適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

要約

(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。

要約

真核生物 Mrna の成熟には、ポリ a 尾部の付加を含む 3' 端形成が含まれます。遺伝子の 3' 末端をマップするために選択する従来の方法は (3' レース) の cDNA の端の急速な拡大は 3' です。3' 競争のプロトコルには、入念な設計と興味のターゲット遺伝子の 3' 非翻訳領域 (3' UTR) 内でネストされたプライマーの選択が必要です。ただし、いくつかの変更で全体 3' UTR と ORF と 3' UTR の関係のより包括的な画像を提供するオープンリーディング フレーム (ORF) 内のシーケンスを含めるプロトコルを使用できます。これは従来 3' 競争によって提供される、胸の谷間と起こるサイトだけでなく、起こる信号 (PAS) の識別に加えてです。拡張された 3' レース珍しい 3' 3' UTR、内融合遺伝子を含む UTRs を検出できるし、AU 豊富なトラン スクリプトの安定性に影響を与える要素の不安定化と同様、潜在的なマイクロ Rna 結合部位を予測するシーケンス情報を使用できます。

概要

3' 末端の形成は、ポリ a テール^1,2を作る ~ 250 untemplated アデニンの添加に続いて PAS のプレ mRNA の下流の胸の谷間を含む mRNA 成熟の重要なステップです。ポリ a 結合蛋白質 (PABP) ポリ a の尾に、これは、劣化から mRNA の転写を保護し、容易に翻訳¹。

現在の推定では、ひと遺伝子の 70% を複数のパスを持ってしたがって代替起こる、結果は複数の 3' 端³を受けるとを示唆しています。したがって、任意の特定のコピーで使用される PAS を識別し同様、ポリ a の尾が 3' UTR の残りの部分に接続する位置を特定することが重要です。次世代シーケンシングの出現は UTRs とたくさんの遺伝子の 3' の同時同定になりました。シーケンス機能のこの増加は、3' 末端の代替起こるに関連するデータを分析するバイオインフォマティクス アルゴリズムの開発を求められています。De novo検出や PAS の検証、それゆえ大規模な配列データから個々 の遺伝子の 3' 末端のマッピング、3' レース選択^4、5の方法のままです。通常 3' 競争の cDNA 製品に含まれるシーケンスには 3' UTR ポリ a の尾、胸の谷間サイト、PAS および PAS の上流のシーケンスが含まれている部分だけが含まれます。3' レースはデザインと遺伝子特定の前方および逆のプライマーの使用必要とする PCR とは異なり、2 つの遺伝子特定入れ子になった前方プライマーのみ必要があります。したがって、PCR 増幅^4,6をされている遺伝子の大きな領域の塩基配列の詳細な知識が必要です。3' レースを使用するので同じ逆、ポリ a テールすべて polyadenylated RNA 転写産物のターゲット、前方プライマーのみする必要がある遺伝子を特定、したがって、だけ mRNA の非常に小さい領域の知識を必要とする入門書です。これにより、そのシーケンスがあります完全に特徴づけられる^4,7の領域の増幅。これは、3' だけでなく遺伝子の 3' 終わりを決定するが、また判断して上流 3' UTR の重要な部分を形成する PAS の大きい地域を特徴づけるのための競争を許可しています。5' 変更された 3' 3' UTR のより大きい部分と並ぶ地域を含むレースとレースを組み合わせて、完全にシーケンスまたは 3' 端⁸に 5' 端から全体 mRNA のコピーのクローンを作成することが可能です。

この変更された 3' 競争の適用の例は、小説CCND1 MRCK融合遺伝子転写マントル細胞リンパ腫細胞株およびがん患者からの最近の id です。3' UTR CCND1とMRCKの両方の遺伝子配列から成り、miRNA 規制⁹に反抗しました。2 つ入れ子になったCCND1特定前方プライマーがすぐに隣接してCCND1の終止コドンの下流領域に補足。財源やバイオ情報を作る専門知識に多くの研究所がない場合があります特定 bioinformatic ツールと共に全体のトランスクリプトーム シーケンスを使用して、3' UTR¹⁰内遺伝子融合を検出できますが、この技術を使って。したがって、3' レースは 3' UTR を含む新規融合遺伝子のde novoの識別と確認のための代替。考えると、抜本的な報告された融合遺伝子の数の増加し同様に議事録を読んで、3' レース ツールとなっている強力な遺伝子シーケンス^11,12を特徴付けること。また、最近の研究は、3' UTR の長さと同様、そのさまざまなシーケンス内で 3' UTR mRNA 転写安定性、ローカリゼーション、訳し、および関数¹³に影響することができますを示しています。関心の高まりの一部によるトランスクリプトームをマッピングの研究室で使用するため開発されている種類の DNA ポリメラーゼの数が増加しています。どのような種類の変更させることができます 3' DNA ポリメラーゼの使用可能なレパートリーを活用するための競争のプロトコルを決定することが重要です。

