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요약

CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

초록

진 핵 mRNAs의 성숙 3' 끝 형성을, 많은 꼬리의 추가 포함 하는 포함 한다. 유전자의 3' 끝, 지도 하기 위하여 선택의 전통적인 방법은 cDNA 끝 (3' 경주)의 3' 급속 한 확대 이다. 3' 레이스에 대 한 프로토콜 설계 및 관심의 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역 (3' UTR) 내에서 중첩 된 뇌관의 선택을 요구 한다. 그러나, 몇 가지 수정 프로토콜 포함 전체 3' UTR 및 ORF와 3' UTR 사이의 관계의 더 포괄적인 그림을 제공 하는 열려있는 독서 프레임 (ORF), 내에서 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 이것은 기존의 3' 경쟁에서 제공 하는 분열 polyadenylation 사이트 뿐만 아니라 polyadenylation 신호 (PA)의 외 이다. 특이 한 3' Utr, 3' UTR, 내 유전자 융해를 포함 하 여 검색할 수 있습니다 확장 된 3' 경주 그리고 시퀀스 정보 잠재적인 미르 바인딩 사이트 뿐만 아니라, 누구나 풍부한 사본의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요소를 불안정을 예측에 사용할 수 있습니다.

서문

3' 끝의 형성은 사전-mRNA의 하류 ~ 250 untemplated adenines 많은 꼬리1,2를 구성 하는 추가 다음 파의 분열을 구성 하는 mRNA 성숙에 중요 한 단계입니다. 많은 의무적인 단백질 (PABP) 많은 꼬리를 한다이 저하에서 mRNA 사본 보호 하 고 번역1을 용이 하 게 한다.

현재 견적 인간 유전자의 70% 여러 패스, 따라서 여러 3' 끝3인 양자 택일 polyadenylation 받아야 좋습니다. 따라서, 많은 꼬리의 3' UTR, 나머지 연결 식별 어떤 주어진된 대 본에서 사용 하는 파를 식별 하는 것이 중요 하다. 차세대 시퀀싱의 출현 Utr 및 유전자의 수천의 패스의 3' 동시 식별에 결과 있다. 시퀀싱 기능에 있는이 증가 bioinformatic 3' 끝의 양자 택일 polyadenylation 관련 데이터를 분석 하는 알고리즘의 개발을 요구 했다. 드 노 보 탐지 또는 유효성 검사는 파의 및 그러므로 대규모 시퀀싱 데이터에서 개별 유전자의 3' 끝의 매핑, 3' 경주 남아 선택4,5의 방법. 3' 경주의 cDNA 제품에 일반적으로 포함 하는 시퀀스의 3' UTR 많은 꼬리, 분열 사이트, 우선권, 및 상류는 파의 순서에 있는 부분에만 포함 됩니다. 디자인 및 유전자 특정 앞으로 역 뇌관의 사용 필요, PCR와 달리 3' 레이스만 요구 한다 2 개의 유전자 특정 중첩된 앞으로 뇌관을. 따라서, PCR 증폭된4,6되 고 유전자의 큰 영역의 뉴클레오티드 순서의 더 상세한 지식이 필요 합니다. 3' 레이스 사용 같은 뇌관 그 목표는 많은 모든 polyadenylated RNA 사본에 대 한 꼬리, 앞으로 뇌관 될 필요가 유전자 특정, 따라서,만 요구 하는 mRNA의 크게 작은 영역의 지식 역. 그 시퀀스는 완전히 특징이4,7영역의 확대 수 있습니다. 이 수 있다 3' 경주 뿐만 아니라, 유전자의 3' 끝을 결정 하지만 또한 결정 하 고 큰 지역 상류의 3' UTR 상당 부분을 형성 하는 파의 특성 사용. 5'는 수정 3' 3' UTR의 큰 부분 및 측면에 서 지구를 포함 하는 레이스와 레이스를 결합 함으로써 완전히 순서 또는 그것의 3' 끝85' 끝에서 한 전체 mRNA 사본 복제 가능 하다.

