콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

요약

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

초록

콩 (최대 글리신 (L.) Merr.)는 중요 한 작물 종 이며 유전 그리고 생 화 확 적인 통로의 연구에 대 한 콩과 모델 되고있다. 따라서, 그것은 콩에서 효율적인 변이 유전자 표현 시스템을 설정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 콩 protoplasts의 준비에 대 한 간단한 프로토콜 및 일시적 기능 분석에 대 한 응용 프로그램을 보고합니다. 우리는 젊은 unifoliate 잎 콩 모 종에서 높은 품질 protoplasts의 대량에서 결과 발견. 못 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 하 여 우리 콩 unifoliate protoplasts를 사용 하 여 높은 변환 효율을 달성. 이 시스템 라이브 콩 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘의 검사에 대 한 효율적이 고 다재 다능 한 모델을 제공 하 고 더 나은 하는 데 도움이 콩의 다양 한 세포, 발달 및 생리 적 프로세스를 이해할 수 있습니다.

서문

Protoplasts는 식물 세포는 세포 벽 제거. 그들은 대부분의 기능을 유지 하 고 식물 세포의 활동, protoplasts는 관찰 하 고 평가 하는 다양 한 세포 이벤트, 좋은 모델 시스템 하 고 체세포 혼성¹ 을 공부 하 고 중생²공장에 유용한 도구. Protoplasts 공장 변환^3,,45, 세포 벽 세포로 DNA의 통로 차단 그렇지 않으면 이후 널리 이용 되어 있다. Protoplasts 생리 적인 응답의 일부 및 따라서 단백질 subcellular 지 방화^6,7,8, 공부 하는 기초 연구에 근본적인 가치를 제공 하 고 그대로 식물의 세포 프로세스 보유 단백질 단백질 상호 작용^9,10, 발기인 활동^11,,1213 에 셀 살고 있다.

식물 protoplasts의 1960¹⁴ 에 처음 알려졌다 고 절연 및 protoplasts의 변환에 대 한 프로토콜 개발 및 최적화 되었습니다. 원생 동물 격리의 표준 절차는 잎의 절단 및 세포 벽, 비 소화 조직 파편에서 출시 된 protoplasts의 분리에 의해 다음의 효소 소화를 포함 한다. 전환 전략 electroporation^15,16, microinjection^17,18및 폴 리 에틸렌 글리콜 기반 (PEG)^4,,519 방법을 포함 합니다. 다양 한 종의 원생 동물 격리, 감귤 류²⁰, 브라시카²¹, Solanaceae²² 및 다른 장식적인 식물 가족^23,24를 포함 하 여 성공 보고 되었습니다. 다양 한 조직 유형에 다양 한 종에 사용 하 고, 표현의 과도 애기 mesophyll 원생 동물 (TEAMP)에서 애기 thaliana 모델 식물의 잎에서 분리 된 시스템 잘 설립된²⁵ 되었습니다. 그리고 다양 한 응용 프로그램을 광범위 하 게 채택.

콩 (최대 글리신 (L.) Merr.) 가장 중요 한 단백질의 하나 이며 기름 작물²⁶. 애기 와 달리 쌀, 유전자 변형 콩 식물을 얻기 보다 어렵고 낮은 효율 될 알려져 있다. Agrobacterium tumefaciens-중재 침투는 널리 사용 되 고 담배²⁷ 에서 상피 세포와 애기^28,29, 모 종 변이 유전자 표현 연구 반면 Agrobacterium rhizogenes 콩³⁰털 뿌리의 변화에 대 한 사용 되었습니다. 바이러스 유도 유전자 입을 접근 downregulation 대상 유전자^31,32 와 과도 식³³ 의 체계적인 방식으로 활용 되어 있다. Protoplasts 이러한 접근에 대 한 소중 하 고 다양 한 대안을 제공합니다. Protoplasts 콩의 지상 자료에서 얻어질 수 있다 고 신속 하 고 동기화 transgene 식. 그러나, 1983³⁴에 콩 protoplasts의 초기 성공 격리, 이후 제한 보고서 콩^35,,3637, protoplasts의 응용 프로그램에 ³⁸, 콩 protoplasts의 상대적으로 낮은 수확량 때문에 주로.