この作業を適応 3' マップ全体 3' UTR にレース レポート、PAS とを使用してANKHD1の転写産物の 3' 終わり胸の谷間サイト ネスト トラン スクリプトの 2 つの種類の DNA ポリメラーゼANKHD1セクション内のプライマー。

プロトコル

このプロトコルのすべてのプロシージャの実行中は常に白衣、手袋と安全メガネを着用します。フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬容器/チューブが認定フードで指定されたコンテナー内のフェノール廃棄物処分のみ開かれているを確認します。DNAse、RNAse フリーの生殖不能の管、ヒント、および試薬を使用します。

1. 細胞培養

1. HeLa 細胞ラインと 2 懸濁液マントル細胞リンパ腫細胞株、グランタ 519 と Jeko-1、10% を含む DMEM を成長 FBS と 37 ° C で 5% CO₂と加湿のインキュベーターで 100 の U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンセル 1:10 を希釈し、粒子カウンター¹⁴を使用してをカウントします。
2. RNA の抽出、細胞/ウェル 6 ウェル プレート (ウェルあたり 2 mL メディア) の 500,000 をプレートします。24 時間培養した後、細胞から RNA を収集します。

2. RNA の抽出

1. セルを収穫
   注: 遠心分離のステップを除いて、無菌性を維持するティッシュ文化フードの記載されたすべての手順を実行します。
   1. 浮遊細胞 (Jeko 1 およびグランタ 519): の場合
      1. 15 mL チューブに (一緒に 2 mL の培地) セルを転送し、1,725 x g で 5 分間吸引メディアで遠心管の底で細胞ペレットを残します。
      2. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。500 μ L の単相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬を 1.5 mL 遠心チューブ内の各サンプルに追加します。よく混ぜ、5 分間室温 (RT) で遠心チューブを反転しながら 1 分毎のまま。
   2. 付着性のセル (hela 細胞)。
      1. 各ウェルからの細胞培養媒体を吸い出しなさい。破片を洗浄する各ウェルに 1 mL の PBS を追加します。
      2. PBS を削除し、相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の試薬の 500 μ L を各ウェルに追加します。
      3. RT で穏やかな揺動で 5 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブに転送します。
2. セル換散
   1. フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合 1 時間-20 ° c の凍結します。
      注:-20 ° c 夜間、または必要になるまでは、ミックスが残すことができます。
   2. フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合氷の上を解凍します。PCR フード遠心チューブに 100 μ L のクロロホルムを追加します。渦混合物まで 10-15 秒のサンプルは不透明なピンクです。15 分間 (4 ° C) で氷のサンプルをインキュベートします。
   3. 20,800 x g と 4 ° C で 15 分間のサンプルを遠心分離します。上部の無色の水相を慎重に取り外します (〜 200 μ L) と新しい 1.5 mL 遠心チューブに移転。
3. RNA の沈殿物
   1. 各サンプルに等量のイソプロパノールを追加します。クロムの 1 μ L を追加 (材料表を参照) を各サンプルの RNA のためのキャリアとして機能して、以降の手順で RNA の視覚化に役立ちます。少なくとも 4 時間-80 ° C でサンプルをインキュベートします。-80 ° C で一晩インキュベート最高の結果を得るには、
   2. サンプルを冷却遠心機に転送します。20,800 x g で 35 分間遠心分離機/4 ° C;RNA は、管の底に青い斑点として表示されます。サンプルからイソプロパノールを慎重に取り外します。80% エタノール 500 μ L を追加し、簡潔に 3 のボルテックスでペレットを再懸濁します s。
   3. 5 分間遠心する RT で 20,800 x g でサンプルは、すべてのエタノールをサンプルから削除します。みましょうサンプルは、約 10 分は、RNAse フリー水の 35 μ L のサンプルを再懸濁しますのために空気乾燥します。熱ブロック (65 ° C) RNA で完全にソリューションであることを確認する 5 分間に、すぐに氷のチューブを置きます。
   4. 前述したように、代わりに 1 μ L¹⁵1.5 μ L の RNA のサンプルを使用して除いて分光光度計を使用して総 RNA の濃度を決定します。必要に応じて、RNA の整合性を判断 1% の agarose のゲルの総 RNA の 1 μ g を実行します。