이 응용 프로그램의 수정 3' 레이스의 예는 소설 CCND1 MRCK 융합 유전자 사본 맨 틀 세포 림프 종 세포 선 암 환자에서의 최근 id입니다. 3' UTR CCND1 및 MRCK 유전자에서 시퀀스의 구성 그리고 미르 규정9완강히 저항 했다. 두 개의 중첩 된 CCND1 특정 앞으로 뇌관 즉시 인접 하 고 CCND1 정지 codon의 하류 지역에 보완 했다. 금융 자원 또는 수 있도록 bioinformatic 전문 많은 연구소 있습니다 부족 특정 bioinformatic 도구 함께 전체 transcriptome 시퀀싱 3' UTR10유전자 융해를 감지 사용할 수 있습니다, 있지만이 기술의 사용. 따라서, 3' 레이스 드 노 보 식별 및 소설 퓨전 유전자 포함 3' UTR의 유효성 검사에 대 한 대안 이다. 고려는 과감 한 보고 융합 유전자의 수에 있는 증가 뿐 아니라 성적 증명서를 통해 읽기, 3' 경주 되고있다 유전자 시퀀스11,12특성화에 강력한 도구. 또한, 최근 연구의 3' UTR 길이 뿐 아니라 3' UTR에서 서로 다른 시퀀스를 영향을 미칠 수 mRNA 사본 안정성, 현지화, translatability, 및 기능13나타났습니다. 때문에 부분 관심 증가 transcriptome 매핑, 실험실에서 사용 하기 위해 개발 되 고 다른 DNA polymerases의 증가 되었습니다. 그것은 어떤 유형의 수정 할 수 있다 3 ' 경주 프로토콜에서 DNA polymerases 사용할 수 있는 레 퍼 토리를 활용 하기 위해서는 결정 해야 합니다.

이 작품 보고 적응 3' 경주에 매핑하는 전체 3' UTR, 우선권, 및 3' 끝 분열의 사이트를 사용 하 여 ANKHD1 사본 중첩 사본 및 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 ANKHD1 섹션에서 뇌관.

프로토콜

이 프로토콜에서 모든 절차를 수행 하는 동안 항상 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 유리를 착용. 용기/튜브 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약만 인증된 후드, 그리고 지정 된 컨테이너에 페 놀 폐기물의 처분에 열려 있는지 확인 합니다. 무 균 튜브 DNAse/RNAse 무료, 팁, 그리고 시 약을 사용 합니다.

1. 세포 배양

  1. 헬러 세포 선 및 두 정지 맨 틀 세포 림프 종 셀 라인, Granta-519 및 Jeko-1, 10% 포함 된 DMEM 성장 FBS와 37 ° c.에 5% CO2 습도 인큐베이터에서 100 U/mL 페니실린/스 셀 1시 10분 희석 및 입자 카운터14를 사용 하 여.
  2. RNA 추출, 셀/잘 6 잘 플레이트 (잘 당 2 mL 미디어)에 50만 플레이트. 24 h에 대 한 보육, 후 세포에서 RNA를 수집 합니다.

2. RNA 추출

  1. 세포를 수확
    참고: 원심 분리 단계를 제외 하 고 불 임을 유지 하기 위해 조직 문화 후드에 나열 된 모든 단계를 수행 합니다.
    1. 현 탁 액 셀 (Jeko-1 및 Granta-519):
      1. 15 mL 튜브를 (함께 미디어의 2 개 mL) 셀을 전송 하 고 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 1,725 x g에서 원심 튜브의 아래쪽에 셀 펠 릿을 두고.
      2. 1 인산 염 Buffered 식 염 수 (PBS) x 50 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 각 샘플 1.5 mL microcentrifuge 관에서 monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 500 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 두고 5 분 동안 실내 온도 (RT) microcentrifuge 튜브를 반전 하는 동안 모든 1 분.
    2. 부착 세포 (HeLa)에 대 한:
      1. 각 우물에서 세포 배양 발음 각 잘 씻어 파편을 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
      2. PBS를 제거 하 고 각 잘 500 µ L monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 추가.
      3. 부드러운 락으로 5 분 동안 RT에서 품 어. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송.
  2. 세포 세포의 용 해
    1. 1 시간 동안-20 ° C에서 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합물을 고정 합니다.
      참고: 필요한 때까지 또는-20 ° C 하룻밤에 믹스를 남아 있을 수 있습니다.
    2. 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합 얼음에 녹여 PCR 후드에서 microcentrifuge 튜브에 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 혼합물까지 10-15 s에 대 한 샘플은 핑크와 불투명. (4 ° C)에서 15 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
    3. 원심 20,800 x g와 4 ° C에서 15 분에 대 한 샘플 위 무색 수성 단계를 조심 스럽게 제거 (~ 200 µ L) 및 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 전송.
  3. RNA 강 수
    1. 각 샘플에 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 합니다. Coprecipitant의 1 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각각 샘플링 하는 RNA에 대 한 캐리어로 고 이후 단계에서 RNA를 시각화 하는 데 도움이. 적어도 4 h-80 ° C에서 샘플을 품 어. 최상의 결과 얻으려면 밤새-80 ° c.에 품 어
    2. 냉각된 원심 분리기 샘플 전송. 35 분 20,800 x g에서 원심 분리기 / 4 ° C; RNA는 튜브의 하단에 푸른 반점으로 나타납니다. 조심 스럽게 샘플에서는 소 프로 파 놀을 제거. 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 간단히 3 vortexing에 의해 펠 릿 resuspend s.
    3. 원심 분리기 샘플 RT에서 20,800 x g에서 5 분에 대 한 샘플에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 하자 샘플 약 10 분 Resuspend 샘플 RNAse 무료 물 35 µ L에 대 한 건조. RNA가 완전히 솔루션을 보장 하기 위해 5 분 동안 열 블록 (65 ° C)에 배치 하 고 즉시 얼음에 튜브를 놓습니다.
    4. 앞에서 설명한, 1 µ L15대신 RNA 샘플의 1.5 µ L를 사용 하 여 제외 하 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 전체 RNA의 농도 결정 합니다. 필요에 따라 RNA 무결성을 확인 하는 1 %agarose 젤에 총 RNA의 1 µ g를 실행 합니다.

