معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

Summary

ويرد وصف بروتوكول مفصلة للقيام معايرة أليسا. وعلاوة على ذلك، يرد خوارزمية جديدة لتقييم معايرة اليساس والحصول على ثابت تفكك ملزمة ليجند القابلة للذوبان لمستقبل المعطل تداولها لوحة ميكروتيتير.

Abstract

ثابت تفكك يصف التفاعل بين الشريكين في التوازن الملزم، وهو مقياس لما تقارب. أنها معلمة حاسمة لمقارنة يغاندس مختلفة، مثلاً، ومثبطات تنافسية، isoforms البروتين وطفرات، لقوتها الملزمة لشريك ملزم. ثوابت تفكك تتحدد بالتآمر تركيزات منضم مقابل يجند مجاناً منحنيات ملزمة. وفي المقابل، منحنيات المعايرة، التي يتم رسم إشارة بأن يتناسب مع تركيز يجند منضم ضد التركيز الكلي ليجند المضافة، أسهل بكثير لتسجيل. ويمكن الكشف عن الإشارة سبيكتروسكوبيكالي والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA). ويتمثل ذلك في وضع بروتوكول لمعايرة أليسا أن التدابير ربط رهودوسيتين المستمدة من السم الثعبان إلى المجال الهدف المعطل تداولها من إنتغرين α2β1. الساس معايرة تنوعاً والمستخدمة على نطاق واسع. يمكن استخدام أي زوج من البروتينات المتفاعلة مستقبلات المعطل تداولها ويجند القابلة للذوبان، شريطة أن كلا البروتينات محض، ومعروفة تركيزات. حتى الآن كانت الصعوبة تحديد ثابت تفكك من منحنى معايرة. في هذه الدراسة، هو إدخال دالة رياضية الكامنة وراء منحنيات المعايرة. دون أي تقدير العائد تشبع رسومية عرضه للخطأ، تسمح هذه الخوارزمية معالجة البيانات الخام (كثافة إشارة بتركيزات مختلفة من يجند المضافة) مباشرة بواسطة التقييم الرياضية عن طريق الانحدار غير الخطي. وهكذا، يمكن تسجيلها في نفس الوقت عدة معايرة المنحنيات وتتحول إلى مجموعة من المعالم المميزة، بينها ثابت التفكك وتركيز مستقبلات ملزم-نشطة، وأنها يمكن تقييمها إحصائيا. عندما يتم دمجها مع هذه الخوارزمية، معايرة الساس كسب ميزة مباشرة عرض ثابت التفكك. ولذلك، يمكن استخدام أكثر كفاءة في المستقبل.

Introduction

ثابت تفكك ك معلمة رئيسية لوصف التقارب من مستقبل (R) لأن يجند (L). استناداً إلى قانون العمل الجماعي، تم تعريفه ك للتوازن، الذي ينأى RL معقدة يجند مستقبلات مستقبلات R ويجند l:

            معادلة 1

مع الأرقام القياسية و التي تشير إلى الدولة الحرة/غير منضم من مستقبلات ويجند. تركيز المجمع مستقبلات-يجند RL، مطابق لتركيز مستقبلات زمنياً يجند لب. كما التركيز الكلي لمستقبلات آرتي هو مجموع مستقبلات الحرة Rو ويجند زمنياً مستقبلات صب = لب، كما يمكن كتابة ثابت التفكك ك:

        المعادلة 2

لذلك، تحقق التشبع Y، تعرف بأنها الجزء من يجند منضم لب فيما يتعلق بالتركيز الكلي لمستقبلات آرتي،

        المعادلة 3

يعتمد على تركيز يجند مجاناً لو:

        المعادلة 4

يصف هذه العلاقة الزائدي المنحنى ملزمة تفاعل مستقبلات-يجند وعلى الأرض يظهر تركيز يجند منضم لب كدالة لتركيز يجند مجاناً لو. من منحنى ملزمة، يمكن اشتقاق ثابت تفكك ك كتركيز يجند مجاناً في الغلة تشبع النصف الأعلى. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء خوارزميات مختلفة لينيريزي منحنيات الملزمة، مثل المؤامرة المزدوجة التبادلية كلوتز^1،2، أو التحولات وفقا سكاتشارد أو ترفيهي [هنس] (استعرضها بيسوانجير³). ومع ذلك، كافة الخوارزميات يعانون من مشكلة أن الحد الأقصى لقيمة المحصول التشبع، الذي اقترب من شكل مقارب بتركيزات عالية من يجند مجاناً في منحنى ملزمة، يجب أن يكون المقدر في تقييم ما قبل رسومية وبالتالي عرضه للخطأ.