3. DNase 処理

1. RNA の定量化後、ゲノム DNA を低下させる総 RNA の DNAse 処理を実行します。各サンプルは、RNAse フリーの DNAse キットを 20 μ L の全反応別の微量遠心チューブにミックスを作るから次の試薬を追加します。
   1. ミックス 2 μ L の 10 DNase 反応バッファー X 総 RNA の 4.4 μ g と。水 14 μ L の合計をもたらします。
   2. RNase フリーの DNAse の 2 μ L を追加します。37 ° c (逆転写キット) から RNase 阻害剤の 2 μ L の存在下で 30 分間インキュベートします。
   3. DNAse 酵素を不活化する 70 の ° C で 10 分間の熱ブロックの停止ソリューションと熱の 2 μ L を追加します。
      注: DNAse 処理はオプションです。

4. cDNA 合成

50 μ l 反応ボリューム。

1. 50 μ L 反応量: DNase の転送 22 μ L 新しいチューブ、または新しい管へ 22 μ L の総ボリュームに追加された水の総 RNA の転送 4 μ g に RNA を扱われます。10 μ M プライマー溶液から 2 μ L の T7 オリゴ dT₂₅プライマーを追加します。T7 オリゴ dT₂₅プライマー シーケンスは 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。
2. 逆転写キットから RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 2 μ L、8 μ L の反応液の 5 倍、10 mM の dNTPs の 4 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 2 μ L を追加します。
   注: は、ネガティブ コントロールとして機能する逆転写酵素のない反応を設定します。
3. 1 h. 氷に直接転送の 42 ° C で孵化させなさい。5 分 75 ° C でチューブを加熱し、氷の上管を配置します。

5. プライマー融合遺伝子転写産物の検索

1. プライマー デザイン
   1. アンサンブルのゲノムのブラウザー (ENST00000360839.6/NM_017747) から cDNA シーケンスをダウンロードし、ターゲットのトラン スクリプト (ANKHD1) 上流停止コドンの ORF 内の領域を識別します。プライマー デザイン ソフトウェアのシーケンスのエントリ領域に終止コドンの上流シーケンスを含んでいる全体の地域 (最大 700 ヌクレオチド) のコピペ (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>)。
   2. ショー カスタム デザイン オプションを選択し、プライマーの数の 10 を選択 (返される結果) をシステムが生成するすべての他のパラメーターはデフォルトに設定しています。
   3. 5 前方プライマーと重複しない 2 つの逆プライマーを選択します。プライマーを注文し、10 μ M の最終的な集中に RNAse/DNAse 自由水で再構成します。PCR のための一般的なプライマー デザインの詳細については、別途説明¹⁶。
2. その後 3' レースで使用するための潜在的なプライマーを識別するために PCR
   注: 反応で使用する最終的な前方プライマーを確認するには、PCR フード正規 PCR のため前方および逆のプライマーのさまざまな組み合わせを設定することによって設計されたプライマーをテストします。
   1. 新鮮な 0.5 mL PCR チューブに cDNA (2 μ L) を転送します。前方のプライマーの 1 μ L と 1 μ L (10 mM プライマー液) から逆プライマーの追加します。ヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を追加することで最大 12.5 μ L を作る。12.5 μ L の PCR のゲル マスター ミックス × 2 を追加します。
   2. 次 PCR 熱サイクリング条件を使用: 95 ° C、2 分に続いて 29 サイクル 95 ° C の 30 s、60 ° C、30 秒と 1 分の 72 ° C、7 分 68 ° C で最終的なサイクルを設定。
   3. PCR 後に、エチジウム ブロマイドで染色 1% アガロースゲルの製品を実行します。電気泳動の詳細、いくつかの変更¹⁷以前に解説しています。
      1. 250 mL のフラスコでトリス酢酸 (TAE) バッファーの 100 mL の寒天 1 g を溶解します。電子レンジで沸騰させます。
      2. まま 1 分間冷却して発煙のフード エチジウム ブロマイド溶液 (10 mg/mL 在庫) 7.5 μ L を追加します。フラスコを旋回でよく混ぜるし、水平のゲル装置に注ぐ。常温固化するゲルを許可するように、少なくとも 30 分の発煙のフードを残します。
      3. 1 x TAE バッファーでゲルをカバーし、一緒に 3-5 μ L の DNA 分子量の梯子の agarose のゲルに PCR の製品の 10 μ L をロードします。10 分、撮像素子を使用している製品を可視化するため 175 V で実行し、さらに製品の分離が必要な場合追加の 5-10 分のためのゲルを実行します。
3. 入り込まれたプライマー 3' 競争のための選択
   1. 明確な強力な単一 PCR バンドを持っているプライマーを選択する PCR agarose のゲルの結果を分析します。5'-ほとんどのプライマーを使用 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC 3') 一緒に実行最初の PCR の T7 oligodT₂₅プライマー。
   2. 最初のプライマーの下流側にある入れ子になったプライマーを選択 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3')、T7 プライマーとして使用 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR の反作用の 2 番目のセット。

