התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Summary

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Abstract

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3' הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3' של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע). פרוטוקולים עבור 3' המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3' האזור לא מתורגם (3' UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3' UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3' UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3' המירוץ. המורחב 3' גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3' UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3' UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

Introduction

היווצרות של הקצה 3' הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)^1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום¹.

הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3' קצוות³. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3' UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3' UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3'. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3' סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3' המירוץ נשאר לשיטת הבחירה^4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3' המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3' UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3' המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר^4,6. מאז 3' המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין^4,7. זו אפשרה 3' גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3' של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3' UTR. על ידי שילוב 5' המירוץ עם ששונה 3' המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3' UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5' שלה 3' סוף⁸.

דוגמה של יישום זה של ששונה 3' המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז'ן ג'ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3' UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה⁹. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3' UTR¹⁰, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3' המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז'ן הרומן גנים מעורבים של 3' UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז'ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3' המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג'ין-רצפים-^11,-¹². בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3' UTR, כמו גם את אורך 3' UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה¹³. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3' פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.

עבודה זו דוחות התאמה 3' גזע כדי למפות את כל 3' UTR, מלון פאס, ואתר 3' סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

Protocol

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים.

1. תרבית תאים

1. לגדול הלה תא ואת שני ההשעיה מנטל לימפומה התא שורות תאים, Granta-519 ו- Jeko-1, ב- DMEM המכיל 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה humidified עם 5% CO₂ ב 37 º C. לדלל 1:10 תאים ולספור באמצעות חלקיקים מונה¹⁴.
2. לחילוץ RNA, צלחת 500,000 תאים/היטב לתוך צלחת טוב 6 (2 מ ל מדיה לכל טוב). לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה, לאסוף RNA התאים.

2. RNA החילוץ

1. קציר תאים
   הערה: למעט השלב צנטריפוגה, לבצע את כל השלבים המפורטים בברדס תרביות רקמה כדי לשמור על עקרות.
   1. עבור תאים ההשעיה (Jeko-1 ו- Granta-519):
      1. להעביר את התאים (יחד עם 2 מ"ל של מדיה) צינור 15 mL, ו צנטריפוגה-1,725 g x עבור 5 דק וביופסיה התקשורת ולהשאיר בגדר תא בתחתית של הצינור.
      2. Resuspend בגדר תא ב- 50 µL 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS). להוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל מדגם בצינור microcentrifuge 1.5 mL. ערבבו היטב והמתינו בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות תוך כדי היפוך הצינור microcentrifuge לכל 1 דקות.
   2. עבור תאים חסיד (הלה):
      1. האחות התקשורת התרבות התא מכל קידוח. להוסיף 1 מ"ל של PBS כל טוב לשטוף את הלכלוך.
      2. להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל טוב.
      3. תקופת דגירה-RT של 5 דקות עם נדנדה עדין. העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL.
2. פירוק התא
   1. הקפאת התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, ב-20 ° C עבור 1 h.
      הערה: התמהיל יכול להיות שמאל ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד הצורך.
   2. להפשיר את התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, על קרח. להוסיף 100 µL של כלורופורם הצינור microcentrifuge בשכונה ה-PCR. מערבולת המדגם עבור s 10-15 עד התערובת הוא ורוד אטום. דגירה המדגם על קרח (ב 4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות.
   3. Centrifuge המדגם למשך 15 דקות ב 20,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את השלב העליון מימית השקופה (~ 200 µL), העברת צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
3. RNA משקעים
   1. להוסיף אמצעי שווה של אלכוהול איזופרופיל כל דגימה. להוסיף 1 µL של coprecipitant (ראה טבלה של חומרים) אחד לטעום לפעול כנשא עבור הרנ א. ולעזור להמחיש את הרנ א בצעדים העוקבים. דגירה המדגם ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה בין לילה ב- 80 ° c
   2. להעביר את הדגימה צנטריפוגה מקורר. צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 20,800 x g / 4 ° C; הרנ א תופיע כתם כחול על החלק התחתון של הצינור. הסר בזהירות את אלכוהול איזופרופיל מדגם. להוסיף 500 µL של 80% אתנול, resuspend בגדר מאת בקצרה vortexing עבור 3 s.
   3. צנטריפוגה המדגם ב g x 20,800 ב RT עבור 5 דק להסיר כל האתנול המדגם. תן הדגימה מילה נהדרת כ 10 דקות Resuspend הדגימה ב µL 35 RNAse ללא מים. מניחים על גוש חום (65 ° C) במשך 5 דקות להבטיח הרנ א יהיה מלא בפתרון, מיד במקום הצינור על קרח.
   4. לקבוע את הריכוז של RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים כאמור תיאר, אלא להשתמש µL 1.5 המדגם RNA במקום 1 µL¹⁵. באופן אופציונלי, להפעיל µg 1 של RNA הכולל ג'ל agarose 1% כדי לקבוע את תקינות ה-RNA.

