JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

البروتوكولات اثنين مختلفة 3 'التضخيم السريع كدنا الغايات (3' سباق) جعل هنا وصف استخدام اثنين بولمرس الحمض النووي مختلفة لتعيين تسلسل التي تشمل جزءا من الإطار القراءة المفتوحة (ORF) كودون التوقف وأكملها 3 ' UTR من نسخة باستخدام الحمض النووي الريبي الحصول على خطوط خلايا السرطان المختلفة.

Abstract

نضوج مرناس التوكسينات ينطوي على إنهاء تشكيل 3 '، الذي ينطوي على إضافة ذيل poly(A). من أجل تعيين 3 'نهاية الجين، هو الطريقة التقليدية لاختيار 3' التضخيم السريع كدنا الغايات (3 ' سباق). تتطلب بروتوكولات لسباق 3 'التصميم الدقيق والتحديد كبسولة تفجير متداخلة ضمن 3' المنطقة غير مترجمة (3 ' UTR) من الجينات المستهدفة للفائدة. ومع ذلك، مع بعض التعديلات يمكن استخدام البروتوكول لتشمل كامل 3 'UTR وتسلسل داخل الإطار القراءة المفتوحة (ORF)، تقديم صورة أكثر شمولاً عن العلاقة بين ORF و 3' UTR. هذا بالإضافة إلى تحديد إشارة بوليادينيليشن (PAS)، فضلا عن موقع الانقسام وبوليادينيليشن تقدمها التقليدية 3 ' العرق. توسيع 3 'العرق يمكن الكشف عن غير عادية 3' تحيلها، بما في ذلك اندماج الجينات داخل 3 ' UTR، وتسلسل المعلومات التي يمكن استخدامها للتنبؤ المحتملة ميرنا ربط المواقع، فضلا عن الاتحاد الأفريقي الغنية زعزعة العناصر التي قد تؤثر على استقرار محضر.

Introduction

تشكيل نهاية 3 ' هو خطوة حاسمة في نضوج مرناً التي تتألف الانقسام ومن المصب مرناً قبل نظام تقييم الأداء متبوعاً بالإضافة ~ 250 أونتيمبلاتيد أدينينيس، التي تشكل poly(A) الذيل1،2. البروتين ملزمة poly(A) (بابب) بربط ذيل poly(A)، وهذا يحمي نسخة مرناً من التدهور، ويسهل الترجمة1.

وتشير التقديرات الحالية إلى أن 70% جينات البشرية المرور متعددة، وهكذا يخضع بوليادينيليشن البديلة، أسفر عن عدة 3 ' ينتهي3. وبالتالي، من المهم أن تحدد فيها الذيل poly(A) تعلق على بقية 3 ' UTR، فضلا عن تحديد نظام تقييم الأداء المستخدمة من قبل أي نص معين. وادي ظهور الجيل التالي التسلسل في تحديد وقت واحد 3 ' تحيلها وتمرير الآلاف من الجينات. هذه الزيادة في القدرة على تسلسل يتطلب تطوير خوارزميات بيوينفورماتيك لتحليل البيانات التي تنطوي على بوليادينيليشن البديلة للنهاية 3 '. لكشف حيثياته أو التحقق من صحة نظام تقييم الأداء ومن ثم تعيين النهاية 3 'للجينات الفردية من البيانات تسلسل واسعة النطاق، 3' العرق يظل أسلوب اختيار4،5. وتشمل تسلسل المدرجة في منتجات كدنا 3 'سباق عادة جزء فقط من 3' UTR يحتوي على الذيل poly(A) وموقع الانقسام، ونظام تقييم الأداء، وفي تسلسل المنبع لنظام تقييم الأداء. خلافا لبكر، الأمر الذي يتطلب تصميم واستخدام الجينات محددة إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير، 3 ' سباق فقط يتطلب اثنين الجينات محددة المتداخلة إلى الأمام الإشعال. ومن ثم، بكر يتطلب معرفة أكثر تفصيلاً من تسلسل النوكليوتيدات من منطقة كبيرة من الجينات يجري تضخيم4،6. منذ 3 ' سباق يستخدم نفس عكس التمهيدي أن أهداف الذيل poly(A) لجميع بوليادينيلاتيد الحمض النووي الريبي النصوص، إلا الإشعال إلى الأمام يجب أن تكون الجينات محددة، وبالتالي، فقط التي تتطلب معرفة بمنطقة أصغر بكثير من مرناً. وهذا يتيح تضخيم المناطق التي تسلسل لا تتسم تماما4،7. وقد سمح 3 'سباق لاستخدامها ليس فقط لتحديد نهاية 3' الجينات، ولكن أيضا تحديد وتوصيف مناطق شاسعة في المنبع لنظام تقييم الأداء التي تشكل جزءا كبيرا من 3 ' UTR. عن طريق الجمع بين 5 'سباق مع معدلة 3' سباق يتضمن أجزاء أكبر من 3 'UTR ومناطق الحماية، من الممكن تماما تسلسل أو استنساخ أكمله نسخة مرناً من النهاية 5' إلى النهاية 3 '8.