6. 最適化 3' 3' UTR の 2 つの異なる酵素を使用してマップするレース

注: ある pcr 法に使用される DNA ポリメラーゼの多様性の増加をしています。したがって、我々 は 3' レース PCR の反作用のための異なる酵素を使用した場合でも適用することができます標準の条件を決定したいです。任意のトラン スクリプトの逆のプライマーは一定します。唯一の変更は、ターゲットのトラン スクリプトの特定される入れ子になった前方プライマーです。

1. 1:3 のプロトコル 'ピュロ コックス ・ フリオスス (Pfu)から変更された DNA ポリメラーゼを用いたレース
   1. 最初の PCR
      1. PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送し、10 x Pfu反応バッファーの 5 μ L を追加します。(10 mM ソリューション) から最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L、T7 oligodT₂₅プライマーの 1 μ L および dNTPs の 1 μ L を追加します。
      2. 水の 40 μ L を追加することによって最大 49 μ L の総ボリュームを作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を加え、よく混ぜます。表 1に PCR のプロファイルを使用して PCR を実行します。
   2. 第 2 PCR
      1. 新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送し、10 x Pfuウルトラ II 反応バッファーの 5 μ L でミックスします。第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L、T7 プライマーの 1 μ L および dNTPs (10 mM 液) 1 μ L を追加します。
      2. 水の 39 μ L を追加することによって最大 49 μ L 全反応量を作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を追加します。最初の PCR の設定 (表 1) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。
2. 2:3 のプロトコル 'パイロコッカス融合した DNA 結合ドメインから成るキメラ DNA ポリメラーゼを用いたレース-校正のポリメラーゼ PCR マスター ミックスのような
   1. 最初の PCR
      1. PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送します。最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L と T7 oligodT₂₅プライマーの 1 μ L を追加します。水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。
      2. PCR マスター ミックス × 2 の 25 μ L を加え、よく混ぜます。表 2に記載されている PCR サイクリング条件を使用します。
   2. 第 2 PCR
      1. 新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送します。T7 逆プライマーの 1 μ L と共に第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L を追加します。
      2. 水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。25 μ L の PCR マスター ミックス × 2 を追加します。最初の PCR の設定 (表 2) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。

7. 3「レースの 2 番目 PCR 製品を確認します。

1. 2 番目の PCR の製品 (と同様のトラン スクリプトが豊富に記述された場合は pcr 法の最初のラウンドから製品) を 5-10 μ L と agarose のゲルの実行。ゲルを設定し、前述泳 (5.2.3.1 に 5.2.3.3 の手順) を実行します。イメージャーの結果を可視化します。

8. 製品の精製とシーケンス

1. 製造元のプロトコルに従ってゲルおよび PCR フラグメント DNA クリーンアップ システムを使用して 2 番目の PCR からゲルの PCR の製品を浄化します。
2. サンガーを実行シーケンス (または、ゲル精製 PCR 製品サンプルと適切なシーケンス プライマー シーケンスの研究室に送信)。サンガーにシーケンス データを分析シーケンス。
3. シーケンス分析ソフトウェアをダウンロード (材料の表を参照) し、トレース ファイルをソフトウェアにインポートします。呼び出し情報¹⁸を利用して個々 の純粋なベース QVs ベースを取得する (品質値)。高品質のトレース表示でクロマト グラムをダウンロードします。
   省略可能: ゲル精製した製品は適切なクローン作成キットとサンガーの送信分離のクローンを使用してを複製することができますシーケンス。

結果

入れ子になった前方プライマー検索:

Agarose のゲルから使用する同じ転送別逆プライマーはプライマー 2 個別 PCR のゲル製品 (レーン 1 と 2) を図 1に示します。レーン 3 個別 PCR の製品、異なる前方および逆プライマーを有しています。理想的なプライマーによる PCR 反応に使用する、1 種類?...

ディスカッション

遺伝子によ遺伝子単位での大規模な並列シーケンス技術の出現にもかかわらず 3' レースまだまま PAS とポリ a の尾に隣接したヌクレオチドを識別する最も簡単なと最も経済的な方法です。ここで説明した適応は 3' レースを使用して両方を増幅し、ORF、終止コドンと全体 3' UTR ANKHD1 mRNA のコピーの部分を含むシーケンスをマップするを展開します。3' 競争の主な利点は、いくつかのマイ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.