifoliate Blatt und dann schneiden Sie die Reste in 0,5-1 mm Streifen.
    Hinweis: Zwei unifoliate Blätter in 10 mL Enzymlösung verdaut geben ausreichende Protoplasten für mehr als 10 Transformationen.
  3. Das Blatt Streifen mit einer Zange, Transfer sofort und sanft in 10 mL frisch zubereitete Enzymlösung (Tabelle 1) in der 15 mL Tube. Vakuum Infiltrat Streifen das Blatt für 15 min bei Raumtemperatur.
  4. Inkubieren Sie die Blatt-Streifen in der Enzymlösung mit sanften Agitation (40 u/min) unter schlechten Lichtverhältnissen für 4-6 h bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass das Enzymlösung Gelb-Grün dreht, da Protoplasten veröffentlicht werden. Überprüfen Sie die Enzym/Protoplasten Lösung unter dem Mikroskop (X10).
    Hinweis: Die veröffentlichten Protoplasten sind kugelförmige geprägt, während die unverdauten Zellen unregelmäßig oder ovale Form haben.
  5. Übertragen Sie die 10 mL der Lösung Enzym/Protoplasten in einem 50 mL-Tube vorsichtig gießen und 10 mL W5 Lösung (Tabelle 1) bei Raumtemperatur, die Verdauung zu stoppen. Invertieren Sie das Rohr sanft ein paar Mal. Füllen Sie vorsichtig die Enzym/Protoplasten Lösung auf eine saubere 75 µm-Nylon-Mesh platziert eine 50 mL-Tube, unverdaute Blatt Gewebe zu entfernen.
  6. Zentrifugieren Sie durchströmten Enzym/Protoplasten Lösung bei 100 X g in der 50 mL Tube für 1-2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer serologischen 10 mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet.
  7. Die Protoplasten Aufschwemmen und zu einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 in gekühlten W5-Lösung bei 4 ° C von Protoplasten zählen auf eine Hemacytometer unter dem Mikroskop (x10) verdünnen. Halten Sie die Protoplasten für 30 min auf Eis.
  8. Zentrifugieren Sie die Suspension 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig die W5-Lösung mit einer 1-mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet. Aufschwemmen der Protoplasten in MMG Lösung (Tabelle 1) in einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 bei Raumtemperatur.

4. Protoplasten transformation

  1. Machen Sie 100 µL-Aliquots von Protoplasten (2 x 104 Protoplasten bei 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen mit unbeschnittenen 200 µL Pipettenspitzen. Setzen Sie eine aliquote beiseite, um als negative Kontrolle dienen. Fügen Sie 10 µL Plasmid (10-20 µg) in jede der übrigen aliquoten von Protoplasten.
  2. Fügen Sie langsam 110 µL frisch zubereitete PEG-Lösung (Tabelle 1 hinzu) an der Innenwand der 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, und dann invertieren Sie sanft zu und drehen Sie das Rohr, bis die Lösung homogen wird.
  3. Inkubieren Sie die Verwandlung-Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.
  4. Um die Transformation zu stoppen, der 1,5 mL Tube bei Raumtemperatur langsam 400 µL W5-Lösung hinzu und invertieren Sie das Rohr sanft zu, bis die Lösung homogen wird. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 g für 1-2 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette zu.
  5. Das Rohr 1 mL WI-Lösung (Tabelle 1) hinzu und Aufschwemmen von 1-bis 2-mal sanft pipettieren. Fügen Sie 1 mL 5 % (Vol/Vol) sterile Kälberserum in jede Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well-Platte Beschichten der Oberfläche zu verhindern, dass die Protoplasten festhalten an der Platte.
  6. Verwerfen Sie nach ein paar Sekunden die Kälberserum mit einer Pipette. Die resuspendierte Protoplasten in einen Brunnen der Kultur-Platte zu übertragen. Die Platte mit einem Deckel abdecken.

5. Protoplasten Inkubation und Ernte

  1. 1-2 Tage im Dunkeln inkubieren Sie die Protoplasten bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Wir fanden, dass zwei Tagen Inkubation stärkeren fluoreszierendes Protein-Signal in der Regel im Vergleich zu einem eintägigen Inkubation ergibt und das fluoreszierende Protein-Signal für bis zu 3-4 Tage dauern kann.
  2. Übertragen Sie die Protoplasten-Lösung auf einem 1,5 mL geringe Haftung Microcentrifuge Schlauch. Zentrifugieren Sie das Rohr 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur Protoplasten zu ernten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und übertragen Sie 10 µL Protoplasten auf einen Objektträger.
  3. Fluoreszenzsignal unter Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie nicht-transformierten Protoplasten als Negativkontrolle (kein Signal sollte eingehalten werden).

Ergebnisse

Verschiedene Organe des 10 - Tage alten Sojabohnen für Vorbereitung der Protoplasten (Abbildung 1) getestet wurden und Erträge beobachtet, unter dem Mikroskop (Abbildung 2). Zellwände aus Keimachse und Epicotyl waren kaum verdaut, und einige Zellen geblieben (Abbildung 2 b, 2 C) miteinander verbunden. Im Keimblatt (Abb. 2D) und Wurzel (

Diskussion

Dieses Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und die Anwendung auf transiente Expression Studien wurde gründlich getestet und funktioniert sehr gut in unserem Labor. Die Verfahren sind einfach und leicht und erfordern ordentliche Ausrüstung und minimalen Kosten. Unser Protokoll liefert große Mengen an gleichbleibende hohe Qualität Protoplasten im Vergleich zu bereits gemeldeten Methoden34,35,36,

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Pflanze Genome Research Program von der National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma Aldrich M8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals 152540
CaCl2Fisher C79-500g 
BSANEBR3535S
DTTSigma Aldrich D5545-5G
NaClSigma Aldrich S7653-1kg
KClFisher P217-500g 
MgCl2Sigma Aldrich M8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture Plates USA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

Referenzen

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