3. DNase 치료

  1. RNA의 정량화, 후 어떤 genomic DNA 저하 총 RNA에 DNAse 치료를 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 별도 microcentrifuge 튜브에서 믹스 20 µ L 총 반응 수 있도록 RNAse 무료 DNAse 키트에서 다음과 같은 시 약을 추가:
    1. 믹스 2 µ L DNase 10의 반응 버퍼 X 총 RNA의 4.4 µ g. 물으로 14 µ L의 총을가지고.
    2. 2 µ L의 RNase 무료 DNAse 추가 합니다. (반전 전사 Kit)에서 RNase 억제제의 2 µ L의 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    3. 열 블록 DNAse 효소 비활성화를 70 ° C에서 10 분 동안에 중지 솔루션 및 열 2 µ L를 추가 합니다.
      참고: DNAse 치료 선택 사항입니다.

4입니다. cDNA 합성

50 µ L의 최종 반응 볼륨:

  1. 50 µ L의 최종 반응 볼륨: 전송 22 µ L는 DNase의 새로운 튜브, 또는 전송 4 µ g 새 튜브를 22 µ L의 총 볼륨에 추가 된 물 총 RNA의 RNA 취급. 10 µ M 뇌관 솔루션에서 T7 올리고 dT25 뇌관의 2 µ L를 추가 합니다. T7 올리고 dT25 뇌관을 위한 순서는 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. 반전 녹음 방송에서 키트 RNase 억제제 (20 U / µ L)의 2 µ L, 5 배 반응 버퍼의 8 µ L, 10 mM dNTPs의 4 µ L 및 역전사 (200 U / µ L)의 2 µ L를 추가 합니다.
    주: 부정적인 컨트롤 역할 없이 역전사 반응을 설정.
  3. 1 헤 얼음에 직접 전송에 대 한 42 ° C에서 품 어. 5 분 동안 75 ° C에 튜브가 열 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.