여기, 우리 콩 protoplasts의 격리에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜 및 변이 유전자 표현 연구에 대 한 응용 프로그램을 설명합니다. 콩 모 종에서 젊은 unifoliate 잎을 사용 하 여, 몇 시간 안에 많은 양의 중요 한 protoplasts 얻을 수 있었습니다. 또한, 우리는 간단 하 고 저비용 고효율 콩 protoplasts에 DNA를 전달 하는 말뚝 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 했습니다.

프로토콜

1입니다. 식물의 성장

1. 콩에 대 한 사용자 지정 토양 혼합에 25 ° C에서 긴 하루 조건 (16 h 1500 µmol m^{-2의 -1}에 빛)에서 온실에서 13cm 냄비에 5-10 콩 씨앗 (윌리엄스 82)를 뿌리 다 (1: 토양, 진주 암 및 어 뢰 모래의 비율이 1:1).

2입니다. 플라스 미드 DNA의 준비

1. 살 균 피 펫 팁 또는 이쑤시개 사용 하, 단일 식민지 또는 냉동된 글리세롤 재고의 대장균 의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 운반 하 고 20 mL 50 mL 플라스 크에 적절 한 항생제와 Luria Bertani (파운드) 액체 매체에 접종.
2. 통에 하룻밤 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 5 분 동안 실 온에서 12000 x g에서 정지 centrifuging와 삭제는 상쾌한 박테리아를 수집 합니다. 추출 하 고 플라스 미드 플라스 미드 준비 장비의 제조 업체의 절차에 따라 정화.

3. 원생 동물 격리

1. 10 일 된 콩 모 종 (그림 1)에서 새로 확장 된 unifoliate 나뭇잎을 잘라.
   참고: 적절 한 발달 단계에서 잎의 선택 콩 원생 동물 준비에 대 한 성공에 열쇠 이다. 만 그냥 확장된 잎을 사용 하 여 초기 발달 단계에서. 성숙한 잎, 세포 벽 소화 하기 어렵게 된다.
2. 신선한 면도날으로는 midrib unifoliate 잎 및 0.5-1에 남아 m m 스트립 다음 컷에서 제거 합니다.
   참고: 10 mL 효소 솔루션에 소화 두 unifoliate 잎 10 개 이상의 변환에 대 한 충분 한 protoplasts를 줄 것 이다.
3. 집게, 전송의 쌍을 사용 하 여 리프 스트립 즉시 고 부드럽게 15 mL 튜브에 갓된 효소 솔루션 (표 1) 10 mL에. 진공 침투 잎은 실 온에서 15 분 동안 스트립.
4. 부드러운 실 온에서 4-6 h에 대 한 낮은 조명에서 동요 (40 rpm)와 효소 솔루션에서 리프 스트립을 품 어. 효소 솔루션 변하기 노란색-녹색 protoplasts 해제 됩니다 확인 하십시오. 현미경 (X10) 효소/protoplasts 솔루션을 확인 하십시오.
   참고: 릴리스 protoplasts 모양, 소화 되지 않은 세포는 불규칙 한 또는 타원형 모양을 하는 동안 구형은.
5. 부드럽게 붓는 의해 50 mL 튜브에 효소/원생 동물 솔루션의 10 mL를 전송 하 고 소화를 막으려고 실 온에서 W5 솔루션 (표 1) 10 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 몇 번 반전. 부드럽게 깨끗 한 75 µ m 나일론 메쉬 위에 소화 되지 않은 잎 조직 제거를 50ml 튜브에 효소/protoplasts 솔루션을 붓으십시오.
6. 실 온에서 1-2 분 50 mL 튜브에 100 x g에서 흐름을 통해 효소/protoplasts 솔루션 원심 부드럽게 상쾌한 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
7. Resuspend는 protoplasts 그리고 (x10) 현미경 hemacytometer에 원생 동물 수를 계산 하 여 4 ° C에서 냉장된 W5 솔루션에서 2 x 10⁵ mL^-1 의 농도를 희석. 30 분 동안 얼음에 protoplasts를 유지.
8. 실 온에서 1-2 분 x 100g에 현 탁 액을 원심 그리고 W5 솔루션 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거. 실 온에서 2 x 10⁵ mL^-1 의 농도에 MMG 솔루션 (표 1)에서 protoplasts를 resuspend.