مثال على هذا التطبيق من تعديل 3 'العرق هو تحديد الأخيرة من رواية CCND1-مرك الانصهار الجينات نسخة من خطوط الخلايا"اللمفاوية خلية عباءة" ومرضى السرطان. 3 ' UTR تتألف من تسلسل من جينات كلا من CCND1 و مرك والمعاندة لميرنا البند9. اثنين متداخلة CCND1 محددة إلى الأمام الإشعال تعتبر مكملة للمنطقة المتاخمة والمتلقين للمعلومات من كودون وقف CCND1 فورا. على الرغم من أن يمكن استخدام تسلسل الترنسكربيتوم كله جنبا إلى جنب مع أدوات بيوينفورماتيك محددة للكشف عن اندماج الجينات داخل UTR 3 '10، العديد من مختبرات قد تفتقر إلى الموارد المالية أو الخبرة بيوينفورماتيك لجعل استخدام هذه التكنولوجيا. ومن ثم، 3 'العرق بديل لتحديد حيثياته والتحقق من صحة الجينات الانصهار الرواية التي تشمل 3' UTR. وبالنظر إلى زيادة في عدد الجينات الانصهار المبلغ عنها جذرية كذلك قراءة من خلال النصوص، 3 ' سباق قد أصبح أداة قوية في وصف تسلسل الجين11،12. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تسلسلات مختلفة داخل 3 'UTR فضلا عن طول 3' UTR يمكن أن تؤثر على استقرار نسخة مرناً، التعريب، طواعية، ووظيفة13. يرجع جزئيا إلى زيادة اهتمام في رسم الخرائط الترنسكربيتوم، وكان هناك زيادة في العدد من مختلف بولمرس الحمض النووي يجري تطويرها لاستخدامها في المختبر. من المهم تحديد ما أنواع التعديلات يمكن جعل 3 ' بروتوكول سباق في النظام باستخدام مرجع متاح للحمض النووي [بولمرس].

عمل هذه التقارير تكييف 3 'سباق الخريطة أكملها 3' UTR، نظام تقييم الأداء، و 3 ' نهاية الانقسام والموقع من محضر ANKHD1 باستخدام كبسولة تفجير داخل القسم ANKHD1 من النسخة وهما الحمض النووي [بولمرس] مختلفة متداخلة.

Protocol

ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات السلامة في جميع الأوقات أثناء تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول. التأكد من فتح الحاويات/الأنابيب التي تحتوي على الفينول وغوانيدين isothiocyanate الكاشف هي فقط في هود مصدقة، والتخلص من نفايات الفينول في حاوية معينة. استخدام أنابيب معقمة خالية من الدناز/رناسي ونصائح والمواد الكاشفة.