5. 뇌관 융합 유전자 사본에 대 한 검색

  1. 뇌관 디자인
    1. 앙상블 게놈 브라우저 (ENST00000360839.6/NM_017747)에서 cDNA 순서를 다운로드 하 고 대상 (ANKHD1) 상류의 사본 정지 codon의 ORF 내의 영역을 식별. 복사 및 붙여넣기 뇌관 디자인 소프트웨어의 시퀀스 항목 영역으로 정지 codon의 상류 시퀀스를 포함 하는 전체 지역 (최대 700 뉴클레오티드) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. 표시 사용자 지정 디자인 옵션을 선택 하 고 선택 뇌관의 수에 대 한 10 시스템 (반환 결과)를 생성 한다 고 모든 다른 매개 변수를 기본값으로 설정.
    3. 5 앞으로 프라이 머와 오버랩 되지 않는 2 개의 반전 뇌관을 선택 합니다. 뇌관을 주문 하 고 10 µ M의 최종 농도에 RNAse/DNAse 무료 물으로 다시 구성 하기. PCR 위한 뇌관 일반적인 디자인에 대 한 자세한 내용은 다른 덮여 있다16.
  2. 후속 3' 경주에 사용에 대 한 잠재적인 뇌관을 식별 하는 PCR
    참고: 반응에 사용 하 여 마지막 앞으로 뇌관을 확인 하려면 일반 PCR PCR 후드에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 다른 조합을 설정 하 여 설계 된 뇌관을 테스트 합니다.
    1. 신선한 0.5 mL PCR 튜브에 cDNA (2 µ L)를 전송 합니다. 앞으로 뇌관의 1 µ L (10 mM 뇌관 솔루션)에서 역방향 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. Nuclease 무료 물 8.5 µ L을 추가 하 여 최대 12.5 µ L를 확인 합니다. 젤에 PCR 주인 혼합 x 2의 12.5 µ L를 추가 합니다.
    2. 다음 PCR 열 사이클링 조건을 사용: 95 ° C 30에 대 한 29 주기 뒤에 2 분 동안 95 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 7 분 동안 68 ° C에서 최종 주기를 설정 1 분에 72 ° C.
    3. PCR, 후 ethidium 평범한 사람으로 물 1 %agarose 젤에는 제품을 실행 합니다. 전기 이동 법의 세부 사항은 이전 몇 가지 수정17설명 합니다.
      1. Agarose 250 mL 플라스 크에 트리 아세테이트 (태) 버퍼의 100 ml에서의 1 g을 분해. 전자 레인지에 끓인 다.
      2. 1 분 동안 냉각 하 고 증기 두건에서 7.5 µ L ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL 주식)의 추가를 떠나. 플라스 크를 소용돌이로 잘 혼합 하 고 수평 젤 기구에 부 어. 응고를 젤 수 있도록 30 분 이상 증기 두건에서 RT에 둡니다.
      3. 1 x TAE 버퍼와 젤을 커버 하 고 DNA 분자량 사다리의 3-5 µ L 함께 agarose 젤에 PCR 제품의 10 µ L를 로드 합니다. 10 분 시각화는 영상 장치를 사용 하 여 제품에 대 한 175 V에서 실행 하 고 추가 제품의 분리가 필요한 경우, 추가 5-10 분에 대 한 젤을 실행 합니다.
  3. 3' 레이스에 대 한 중첩 된 뇌관의 선택
    1. PCR agarose 젤 별개, 강한, 단일 PCR 밴드 프라이 머 선택의 결과 분석 합니다. 5'-대부분 뇌관을 사용 하 여 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') 실행 하는 첫 번째 PCR에 T7 oligodT25 입문서와 함께.
    2. 첫 번째 뇌관의 하류에 있는 중첩 된 뇌관을 선택 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), T7 뇌관으로 그것을 사용 하 여 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR 반응의 두 번째 세트에서.

6. 최적화 3' 3' UTR 두 개의 서로 다른 효소를 사용 하 여 지도를 경주

참고: 계속 있다 DNA polymerases PCR;에 대 한 사용의 다양성 증가 따라서, 우리는 3' 경주 PCR 반응에 대 한 다른 효소를 사용 하는 경우에 적용 될 수 있는 표준 조건을 확인 싶 었 어 요. 어떤 사본에 대 한 역방향 뇌관; 일정 하 게 유지 됩니다. 유일한 변화는 중첩된 앞으로 뇌관 대상 성적에 대 한 관련 된에 있습니다.

  1. 1: 3 프로토콜 ' Pyrococcus furiosus (Pfu) 에서 수정 된 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 경주
    1. 첫 번째 PCR
      1. PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송 하 고 10 x Pfu 반응 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다. (10 m m 솔루션)에서 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L, T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs의 1 µ L를 추가 합니다.
      2. 물 40 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 1에 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
    2. 두 번째 PCR
      1. 첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송 하 고 5 µ L 10 x Pfu울트라 II 반응 버퍼의 혼합. 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L, T7 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs (10 m m 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다.
      2. 물 39 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 반응 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 1)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
  2. 2: 3 프로토콜 '는 공상 DNA 중 합 효소 Pyrococcus를 융합 하는 DNA 바인딩 도메인의 구성을 사용 하 여 경주-중 합 효소는 PCR 마스터 믹스 교정 처럼
    1. 첫 번째 PCR
      1. PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송. 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다.
      2. PCR 마스터 믹스 x 2의 25 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 2에 설명 된 PCR 순환 상태를 사용 합니다.
    2. 두 번째 PCR
      1. 첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송. T7 역방향 뇌관의 1 µ L 함께 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.
      2. 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다. PCR 주인 혼합 X 2의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 2)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.