4. 원생 동물 전이

1. 1.5 mL 낮은 접착 microcentrifuge 튜브 포경된 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 protoplasts (2 x 10⁵ mL^-1에서 2 × 10⁴ protoplasts)의 100 µ L aliquots를 확인 합니다. 부정적인 통제 역할을 한 약 수 옆으로 넣어. 각 protoplasts의 나머지 약 수로 플라스 미드 (10-20 µ g)의 10 µ L를 추가 합니다.
2. 천천히 1.5 mL microcentrifuge 튜브의 내부 벽에 갓된 못 솔루션 (표 1)의 110 µ L을 추가 하 고 부드럽게 반전 솔루션은 균질 됩니다 때까지 튜브를 회전.
3. 15 분 동안 실 온에서 변환 혼합물을 품 어.
4. 중지 하려면 변환, 천천히 실내 온도에 1.5 mL 튜브에 W5 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 솔루션은 균질 됩니다 때까지 부드럽게 튜브를 반전 합니다. 실 온에서 1-2 분 100 g에 튜브 원심 하 고 상쾌한을 피 펫을 사용 하 여 삭제.
5. 튜브를 무선 솔루션 (표 1)의 1 mL을 추가 하 고 1-2 회 부드럽게 pipetting으로 resuspend. 코트 표면 하 고는 protoplasts 접시에 집착 하는 것을 방지 하 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 5% (vol/vol) 메 마른 송아지 혈 청 1 mL를 추가 합니다.
6. 몇 초 후, 송아지 혈 청을 피 펫을 사용 하 여 삭제 합니다. Resuspended protoplasts 문화 접시의 우물으로 전송 합니다. 커버 뚜껑 접시.

5. 원생 동물 부 화 및 수확

1. 어둠 속에서 1-2 일 동안 실 온에서 protoplasts를 품 어.
   참고: 우리는 2 일 보육 일일 보육에 비해 일반적으로 더 강한 형광 단백질 신호 하 고 형광 단백질 신호 최대 3-4 일 동안 지속 될 수 있습니다 발견.
2. 원생 동물 솔루션 낮은 접착 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. Protoplasts 수확을 실 온에서 1-2 분 x 100g에 튜브 원심 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 유리 슬라이드에 10 µ L protoplasts를 전송.
3. Confocal 현미경 검사 법 또는 형광 형광 신호를 관찰 합니다. 변형 비 protoplasts를 사용 하 여 부정적인 제어 (신호가 관찰 한다).

결과

다른 장기 10 일 오래 된 콩의 원생 동물 준비 (그림 1)에 대 한 테스트 및 수율 (그림 2) 현미경 관찰 했다. Hypocotyl 및 epicotyl에서 세포 벽 거의 소화 했다, 하 고 일부 셀 (그림 2B, 2 C) 서로 게 연결 된. 떡 (그림 2D)와 루트 (그림 2A), 세포 벽은 세포의 작...

토론

콩 protoplasts 및 과도 식 연구에 응용 프로그램의 격리에 대 한이 정서의 철저 하 게 테스트 하 고 우리의 실험실에서 아주 잘 작동. 절차는 간단 하 고 쉽게 고 일반 장비 및 최소 비용 요구. 우리의 프로토콜 이전에 보고 된 방법^{34,35,36,,3738}에 비해 균일 한 고품질 protoplasts의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
Cellulase CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
Mannitol	ICN Biomedicals	152540
CaCl2	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	Sigma Aldrich	D5545-5G
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
nylon mesh	carolina	652222N
Tissue Culture Plates	USA Scientific	CC7682-7506
Razor Blades	Fisher	12-640
hemacytometer	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
EZNA plasmid miniprep kit	Omega	D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Centrifuge 5810	eppendorf	5811000827
Centrifuge 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller	Jencons	14526-202
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss	N/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450
15 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1018-P
50 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1060-P
Newborn Calf Serum	Thermo Scientific	16010159
Soil	Ingram's Nursery
perlite	Vigoro	100521091
Torpedo Sand	JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)	Fisher	BP1427-500