1-خلية ثقافة

  1. تنمو خط الخلية هيلا وتعليق عباءة خلية سرطان الغدد الليمفاوية الخلية سطرين، Granta-519 وجيكو-1، في دميم التي تحتوي على 10% FBS ويو/مليلتر 100 البنسلين/ستربتوميسين في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تضعف الخلايا 01:10 والعد باستخدام عداد جسيمات14.
  2. لاستخراج الحمض النووي الريبي، لوحة 500,000 الخلايا/بئر في صفيحة جيدا 6 (2 مل وسائل الإعلام كل بئر). بعد حضانة ح 24، جمع الحمض النووي الريبي من الخلايا.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. حصاد الخلايا
    ملاحظة: باستثناء خطوة الطرد المركزي، تنفيذ كافة الخطوات المذكورة في غطاء زراعة الأنسجة للحفاظ على العقم.
    1. تعليق الخلايا (جيكو-1 و Granta-519):
      1. نقل الخلايا (جنبا إلى جنب مع 2 مل من وسائل الإعلام) إلى أنبوب 15 مل، والطرد المركزي في 1,725 س ز لأدنى 5 أسبيراتي وسائل الإعلام وترك بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.
      2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 50 ميليلتر من 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS). إضافة 500 ميليلتر من أحادي الطور الفينول وغوانيدين isothiocyanate كاشف لكل عينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تخلط جيدا وتترك في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق في حين عكس أنبوب ميكروسينتريفوجي كل 1 دقيقة.
    2. للخلايا ملتصقة (هيلا):
      1. نضح خلية ثقافة وسائل الإعلام من كل بئر. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر يغسل الحطام.
      2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميليلتر من أحادي الطور الفينول وغوانيدين isothiocyanate كاشف لكل بئر.
      3. تبني على RT لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. تحلل الخلية
    1. تجميد الخليط خلية isothiocyanate الفينول وغوانيدين في-20 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يمكن أن يترك المزيج في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو حتى حاجة.
    2. ذوبان الجليد الخليط خلية isothiocyanate الفينول وغوانيدين على الجليد. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي في غطاء PCR. دوامة العينة 10-15 ق حتى يصبح الخليط الوردي ومعتمة. احتضان العينة على الجليد (عند 4 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 20,800 س ز و 4 درجة مئوية. بعناية إزالة المرحلة مائي عديم اللون العلوي (~ 200 ميليلتر) ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  3. الجيش الملكي النيبالي هطول الأمطار
    1. إضافة وحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول لكل عينة. أضف 1 ميليلتر من كوبريسيبيتانت (انظر الجدول للمواد) لكل عينة بمثابة ناقل للجيش الملكي النيبالي، والمساعدة في تصور الجيش الملكي النيبالي في الخطوات اللاحقة. احتضان العينة في-80 درجة مئوية على الأقل 4 ح. للحصول على أفضل النتائج، احتضان بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
    2. نقل العينة إلى تبريد أجهزة الطرد مركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 20,800 س ز/4 درجة مئوية؛ الجيش الملكي النيبالي ستظهر كبقعة زرقاء على الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية إزالة الايزوبروبانول من العينة. إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% وريسوسبيند بيليه بإيجاز فورتيكسينج 3 ق.
    3. إزالة أجهزة الطرد المركزي العينة في 20,800 س ز في الرايت للحد الأدنى 5 الإيثانول في كل من العينة. أيردري السماح العينة لحوالي 10 دقيقة ريسوسبيند العينة في 35 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. ضع على كتلة حرارة (65 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق للتأكد من أن الجيش الملكي النيبالي تماما في الحل، وفورا وضع الأنبوب على الجليد.
    4. تحديد تركيز مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي كما سبق ذكره، فيما عدا استخدام 1.5 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي بدلاً من 1 ميليلتر15. بشكل اختياري، تشغيل 1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي على 1% [اغروس] هلام لتحديد سلامة الحمض النووي الريبي.

3-الدناز المعاملة

  1. بعد التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي، إجراء معاملة الدناز في الجيش الملكي النيبالي إجمالي للحط من أي الحمض النووي. لكل عينة، إضافة الكواشف التالية من مجموعة خالية رناسي الدناز جعل فعل مجموع 20 ميليلتر مزيج في أنبوب ميكروسينتريفوجي منفصلة:
    1. ميكس 2 ميليلتر من الدناز 10 س رد فعل المخزن المؤقت مع 4.4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. يصل إلى ما مجموعة 14 ميليلتر بالماء.
    2. إضافة 2 ميليلتر من الدناز رناسي مجاناً. احتضان عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة حضور 2 ميليلتر من رناسي المانع (من مجموعة النسخ عكس).
    3. إضافة 2 ميليلتر من الحرارة و "يتوقف الحل" على كتلة حرارة لمدة 10 دقائق على 70 درجة مئوية لإلغاء تنشيط إنزيم الدناز.
      ملاحظة: العلاج الدناز اختيارية.