وبالإضافة إلى ذلك، تحديد منحنى ملزم يتطلب التحديد الكمي ليجند حرة وغير المنضمة أثناء التوازن الملزم. وتحقيقا لهذه الغاية، قد يجند مجاناً فصلها من يجند مستقبلات زمنياً وكمياً. ولذلك، يلزم أن يجند ومستقبلات تختلف في خصائصها، مثل يجند غير البروتين بدلاً مستقبلات بروتين. إذا كان كلا الشريكين ملزم البروتينات، أنها يجب أن تكون مميزة في أحجامها، والرسوم، أو ميزات أخرى الجزيئية. ومع ذلك، التحديد الكمي لتركيزات يجند في النهج الملزمة الصغيرة مهمة صعبة. العلامات المشعة ليجند غالباً ما كانت اللازمة للكشف عن تركيز منخفض من يجند المنضم، خاصة إذا كانت كميات كبيرة من مستقبلات لم تكن متاحة أو بتكلفة معقولة. وعلاوة على ذلك، قد ننأى يجند مستقبلات زمنياً أثناء وبعد عزلة بشكل لا يستهان به. ومن ثم، أساليب معقدة، مثل التوازن هلام الترشيح⁴والتفريد الشعرية⁵نبض proteolysis⁶، مطالبون بالتحديد الكمي ليجند مستقبلات زمنياً وفصله من يجند مجاناً.

وعلى النقيض من هذه فحوصات ملزمة، لا تتطلب تجارب المعايرة فصل كمية من يجند حرة وغير المنضمة. وتحقيقا لهذه الغاية، مستقبل بتركيز ثابت هو معاير بتركيزات مختلفة من يجند المضافة. يجند منضم بالربط إلى المستقبلات، خاصية الفيزيائية التي يميزها من يجند حرة وقابلة للقياس من خلال، مثلاً، وقياس الضوء، فلوروميتري، أو الكشف عن الأجسام المضادة. وهكذا، إشارة S، والذي يتناسب مع التشبع تسفر عن ص وعليه أيضا إلى تركيز مستقبلات زمنياً يجند (لب)، يتم الكشف عن كدالة للتركيز الكلي ليجند المضافة (Lt). كل المعلمات وإشارة S والتركيز الكلي ليجند وأضاف كمياً بطريقة مباشرة وأسهل من تركيزات يجند حرة وغير المنضمة. وبخاصة، الكشف عن يجند مستقبلات زمنياً بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) يسمح بالحد حجم العينة إلى أدناه 100 ميليلتر وكذلك قياسات موازية لعدة يجند تركيزات في لوحات متعددة جيدا ميكروتيتير. في معايرة أليسا، مستقبل جسديا تمتز إلى لوحة ميكروتيتير في تركيز نفسه ومعاير مع يجند القابلة للذوبان. هي معطلة المستقبلات على سطح البلاستيك أساسا من الامتزاز مسعور. سطح تركيز مستقبلات المعطل تداولها يرتبط مع تركيز طلاء المستقبلات في علاقة غير خطية، يحتمل وفقا Langmuir´s امتزاز الايسوثرم⁷. بالإضافة إلى العدد الكلي للجزيئات الممتزة مستقبلات، حالة النشاط معلمة هامة أخرى لفحوصات المعايرة. فقط المعطل تداولها المستقبلات التي احتفظت بنشاط ملزم يجند وهي ذات الصلة للمقايسة المعايرة وتسهم في نهاية المطاف إلى التركيز الكلي ل مستقبلات نشاط البحث والتطويرt لفحص المعايرة، التي لا يمكن تحديدها مباشرة.