3. DNase טיפול

1. לאחר כימות RNA, מבצע טיפול DNAse הרנ א הכולל כדי להשפיל את כל הדנ א. עבור כל דגימה, הוסף את ריאגנטים הבאים ערכת DNAse RNAse-חופשית כדי לגרום לתגובה הכולל 20 µL לערבב פנימה צינור microcentrifuge נפרדים:
   1. לערבב 2 µL של DNase 10 X תגובת מאגר עם µg 4.4 של RNA הכולל. מביאים סכום כולל של 14 µL עם מים.
   2. להוסיף 2 µL של נטול RNase DNAse. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות 2 µL של RNase מעכב (מתוך הערכה שעתוק לאחור).
   3. להוסיף 2 µL של פתרון להפסיק וחום על גוש חום למשך 10 דקות ב 70 ° C כדי להשבית את האנזים DNAse.
      הערה: DNAse הטיפול היא אופציונלית.

4. cDNA סינתזה

עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL:

1. עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL: 22 העברת µL של DNase מטופלים RNA צינור חדש או העברה 4 µg של RNA הכולל עם מים נוסף לאמצעי סך של 22 µL על צינור. להוסיף 2 µL של הראשיים₂₅ . dT oligo T7 מהפתרון תחל 10 מיקרומטר. הרצף עבור הראשיים₂₅ . dT oligo T7 הוא 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
2. הערכה הפוכה שעתוק להוסיף 2 µL של המדכא RNase (20 U µL), µL 8 המאגר התגובה 5 x, µL 4 של 10 מ מ dNTPs ו 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL).
   הערה: להגדיר תגובה בלי רוורס טרנסקריפטאז לפעול כמו פקד שלילי.
3. דגירה ב 42 ° C עבור ה 1 העברה ישירות לקרח. מחממים את הצינור ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים את הצינורית על קרח.

5. פריימר חיפוש של פיוז'ן ג'ין התעתיק

1. העיצוב תחל
   1. הורד את רצף cDNA מהדפדפן הגנום אנסמבל (ENST00000360839.6/NM_017747) וזהה של אזור בתוך ORF של היעד תמליל (ANKHD1) במעלה הזרם של stop codon. העתקה והדבקה של האזור כולו (עד 700 נוקלאוטידים) המכיל רצפי במעלה הזרם stop codon אל אזור הזנת רצף של תוכנת עיצוב פריימר (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
   2. בחרו באפשרות ' הצג עיצוב מותאם אישית ' ובחרו 10 עבור מספר תחל כי המערכת צריכה לייצר (תוצאות כדי להחזיר) להשאיר את כל הפרמטרים האחרים, קבע כברירת מחדל.
   3. לבחור חמישה צבעי בסיס קדמי של שני צבעי יסוד הפוך שאינם חופפים. סדר תחל, לשקם עם RNAse/DNAse ללא מים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. פרטים נוספים על פריימר כללי עיצוב עבור ה-PCR מכוסים במקום אחר¹⁶.
2. PCR לזיהוי תחל פוטנציאל לשימוש הבאים 3' המירוץ
   הערה: כדי לקבוע את צבעי בסיס קדמי הסופי כדי להשתמש בהתגובה, יש לבדוק את צבעי בסיס מעוצב על-ידי הגדרת שילובים שונים של צבעי יסוד ואחורה עבור PCR רגיל בשכונה ה-PCR.
   1. להעביר את cDNA (2 µL) צינור PCR טריים 0.5 מ. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים µL 1 של ומהצמיגים הפוכה (מתוך פתרון תחל 10 מ מ). להפוך µL עד 12.5 על-ידי הוספת 8.5 µL של נוקלאז ללא מים. להוסיף 12.5 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR-כדי-ג'ל.
   2. השתמש PCR תרמי אופניים בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחריו 29 מחזורים של 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C עבור מינימלית 1 להגדיר את המעגל הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.
   3. לאחר PCR, להפעיל את המוצרים agarose 1% ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. פרטים על אלקטרופורזה מתוארים כאמור עם שינויים מספר¹⁷.
      1. להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של טריס-אצטט (טה) מאגר בבקבוקון 250 מ. מרתיחים במיקרוגל.
      2. להשאיר להתקרר למשך 1 דקות ולהוסיף µL 7.5 של אתידיום ברומיד פתרון (המניות 10 מ"ג/מ"ל) בברדס fume. מערבבים היטב בעזרת מתערבל את הבקבוקון ויוצקים לתוך מנגנון ג'ל אופקי. יוצאים RT בשכונה fume במשך לפחות 30 דקות לאפשר את הג'ל לגבש.
      3. לכסות את הג'ל עם מאגר x TAE 1 וטען µL 10 של המוצר PCR על גבי הג'ל agarose יחד עם 3-5 µL של הסולם משקל מולקולרי הדנ א. לרוץ במהירות 175 V עבור 10 דקות לדמיין את המוצרים באמצעות imager ולאחר אם נוספת נדרשת הפרדה של מוצרים, הפעל את ג'ל למשך דקות נוספות 5-10.
3. מבחר תחל מקוננים על 3' המירוץ
   1. לנתח את התוצאות של הג'ל agarose PCR לבחירת צבעי יסוד שיש להקה PCR ברורים, חזק יחיד. להשתמש את פריימר 5'-רוב (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') יחד עם הראשיים₂₅ oligodT T7. ב ה-PCR הראשון לרוץ.
   2. בחר את פריימר מקוננת שנמצאת במורד הזרם של מן המפתח הראשון (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), ולהשתמש בו עם ומהצמיגים T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') במערכה השנייה של תגובות PCR.

6. ייעול 3' גזע כדי למפות את 3' UTR באמצעות שני אנזימים שונים

הערה: חלה עלייה המגוון של ה-DNA polymerases המשמש PCR; לכן, רצינו לקבוע תנאים סטנדרטיים שניתן להחיל גם כאשר באמצעות אנזימים שונים עבור 3' תגובות PCR המירוץ. צבעי יסוד הפוך כל תעתיק נשמרים קבוע; השינויים היחידים הם צבעי בסיס קדמי מקוננים ספציפיים על-ידי היעד.

1. פרוטוקול 1:3 ' המירוץ באמצעות של פולימראז דנ א שונה מ- Pyrococcus furiosus (Pfu)
   1. PCR הראשון
      1. 1 µL של cDNA להעביר צינור PCR ולהוסיף µL 5 10 x Pfu התגובה המאגר. להוסיף 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר₂₅ T7 oligodT, 1 µL של dNTPs (מתוך פתרון 10 מ מ).
      2. להפוך עד 49 µL הנפח הכולל על-ידי הוספת 40 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז ומערבבים היטב. הפעל את ה-PCR שימוש בפרופיל ה-PCR בטבלה1.
   2. PCR השני
      1. להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR ומערבבים עם µL 5 x 10 PfuII אולטרה התגובה המאגר. הוסף µL 1 של פריימר PCR מקונן השנייה, µL 1 של ומהצמיגים T7 µL 1 של dNTPs (פתרון 10 מ מ).
      2. להפוך עד 49 µL התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי הוספת 39 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 1).
2. פרוטוקול 2:3 ' המירוץ באמצעות פולימראז DNA chimeric המורכב של תחום איגוד ה-DNA דבוקה של Pyrococcus-כמו הגהה פולימראז PCR מיקס מאסטר
   1. PCR הראשון
      1. העברת µL 1 של cDNA צינור ה-PCR. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר₂₅ oligodT T7. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים.
      2. להוסיף 25 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR ומערבבים היטב. השתמש PCR אופניים בתנאים המתוארים בטבלה מס ' 2.
   2. PCR השני
      1. להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR. להוסיף 1 µL של השנייה תחל PCR מקוננים יחד עם µL 1 של פריימר הפוך T7.
      2. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים. להוסיף 25 µL של 2 X מיקס מאסטר PCR. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 2).

7. ודא המוצר PCR השני של 3' המירוץ.

1. µL 5-10 לקחת המוצר PCR השני (כמו גם מוצר מבית בסיבוב הראשון של מותני אם התעתיק מתבטא בשפע) ולהפעיל על agarose ג'ל. להגדיר את הג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה כאמור תיאר (שלבים 5.2.3.1 כדי 5.2.3.3). לדמיין את התוצאות imager.

8. המוצר טיהור ורצף

1. לטהר את המוצרים באמצעות PCR ג'ל PCR השני באמצעות ג'ל PCR מקטע DNA לנקות מערכת לפי הפרוטוקול של היצרן.
2. לבצע סנגר רצף (לחלופין, שלח הג'ל מטוהרים רצף המתאים תחל למעבדה רצף ודוגמאות של מוצר ה-PCR). לנתח את הנתונים רצף לאחר סנגר רצף.
3. להוריד תוכנה-ניתוח רצף (ראה טבלה של חומרים) ולייבא בקבצי המעקב לתוך התוכנה. שימוש בודדים טהור בסיס QVs (ערכי איכות) כדי להשיג את הבסיס לקרוא מידע¹⁸. הורד את chromatogram עם איכות גבוהה עקבות לצפייה.
   אופציונלי: המוצר מטוהרים ג'ל יכול להיות משובטת באמצעות ערכת השכפול המתאים שיבוטים מבודד שלח סנגר רצף.

תוצאות

חיפוש מקוננים פריימר לפנים:

הג'ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג'ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עב...

Discussion

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג'ין-מאת-גן, 3' המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3' גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3' UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.