4-كدنا التوليف

حجم رد نهائي من 50 ميليلتر:

  1. حجم رد نهائي من 50 ميليلتر: 22 نقل ميليلتر من الدناز تعامل الجيش الملكي النيبالي لأنبوب جديد، أو نقل 4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي بالمياه إضافة إلى إجمالي حجم 22 ميليلتر لأنبوب جديد. إضافة 2 ميليلتر من التمهيدي25 ديناراً اليغو T7 من 10 ميكرون التمهيدي الحل. التسلسل للتمهيدي25 ديناراً اليغو T7-جككجتاتاكجاكتكاكتاتاجتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتت 5 '-3'.
  2. من مجموعة "عكس النسخ" إضافة 2 ميليلتر من مثبط رناسي (20 ش/ميليلتر) ميليلتر 8 5 x رد فعل المخزن المؤقت، 4 ميليلتر من دنتبس 10 ملم و 2 ميليلتر من المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر).
    ملاحظة: إعداد رد فعل دون المنتسخة العكسية للعمل كعنصر سلبي.
  3. احتضان في 42 درجة مئوية حاء 1 نقل مباشرة الجليد. حرارة الأنبوب عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ووضع الأنبوب على الجليد.

5-التمهيدي البحث عن نسخة الجينات الانصهار

  1. التصميم التمهيدي
    1. تحميل التسلسل كدنا من مستعرض الجينوم فرقة (ENST00000360839.6/NM_017747)، وتحديد منطقة داخل ORF من الهدف نسخة (ANKHD1) المنبع كودون التوقف. نسخ ولصق في المنطقة بأسرها (تصل إلى 700 النيوكليوتيدات) التي تحتوي على تسلسلات المنبع من كودون التوقف في منطقة إدخال تسلسل من التمهيدي تصميم البرمجيات (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. حدد خيار إظهار تصميم مخصص وحدد 10 للعدد من أجهزة الإشعال أن النظام ينبغي أن تولد (نتائج العودة) وترك كافة المعلمات الأخرى بتعيين إلى الافتراضي.
    3. اختر خمسة أجهزة الإشعال إلى الأمام والإشعال عكس اثنين غير متراكبة. ترتيب الإشعال وتشكيل مع المياه خالية من رناسي/الدناز إلى تركيز نهائي من 10 ميكرون. مزيد من التفاصيل حول التصميم العام التمهيدي لبكر مشمولة في مكان آخر16.
  2. PCR لتحديد كبسولة تفجير محتملة لاستخدامها في وقت لاحق 3 ' سباق
    ملاحظة: لتحديد الإشعال إلى الأمام النهائي استخدامها في رد الفعل، اختبار كبسولة تفجير تصميم بإعداد مجموعات مختلفة من الإشعال إلى الأمام وعكس لبكر العادية في غطاء PCR.
    1. نقل كدنا (2 ميليلتر) إلى أنبوب PCR العذبة 0.5 مل. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام و 1 ميليلتر من التمهيدي عكسي (من حل التمهيدي 10 ملم). جعل ميليلتر تصل إلى 12.5 بإضافة ميليلتر 8.5 من المياه خالية من نوكلاس. إضافة ميليلتر 12.5 2 x ميكس ماجستير بكر لجل.
    2. استخدام الشروط PCR الدراجات الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها دورات 29 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، و 72 درجة مئوية للحد الأدنى 1 وضعت دورة النهائية في 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. بعد بكر، تشغيل المنتجات على 1% [اغروس] هلام ملطخة اثيديوم بروميد. وترد تفاصيل التفريد كما سبق مع بضعة تعديلات17.
      1. حل ز 1 من [اغروس] في 100 مل من المخزن المؤقت تريس-خلات (تاي) في قارورة 250 مل. تغلي في فرن ميكروويف.
      2. إجازة يبرد لمدة 1 دقيقة وإضافة 7.5 ميليلتر اثيديوم بروميد الحل (الأوراق المالية 10 ملغ/مل) في غطاء دخان. مزيج جيد من قبل يحوم في قارورة وتصب في جهاز جل أفقي. ترك في RT في غطاء الدخان عن 30 دقيقة على الأقل للسماح للجل ترسيخ.
      3. تغطي الجل مع المخزن المؤقت x TAE 1 وتحميل 10 ميليلتر للمنتج [بكر] على [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع 3-5 ميليلتر لسلم الوزن الجزيئي الحمض النووي. تشغيل في 175 الخامس لتصور الحد الأدنى 10 المنتجات التي تستخدم تصوير، وإذا كان المزيد من الفصل بين المنتجات، تشغيل الهلام 5-10 لكل دقيقة إضافية.
  3. تحديد الإشعال المتداخلة لسباق 3 '
    1. تحليل نتائج PCR [اغروس] هلام لتحديد الإشعال التي لها عصابة PCR متميزة وقوية وواحدة. استخدام الدليل التمهيدي 5 '--معظم (ANKHD15'-ككتكككاجكجاجتتكتاك-3 ') جنبا إلى جنب مع التمهيدي25 أوليجودت T7 في بكر أول تشغيل.
    2. حدد التمهيدي المتداخلة أن يوجد المصب التمهيدي الأول (ANKHD1 5 '-كجتجاكاكاجتجاتكت-3')، واستخدامها مع التمهيدي T7 (5 '-جككتاتاكجاكتكاكتاتاج-3') في المجموعة الثانية من ردود فعل PCR.