المواقع التي لا تغطيها مستقبلات المعطل تداولها على سطح البلاستيك، هم عرضه الجسميات البروتينات الأخرى، مثل يجند. الامتزاز المادية ليجند على مثل هذه المواقع سطح البلاستيك من شأنه أن يؤدي في إشارة مماثلة كما يجند مستقبلات زمنياً، ولكن بطريقة غير محددة. لتقليل هذه الإشارة غير محدد، مواقع سطح البلاستيك من ألواح ميكروتيتير التي قد لا تم المغلفة مع البروتين ولكن سيتم حظر مع ألبومين المصل البقري (BSA). ومع ذلك، لبعض فحوصات المعايرة مستقبلات-يجند، يمكن ملاحظة الإشارات الخلفية غير محدد. آنذاك، وغيرهم من أعوان حظر، يوصي توين 20، مثل حلاً الجيلاتين 0.2% أو 0.04 في المائة.

بعد ملزم المستقبلات، تتم إزالة يجند مجاناً بخطوتين الغسيل. يبقى يجند منضم مع المستقبلات، وهي معطلة على سطح البلاستيك من البئر microtiter، وعززت بشكل اختياري قبل التثبيت الكيميائي. للاحقة التساهمية الصليب-الربط بين يجند منضم ومستقبلات المعطل تداولها مع glutaraldehyde، يتم استبدال المادة العازلة تريس حبيس، دون أي تغيير في ربط يجند. تعطيل حبيس، على النقيض من تريس، لا جلوتارالديهيدي. الصليب-الربط التساهمي مع glutaraldehyde إصلاحات يجند منضم مع مستقبلات لها ويمنع الانفصال من خلال الخطوات اللاحقة الغسيل والحضانة. وهكذا، تفاعل مستقبلات-يجند مجمد كيميائيا وأوامر منحنى معايرة التي لا تتأثر بالخطوات اللاحقة للغسيل والحضانة. ومع ذلك، قد كيميائيا تعديل التثبيت glutaraldehyde يجند ومستقبلات بطريقة أن تفاعلها هو تخفيض أو إلغاء. وعلاوة على ذلك، قد تتغير تعديل [ابيتوبس] داخل يجند تقارب ملزم من جسم كشف، خاصة إذا كان يتم استخدام جسم [مونوكلونل] للتحديد الكمي ليجند منضم. ورغم أن أيا من هذه الآثار الضارة للتثبيت جلوتارالديهيدي يحدث في هذه المعايرة أليسا، يجب اختبار حساسية الاختبار نحو glutaraldehyde لكل تفاعل مستقبلات-يجند قبل تجربة المعايرة. بعد التثبيت، يتم إزالة glutaraldehyde الزائدة في ثلاث خطوات الغسيل مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على تريس. تريس يحللها ألدهيد المجموعات المتبقية، التي قد نونسبيسيفيكالي تتفاعل مع كشف الأجسام المضادة في الخطوة اللاحقة.

هو كمياً مقدار يجند منضم مع الأضداد المرتبطة بالانزيم، التي تعطي إشارة أليسا مضوائيه س. هذا هو رسم مقابل تركيز ل يجند مجموعt إضافة لكل بئر. على الرغم من حيازتها أسهل، منحنى المعايرة ليست وظيفة القطعي خلافا للمنحنى ملزمة. وعلاوة على ذلك، فقد غير الواضح كيفية حساب ثابت تفكك ك من منحنى معايرة. على الرغم من أن الخوارزميات منحنيات المعايرة المكتسبة سبيكتروسكوبيكالي لينيريزي أفيد بشكل مستقل ستوكل⁸ و Heyn وويشيت⁹، أنها قصرت بسبب عدم اليقين على تقدير إشارة الحد الأقصى قيمة النهج العائد التشبع بتركيزات عالية من يجند المضافة.