7. 3' 경주의 두 번째 PCR 제품을 확인 하십시오.

  1. 받아 5-10 µ L의는 두 번째 PCR 제품 (PCRs 사본을 풍부 하 게 표현 하는 경우의 첫 번째 라운드에서 제품) 고는 agarose 젤에 실행 합니다. 젤 고 앞에서 설명한 전기 (5.2.3.1 5.2.3.3 단계)를 실행 합니다. 영상에 결과 시각화 한다.

8. 제품 정화 및 시퀀싱

  1. 젤 PCR 파편 DNA 청소 시스템을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 두 번째 PCR에서 젤 PCR 제품을 정화.
  2. 수행 생어 시퀀싱 (또는 젤 정화 PCR 제품 샘플 및 시퀀싱 실험실에 적절 한 시퀀싱 뇌관 보낼). 후 생어 시퀀싱 데이터 분석 순서.
  3. 시퀀스 분석 소프트웨어 다운로드 ( 재료의 표참조) 소프트웨어에 추적 파일을 가져옵니다. 개별 순수 베이스 QVs (품질 값) 기지를 사용 하 여 전화 정보18. 보기에 대 한 높은 품질 추적으로 크로마 다운로드.
    선택 사항: 젤 정화 제품 수 복제 될 적절 한 복제 키트와 격리 된 클론 생어에 대 한 전송 사용 하 여 연속.

결과

중첩 된 앞으로 뇌관 검색:

Agarose 젤에서 그림 1 에서는 두 가지 PCR 젤 제품 (1, 2 차선)는 사용 같은 전달 하지만 다른 역방향 뇌관 뇌관. 레인 3 뚜렷한 PCR 제품 고 뚜렷한 정방향 및 역방향 뇌관을 있다. 기반으로 하는 PCR 반응에 사용할 이상적인 뇌관은 하나의 뚜렷한 PCR 제품 (3 차선) 하는 그. ?...

토론

대규모 병렬 시퀀싱 기술, 유전자에 의해 유전자 기준의 출현에도 불구 하 고 3' 경주 여전히 남아 있다 파 및 많은 꼬리에 인접 한 뉴클레오티드를 식별 하기 위해 쉽고 가장 경제적인 방법. 여기에 설명 된 적응을 증폭 ORF, 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR ANKHD1 mRNA 사본 중의 일부를 포함 하는 시퀀스를 지도 3' 레이스 사용 하 여 확장 합니다. 3' 경주의 주요 이점은 그 몇 가지 사소한 조정으로...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 그녀의 기술 도움 Bettine 깁스를 인정 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa cellsATCCCCL-2Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cellsATCCCRL-3006Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cellsDSMZACC-342Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF6178Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/StreptomycinThermoFisherScientific15140122Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlueAmbionAM9545Coprecipitant.
DMEMThermoFisherScientific10569044Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-WaterThermoFisherScientificAM9938Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SolutionCorning21-0301X PBS.
ChloroformSigma  AldrichC7559-5VL
2-propanolSigma AldrichI9516
Reagent AlcoholSigma Aldrich793175Ethanol
Ethidium Bromide solutionSigma AldrichE1510
TRIzol ReagentThermoFisherScientific15596026Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master MixAmrescoN8672X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTPAmrescoN557
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM6101Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)New England BioLabsB7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF bufferThermoFisherScientificF531S2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymeraseAgilent Technologies600670Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo FischerK1691Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder5 Prime2500360Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha InnotechUsed to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight LadderNew England BioLabsN3233LMolecular weight DNA ladder.
Vortex MixerMidSciVM-3200
Mini CentrifugeMidSciC1008-R
Dry BathMidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000CSpectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBioRad1704469Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Power supply for gel electrophoresis.
AgaroseDot ScientificAGLE-500
Mastercycler GradientEppendorf950000015PCR thermocycler.
CentrifugeEppendorf5810 R
CentrifugeEppendorf5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up SystemPromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cellsThermoFisherScientificK280020
MyPCR Preparation Station MystaireMidSciMY-PCR24Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hoodThermoFisherScientificFume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle CounterBeckman Coulter6605698Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)Software to analyze Sanger sequencing data.

참고문헌

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