6-تحسين 3 'سباق خريطة 3' UTR استخدام اثنين من الإنزيمات المختلفة

ملاحظة: كان هناك زيادة في تنوع بولمرس الحمض النووي يستخدم لبكر؛ ولذلك أردنا أن تحدد الشروط القياسية التي يمكن تطبيقها حتى عند استخدام إنزيمات مختلفة لردود الفعل PCR سباق 3 '. كبسولة تفجير العكسية لأي نسخة هي تظل ثابتة؛ فهذه التغييرات فقط في كبسولة تفجير الأمام المتداخلة التي محددة لنص الهدف.

  1. البروتوكول 1:3 ' سباق باستخدام بوليميراز الدنا معدلة من بيروكوككوس فوريوسوس (بفو)
    1. بكر أول
      1. نقل 1 ميليلتر من كدنا أن أنبوب بكر وإضافة 5 ميليلتر بفو x 10 رد فعل المخزن المؤقت. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام متداخلة الأولى و 1 ميليلتر من التمهيدي25 أوليجودت T7 1 ميليلتر من دنتبس (من حل 10 ملم).
      2. جعل حجم إجمالي ميليلتر يصل إلى 49 بإضافة 40 ميليلتر من الماء. أضف 1 ميليلتر من بفو دنا بوليميريز ومزيج جيد. قم بتشغيل الاسترداد باستخدام التشكيل الجانبي PCR في الجدول 1.
    2. بكر الثاني
      1. نقل 2 ميليلتر من المنتجات من PCR الأول إلى أنبوب بكر جديدة وتخلط مع 5 ميليلتر بفوx 10 "الترا الثاني" رد فعل المخزن المؤقت. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي PCR متداخلة الثاني و 1 ميليلتر من التمهيدي T7 1 ميليلتر من دنتبس (حل 10 ملم).
      2. جعل حجم رد فعل مجموع ميليلتر يصل إلى 49 بإضافة 39 ميليلتر من الماء. أضف 1 ميليلتر من بفو دنا بوليميريز. قم بتشغيل الاسترداد استخدام نفس ملف التعريف PCR كإعداد بكر الأول (الجدول 1).
  2. بروتوكول 2:3 ' سباق باستخدام بوليميريز الحمض النووي تشيميريك تتكون من مجال ربط الحمض النووي تنصهر فيها بيروكوككوس-مثل تصحيح التجارب المطبعية بوليميريز PCR ميكس الرئيسية
    1. بكر أول
      1. نقل 1 ميليلتر من كدنا أن أنبوب PCR. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام متداخلة الأولى و 1 ميليلتر من التمهيدي25 أوليجودت T7. جعل يصل إلى 25 ميليلتر بإضافة 22 ميليلتر من الماء.
      2. إضافة 25 ميليلتر من 2 × ميكس سيد بكر ومزيج جيد. استخدام PCR الدراجات الشروط الموضحة في الجدول 2.
    2. بكر الثاني
      1. نقل 2 ميليلتر من المنتجات من PCR الأول إلى أنبوب بكر جديدة. أضف 1 ميليلتر من التمهيدي PCR متداخلة الثانية جنبا إلى جنب مع 1 ميليلتر من التمهيدي عكس T7.
      2. جعل يصل إلى 25 ميليلتر بإضافة 22 ميليلتر من الماء. إضافة 25 ميليلتر من 2 × ميكس ماجستير PCR. قم بتشغيل الاسترداد استخدام نفس ملف التعريف PCR كإعداد بكر الأول (الجدول 2).