هنا، موصوفة معايرة أليسا وخوارزميه انحدار غير خطي لاشتقاق ثابت تفكك ك تفاعلاً يجند مستقبلات من منحنى معايرة. ويتمثل هذا البروتوكول للتفاعل بين الكولاجين-ملزمة بالمجال من α2β1 إنتغرين مع مثبط ثعبان المستمدة من السم. إينتيجرينس هي جزيئات التصاق الخلية، التوسط المرسى للخلايا في المصفوفة خارج الخلية المحيطة أو^10،الغشاء الكامنة وراء¹¹. وعلاوة على ذلك، إينتيجرينس ينقل إشارات هامة بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية عن طريق تعيين إشارات جزيئات إضافية وتشكيل خلية جديدة العضيات، أدهيسوميس، عند الخلية-مصفوفة التفاعل^{12،13، 14}-الكولاجين، يجند إنتغرين α2β1، هو البروتين الأكثر وفرة في جسم الإنسان وهو عنصر حاسم سقالات النسيج الضام¹⁵. التفاعل بين إنتغرين α2β1 والكولاجين هو توسط أ-المجال فرعية α2 إنتغرين. ويتضمن α2A إنتغرين-المجال الأيونات الموجبة ديفالينت، وهي مطلوبة من أجل ربط الكولاجين واستقرار هيكلها. يمكن بسهولة أنتجت ريكومبينانتلي في نظام تعبير بكتيرية البرية من نوع النموذج فضلا عن طفرات في المجال α2A، مثل تلك التي تم الاستعاضة عن بقايا يتعرض سطح Y216 جليكاين، ومعزولة عن طريق بهم اليغو-صاحب-العلامات مع نينتا عمود سوبيرفلوو مع الغسيل الكلوي لاحقة ضد تريس مخزنة المالحة (TBS؛ 50 مم تريس/HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم) 2 مم مجكل₂تحتوي على¹⁶. تم تحديد تركيزات بهم مع مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) واختبارها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التقليدية بهم بورتيس وملطخة بأخذ الرائعة R250 الأزرق.

التفاعل بين إنتغرين α2β1 والكولاجين محظور بواسطة ربط عنصر ثعبان السم، رهودوسيتين، من^16،الممهد حفرة الأفعى (رهودوستوما كالوسيلاسما)¹⁷. يستخدم يجند القابلة لذوبان في هذه المعايرة أليسا، رهودوسيتين تمت تنقيته من النفط الخام السم كما هو موضح سابقا¹⁶. يذوب في المحلول الملحي مخزنة حبيس (ميزانيات؛ 10 ملم حبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم) ويتم تخزينها مجمدة عند-20 درجة مئوية. تركيزه كان يحددها اتفاق التعاون الأساسي وثبتت النقاء من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. كخصم، رهودوسيتين ليس فقط كتل الكولاجين ملزم إنتغرين A α2β1 المجال، ولكن أيضا استقرار المطابقة غير نشط من إنتغرين مما يحول دون أي إشارة من الكولاجين في الخلايا أو الصفائح الدموية¹⁸. أنها من الأهمية الطبية تحديد ثابت تفكك من رهودوسيتين مع هدفها مستقبلات وهكذا كشف عن الآلية الجزيئية والأدوية المحتملة مثلاً، كعامل أنتيثرومبوتيك. تحقيقا لهذه الغاية، معايرة أليسا توصف بما في ذلك في تقييمه، وهو ينطبق على ما يقرب من أي تفاعل مستقبلات-يجند مع stoichiometry تفاعل 1:1.

Protocol

1-الأسهم الحلول

1. لتحضير 100 مل 10 x TBS درجة الحموضة 7.4 حل، حل ز 6.06 من تريس وز 8.77 من كلوريد الصوديوم في 90 مل مياه. وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بحل HCl 37% وملء الحجم إلى 100 مل مع المياه. وتصفية الحل.
2. لتحضير 100 مل 1 م حبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4 الحل، حل ز 23.83 من حبيس في 90 مل مياه. وضبط ال pH إلى 7.4 مع 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم وتعبئة الحجم إلى 100 مل بالمياه. وتصفية الحل.
3. لتحضير 100 مل محلول كلوريد الصوديوم 5 م، حل ز 29.2 من كلوريد الصوديوم في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
4. لتحضير 100 مل من م 1 MgCl₂ الحل، حل ز 20.33 مجكل₂ · 6 ح₂س في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
5. إعداد 5% الحرارة إبطال جيش صرب البوسنة في المياه، تزن 2.5 g لجيش صرب البوسنة (جزء الخامس، درجة الحموضة 7.0) في أنبوب 50 مل وحله في 45 مل مياه. ملء حل 50 مل مع المياه، والحرارة الحل في حمام مائي في 68 درجة مئوية 45 دقيقة بارد عليه في حمام الثلج وتخزينه في-20 درجة مئوية.
6. إعداد المحلول glutaraldehyde 25%.
   تنبيه: جلوتارالديهيدي هو ضار إذا ابتلع، والسمية بالاستنشاق، وتسبب الحروق. ارتداء الملابس الواقية، القفازات، وحماية العين/الوجه.
7. رفع antiserum الأرنب كما هو موضح سابقا¹⁹. عيار antiserum مصممة وفقا للبروتوكولات القياسية²⁰.
8. إعداد الأرانب المضادة الغلوبولين المناعي-الأجسام المضادة من الماعز مترافق مع الفوسفاتيز القلوية.
9. لتحضير 100 مل من محلول جليكاين 0.1 م، حل ز 0.75 من جليكاين في 90 مل مياه. ضبط درجة الحموضة إلى 10.4 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر وملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
10. لتحضير 100 مل من 0.5 متر الزنك (الثاني)-خلات الحل، حل 10.98 ز من الزنك (الثاني)-خلات · 2 ح₂س في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
11. لتحضير 100 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر، حل ز 6.0 من هيدروكسيد الصوديوم في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.

2-تجهيز المخازن المؤقتة وتعمل الحلول

1. تمييع مل 5 من 10 x TBS الهيدروجيني 7.4، مع 45 مل منزوع الماء وإضافة 100 ميليلتر من حل الأسهم₂ مجكل م 1. يبقيه في درجة حرارة الغرفة. TBS، الأس الهيدروجيني 7.4، 2 مم مجكل₂ الحل للتثبيت المستقبلات والغسيل لوحة ميكروتيتير.
2. تمييع 10 مل من 5% من الحرارة إبطال جيش صرب البوسنة في المياه و 5 مل من x TBS 10، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع المياه إلى 50 مل. إضافة 100 ميليلتر مجكل م 1₂ حل الأسهم ومزيج الحل جيد. يبقيه على الجليد وتخزينها لتجارب أخرى في-20 درجة مئوية. ملاحظة أن 2.5 مل من 1% جيش صرب البوسنة في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ مطلوبة لكل منحنى المعايرة.
3. تمييع 2.5 مل 1 م هيبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4 و 1.5 مل م 5 محلول كلوريد الصوديوم إلى 50 مل مع المياه، إضافة 100 ميليلتر م 1 MgCl₂ الحل، ومزيج حلاً شاملا لإعداد 50 مل ميزانيات، درجة الحموضة 7.4: 50 مم هيبيس/هيدروكسيد الصوديوم ، 150 مم كلوريد الصوديوم.
4. إضافة 5 ميليلتر مجكل م 1₂ حل الأسهم و 2 ميليلتر 0.5 M الزنك (الثاني)-خلات حل الأسهم إلى 5 مل م 0.1 جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4 إعداد المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP) (0.1 M جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4، 1 مم مجكل₂، 0.2 مم Zn(II)-acetate).

3-تجميد المستقبلات (إنتغرين α2A-المجال) للوحة ميكروتيتير

1. تمييع الحل الأسهم إنتغرين α2A-الملك في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ لتركيز نهائي من 5 ميكروغرام/مل.
   ملاحظة: حجم الحل الطلاء هو 650 ميليلتر لمنحنى معايرة واحدة تضم كذلك 12-صف من لوحة ميكروتيتير منطقة نصف.
2. ملء البئر كل صف على لوحة ميكروتيتير منطقة نصف مع 50 ميليلتر/بئر 5 ميكروغرام/مل طلاء الحل إنتغرين α2A-المجال (البرية من نوع أو متحولة). أداء كل صف المعايرة على الأقل في التكرارات (في هذا المثال كتوائم؛ انظر تخطيط لوحة ميكروتيتير في الشكل 1).
3. ختم اللوحة مع إحباط أو إغلاقه بغطاء. اترك اللوحة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

4-غسل "الآبار المغلفة" من "لوحة مرتين" مع TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂

1. لإزالة مستقبلات القابلة للذوبان جيدا مع 50 ميليلتر من TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم على الجزيئات التي لا معطلة على سطح البلاستيك من الامتزاز المادية وإزالة الحل الطلاء وملء كل مجكل₂.
2. إزالة الحل الغسيل. ضمان أن لا تصبح الآبار الجافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
3. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.

5-منع مواقع الربط غير محدد

1. إضافة 50 ميليلتر من حل جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ لكل بئر.
2. ختم الآبار بإحباط أو إغلاق مع غطاء.
3. احتضان الآبار من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: أي من الخطوات الاحتضان هذا البروتوكول يمكن إجراء على منصة هزاز أو تهتز. ومع ذلك، هذا غير مطلوب، ولا يغير من نتائج التجربة.

6-إعداد صف تمييع المسلسل ليجند، رهودوسيتين

1. يختلف تركيز ابدأ رهودوسيتين وعامل إضعاف إضعاف المسلسل، للحصول على مجموعة مناسبة من تركيزات يجند وتسجيل منحنى معايرة كامل مع إشارة الحد الأدنى والحد الأقصى. في هذه التجربة، توظف بتركيز ابدأ من 243 شمال البحر الأبيض المتوسط رهودوسيتين وعامل تخفيف من 2.3. تمييع الحل رهودوسيتين الأسهم إلى أعلى تركيز يجند صف تمييع المسلسل. لكل منحنى المعايرة مع عامل تخفيف من 2.3، إعداد ميليلتر 115 من 243 الحل رهودوسيتين شمال البحر الأبيض المتوسط (أي، 15,2 ميكروغرام/مل) في 1% جيش صرب البوسنة/تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ في أنبوب اختبار #1.
2. ملء ميليلتر 65 1% حل جيش صرب البوسنة في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ في أنابيب الاختبار 10، المسمى #2 عن طريق #11.
3. نقل 50 ميليلتر لتمييع رهودوسيتين من أنبوب اختبار #1 إلى أنبوب اختبار #2، مزيج من كلا الحلول (الحجم الإجمالي: 115 ميليلتر؛ وعامل التخفيف: 1:2. 3) تريتوريشن، ومن ثم نقل 50 ميليلتر من هذا الخليط في أنبوب اختبار #3، و ما إلى ذلك
4. يستمر هذا التخفيف التسلسلي حتى أنبوب اختبار #11.
   ملاحظة: وحدات التخزين في خطوات 6.1-6.4 تكفي لمنحنى معايرة واحدة. اضرب عدد replicates وحدات التخزين هذه. وفي هذه الحالة، تنفيذ ثمانية منحنيات المعايرة (توائم شكلين α2A-المجال) وإعداد وحدات التخزين التالية: 920 ميليلتر من محلول رهودوسيتين عند أعلى تركيز في أنبوب اختبار #1؛ 520 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂ لملء في كل من أنابيب الاختبار #2 إلى #11؛ و 400 ميليلتر من حجم نقل من أنبوب واحد للمرحلة التالية.

7-ملزم يجند (رهودوسيتين) بتركيزات مختلفة للمعطل تداولها مستقبلات (إنتغرين α2A-المجال)

1. إزالة الحل حظر من آبار ميكروتيتير لوحة بخط فراغ.
2. فور إضافة 50 ميليلتر من الحل رهودوسيتين في 1% جيش صرب البوسنة/تبس، درجة الحموضة 7.4/مجكل₂ الحل من أنبوب اختبار #1 في آبار عمود 1، الحل لأنبوب اختبار #2 إلى آبار عمود 2،إلخ إضافة 50 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4 ، 2 مم مجكل₂ (المخزن المؤقت لمنع وتخفيف) كعنصر تحكم خالية من يجند للآبار للعمود 12 (انظر تخطيط لوحة ميكروتيتير، الشكل 1).
3. ختم الآبار بإحباط أو إغلاق مع غطاء.
4. احتضان الآبار من أجل 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-22 درجة مئوية).

8-غسل "الآبار من لوحة مرتين" مع ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂

1. لإزالة الجزيئات يجند غير منضم، إزالة الحل الملزم وملء كل جيدا مع 50 ميليلتر من ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. ثم، قم بإزالة الحل أغسل.
2. العناية بأن الآبار لا تصبح جافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
3. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.

9-إصلاح يجند مستقبلات زمنياً مع 2.5 ٪ Glutaraldehyde في ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂

1. تعد حلاً 2.5 ٪ glutaraldehyde طازجة بخلط 1 جزء من الحل glutaraldehyde 25% و 9 أجزاء من ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂.
2. ملء كل من لوحة ميكروتيتير جيدا مع 50 ميليلتر من الحل glutaraldehyde 2.5% في ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. احتضان لوحة ميكروتيتير لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

10-غسل "آبار" لوحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂

1. لإزالة وإلغاء تنشيط glutaraldehyde الزائد، إزالة تثبيت الحل وملء كل جيدا مع 50 ميليلتر من TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. قم بإزالة الحل الغسيل.
   ملاحظة: من أجل حل التثبيت التي تحتوي على جلوتارالديهيدي من لوحة ميكروتيتير في طبق وتجاهل حل التثبيت بعد ذلك تم إلغاء تنشيطه بزيادة متساوية في حجم تبس، درجة الحموضة 7.4.
2. العناية بأن الآبار لا تصبح جافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
3. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.

11-التحديد الكمي ليجند مستقبلات زمنياً من أليسا

1. إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الأولية في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. هو الحل الأساسي جسم antiserum أرنب المثارة ضد رهودوسيتين¹⁹، وتضعف 1:2,000 في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂.
2. احتضان لوحة ل 75-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل جميع الآبار لصفيحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. غير مطلوب من القماش خلال ثلاث خطوات الغسيل، والتنصت على لوحة ميكروتيتير على أنسجة.
3. إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. وتحقيقا لهذه الغاية، يضعف الجسم المضاد الثانوي، أرنب استهداف الغلوبولين المناعي الماعز الأجسام المضادة مترافق مع الفوسفاتيز القلوية، إلى 1:2,000 في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂. احتضان لوحة ل 75-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. تعد وكالة اسوشييتد برس في الكشف عن الحل بتذويب 5 ملغ قرص يحتوي على 4-نيتروفينيل فوسفات ثنائي الصوديوم الملح سداسي هيدرات (الركيزة الفوسفاتيز) في 5 مل من المخزن المؤقت AP (0.1 M جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4، يحتوي على 1 MgCl₂ و 0.2 مم Zn(II)-acetate).
5. تغسل جميع الآبار من لوحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل₂، مباشرة قبل تنفيذ الخطوة التالية. انقر على لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة بعد آخر خطوة الغسيل لإزالة جميع آثار السائل.
6. إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل الكشف عن وكالة اسوشييتد برس إلى آبار لوحة ميكروتيتير. إضافة وكالة اسوشييتد برس في الكشف عن الحل فورا لجميع الآبار بدء عملية التحويل الانزيمية في نفس الوقت قدر الإمكان. ولذلك، استخدام ماصة متعدد القنوات.
7. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل في الآبار مع أعلى تركيز يجند بدوره الصفراء.
   ملاحظة: قد تختلف فترة حضانة المرض بين 5 دقائق وح 1 اعتماداً على كثافة إشارة.
8. إيقاف تحويل الركازة الفوسفاتيز بإضافة 50 ميليلتر/جيدا من حل هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر. ترك مكانة لوحة لعدة دقائق لضمان خالية من الانتصارات خلط كل الحلول. تبرر فترة الحضانة نفسها في جميع الآبار، استخدام ماصة متعدد القنوات وإضافة 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم بنفس الترتيب إضافة إلى الآبار للركيزة في الكشف عن وكالة اسوشييتد برس في خطوة 11.8.
9. قياس الكثافة البصرية (OD) في 405 نانومتر لكل بئر بقارئ أليسا.

12-تقييم الإشارات المعايرة

1. قم بفتح جدول البيانات الخام، وقيم_405nm OD، مع Excel. كما يتم قراءة هذه القيم إشارة من منحنيات المعايرة في الصفوف، تبديل القيم إلى العمود والتسمية مع التركيزات ليجند المضافة في عمود آخر.
2. قم بفتح المنشور جرافباد 5 (الإصدار 5.0). افتح ملف مشروع جديد في القائمة الرئيسية. اختر تنسيق س وص تحت البيانات الجديدة والرسم البياني. اختر الخيار Enter ونقطة واحدة لكل قيمة الأرض على المحور الصادي.
3. نسخ العمودين، تركيز ليجند المضافة وإشارة الملف القيم (OD_405nm ) من excel ولصقها في ورقة البيانات من "منظور جرافباد" ك X و Y قيم، على التوالي.
4. فتح البرنامج الفرعي تحليل جرافباد المنشور 5 واختر الخيار الانحدار غير الخطية تحت س ص-التحليل. اختر معادلة المعرفة من قبل المستخدم واضغط على زر جديد لإنشاء معادلة جديدة.
5. اكتب المعادلة منحنى المعايرة في الشكل: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X))/(2*R) سمين + + ب * س إلى الورقة قالب افتتح حديثا، مع Y يجري قيمة إشارة ق، س يجري تركيز يجند المضافة ل ، R يجري التركيز المعطل تداولها مستقبلات، ك أن ثابت تفكك، ويجري الخلفية ب المنحدر. تعريف القيود المناسبة، مثل ك > 0 و R > 0.
   ملاحظة: هذه المعادلة هي المعادلة نفسها من المعادلة 9 بشكل مختلف.
6. تحليل القيم الموجودة في ورقة البيانات باختيار المعادلة المعرفة من قبل المستخدم الذي تم إنشاؤه حديثا. افتح الجدول مع القيم المحسوبة تقريب (K, RtSكحد أقصى، Sدقيقةوب) التي تظهر أسفل المقطع النتيجة على الجانب الأيسر من شاشة البرنامج.
   ملاحظة: البرنامج يحدد معالم 5 باحتواء تكرارية من الانحدار غير الخطي فقط إذا كان منحنى المعايرة يتكون من نقاط البيانات على الأقل 5.
7. تقييم معلمات ك وارتي, Sكحد أقصى، Sدقيقة، وب لكل مجموعة من منحنيات المعايرة إحصائيا، وربط المعلمات بميزة معينة من المجموعة (يجند تحور أو تعديلها كيميائيا أو مستقبلات).

النتائج

بعد أليسا قد وضعت، اللون الأصفر من الركازة المحولة الفوسفاتيز القلوية، الفقرة--نيتروفينولاتي، ويشير إلى أن إنقاص مقدار يجند رهودوسيتين منضم مع تناقص تركيزات رهودوسيتين المضافة من الأعمدة 1 إلى 11 (الشكل 1). وتظهر الآبار عديم اللون في آبار رهودوسيتين خ...

Discussion

أليسا المعايرة نظام اختبار متعددة لتحديد الانفصال من تفاعل مستقبلات-يجند. المعايرة تلتف أليسا ضرورة لفصل يغاندس الحرة وهي مقيدة فعلياً وتحليل تركزاتها كمياً، أكثر بكثير من الدراسات والمنشورات استخدمت معايرة الساس بدلاً من تسجيل منحنيات ملزمة . وعلاوة على ذلك، معايرة اليساس سهلة لأداء و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant		isolated in author's lab
NiNTA superflow column	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit	Fisher Scientific	23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V	Applichem	A1391
25 % solution of glutaraldehyde	Merck	354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Zn(II)-acetate	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar half-area microtiter plate	Thermo Scientific	Corning 3690
micro reaction tubes	Eppendorf	30120086
Microplate ELISA reader	BioTek	Synergy HT