7-التحقق من المنتج بكر الثانية لسباق 3 '.

  1. تأخذ 5-10 ميليلتر الثاني بكر المنتج (فضلا عن المنتج من الجولة الأولى من تقارير إتمام المشروعات إذا تماما هو التعبير عن النسخة) وتشغيل على [اغروس] هلام. الهلام وتشغيل التفريد كما تم وصفه سابقا (الخطوات 5.2.3.1 إلى 5.2.3.3). تصور النتائج المتعلقة تصوير.

8-منتجات تنقية والتسلسل

  1. تنقية منتجات PCR جل من بكر الثاني باستخدام هلام وبكر بلغة الحمض النووي تنظيف النظام وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  2. أداء سانغر التسلسل (بدلاً من ذلك، إرسال الجل المنقي عينات المنتج بكر والإشعال التسلسل الملائم لمختبر تسلسل). تحليل البيانات التسلسل بعد سانغر التسلسل.
  3. تحميل برنامج تحليل تسلسل (انظر الجدول للمواد)، واستيراد ملفات التتبع إلى البرنامج. دعوة استخدام "قفس قاعدة" نقية الفردية (قيم جودة) للحصول على القاعدة معلومات18. تحميل تشروماتوجرام مع آثار عالية الجودة للعرض.
    اختياري: المنتج المنقي جل يمكن استنساخ باستخدام مجموعة مواد استنساخ مناسبة والمستنسخين معزولة أرسلت سانغر التسلسل.

النتائج

البحث التمهيدي إلى الأمام متداخلة:

[اغروس] هلام من ويبين الشكل 1 اثنين مميزة بكر جل المنتجات (الممرات 1 و 2) التي تستخدم نفس الأمام التمهيدي لكن الإشعال عكس مختلفة. 3 لين منتج PCR متميزة ومتميزة إلى الأمام وعكس تمهيدي. ك?...

Discussion

وعلى الرغم من ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية، على أساس الجينات بالجينات، 3 ' سباق لا يزال الأسلوب الأسهل والأكثر اقتصادا للتعرف على نظام تقييم الأداء والنيوكليوتيدات المجاورة بذيل poly(A). تكييف الموصوفة هنا يوسع استخدام 3 'سباق إلى تضخيم وخريطة تسلسل التي تشمل قسما من ORF كودون التوقف و أكملها 3...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن نعترف جيبس بيتين لمساعدتها التقنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa cellsATCCCCL-2Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cellsATCCCRL-3006Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cellsDSMZACC-342Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF6178Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/StreptomycinThermoFisherScientific15140122Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlueAmbionAM9545Coprecipitant.
DMEMThermoFisherScientific10569044Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-WaterThermoFisherScientificAM9938Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SolutionCorning21-0301X PBS.
ChloroformSigma  AldrichC7559-5VL
2-propanolSigma AldrichI9516
Reagent AlcoholSigma Aldrich793175Ethanol
Ethidium Bromide solutionSigma AldrichE1510
TRIzol ReagentThermoFisherScientific15596026Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master MixAmrescoN8672X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTPAmrescoN557
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM6101Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)New England BioLabsB7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF bufferThermoFisherScientificF531S2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymeraseAgilent Technologies600670Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo FischerK1691Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder5 Prime2500360Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha InnotechUsed to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight LadderNew England BioLabsN3233LMolecular weight DNA ladder.
Vortex MixerMidSciVM-3200
Mini CentrifugeMidSciC1008-R
Dry BathMidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000CSpectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBioRad1704469Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Power supply for gel electrophoresis.
AgaroseDot ScientificAGLE-500
Mastercycler GradientEppendorf950000015PCR thermocycler.
CentrifugeEppendorf5810 R
CentrifugeEppendorf5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up SystemPromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cellsThermoFisherScientificK280020
MyPCR Preparation Station MystaireMidSciMY-PCR24Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hoodThermoFisherScientificFume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle CounterBeckman Coulter6605698Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 3 3 3 PAS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved