적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

요약

자세한 프로토콜 ELISA 적정 수행을 설명 합니다. 또한, 새로운 알고리즘 적정 ELISAs를 평가 하 고 결정 플레이트 움직일 수용 체 성 ligand의 바인딩의 분리 상수를 제공 됩니다.

초록

분리 상수 바인딩 평형에 두 업체 간의 상호 작용을 설명 하 고 그들의 선호도의 측정 이다. 그것을 비교할 다른 ligands, 예를 들면, 경쟁 저 해제, 단백질 isoforms 및 돌연변이, 바인딩 파트너에 게 그들의 바인딩 강도 대 한 중요 한 매개 변수입니다. 분리 상수 플로팅 바인딩 곡선으로 바인딩된 대 무료 ligand의 농도 의해 결정 됩니다. 반면, 적정 곡선, 바인딩된 ligand의 농도에 비례 하는 신호 추가 ligand의 총 농도 대 한 플롯은 훨씬 쉽게 기록할 수 있습니다. 시선 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 신호를 감지할 수 있습니다. 이것은 뱀 독에서 파생 된 rhodocetin α2β1 integrin의 고정된 대상 도메인에 바인딩을 측정 ELISA 적정에 대 한 프로토콜에서 궁 행. 적정 ELISAs 다목적 널리 사용 됩니다. 두 단백질은, 순수 하 고 그들의 농도 알려진 고정된 수용 체와 녹는 ligand 상호 작용 단백질의 어떤 쌍 든 지를 사용할 수 있습니다. 지금까지 어려움은 적정 곡선에서 분리 상수 결정 되었습니다. 이 연구에서는 적정 곡선을 기본 수학 함수 소개 된다. 채도 수확량의 어떤 오류가 그래픽 평가 없이이 알고리즘 아닌-선형 회귀를 통해 수학 평가 의해 직접 원시 데이터 (추가 ligand의 다른 농도에서 농도 신호)의 처리를 허용 한다. 따라서, 여러 적정 곡선을 동시에 기록 하 고 분리 상수 및 바인딩-활성화 수용 체의 농도 그들의 사이에서 특성 매개 변수 집합으로 변형 수 그리고 그들은 통계적으로 평가 될 수 있다. 이 알고리즘와 결합 하면, 적정 ELISAs 분리 상수를 직접 제시의 이점을 얻을. 따라서, 그들은 미래에 보다 효율적으로 사용할 수 있습니다.

서문

분리 상수 K는 그것의 ligand (L)에 대 한 수용 체 (R)의 선호도 설명 하는 핵심 매개 변수입니다. 대량 작업의 법칙에 따라, K는 수용 체 ligand 복잡 한 RL R 수용 체와 리간드 l: 분리 평형에 대 한 정의

            공식 1

수용 체와 ligand의 무료/언바운드 상태를 나타내는는 인덱스 f 와. RL, 수용 체 ligand 복합물의 농도 수용 체 바인딩 ligand Lb의 농도. 수용 체 Rt 의 총 농도 무료 수용 체 Rf 와 수용 체 ligand 바인딩 Rb 의 합 = Lb, 분리 상수 또한 쓸 수:

        공식 2

따라서, 채도 항복 Y, 바인딩된 리간드 Lb 수용 체 Rt의 총 농도의 관계의 일부분으로 정의

        식 3

무료 리간드 Lf의 농도에 따라 다릅니다.

        방정식 4

이 쌍곡선 관계 수용 체 ligand 상호 작용의 바인딩 곡선을 설명 하 고의 음모 무료 리간드 Lf의 농도의 기능으로 바인딩된 리간드 Lb 의 농도 보여 줍니다. 바인딩 곡선에서 분리 상수 K 반 최대한 채도 항복 무료 ligand의 농도 파생 될 수 있습니다. 또한, 다른 알고리즘을 바인딩 커브를 선형화 설립 되었습니다, Klotz^1,2또는 Scatchard 또는 헤 인 즈 (Bisswanger³검토) 변환에 의해 더블-상호 음모 등. 그러나, 모든 알고리즘 asymptotically 무료 ligand 바인딩 곡선에서의 높은 농도에서 접근 된다, 채도 수율의 최대값 그래픽 사전 평가에서 추정 될 수 있다 며 따라서 문제에서 고통 오류 발생.

또한, 바인딩 곡선의 결정 바인딩 평형 동안 자유롭고 바인딩 ligand의 정량화를 해야합니다. 이 위해 무료 ligand 수용 체 바인딩 ligand에서 분리 하 여 정량 있다. 따라서, ligand와 수용 체는 단백질 수용 체는 반대로 비 단백질 ligand 등 그들의 속성에 다 해야 합니다. 두 바인딩 파트너 단백질 인 경우에, 그들은 그들의 크기, 비용, 또는 다른 분자 기능에서 구별할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 소규모 바인딩 접근에 있는 ligand 농도의 정량화 어려운 작업입니다. ligand의 방사성 라벨 자주 되었습니다 바운드 ligand의 낮은 농도 검출 하는 데 필요한 특히 수용 체의 상당한 양의 없는 경우 사용할 수 또는 저렴 한. 또한, 수용 체 바인딩 ligand 무시할 수 비 방식에서 중과 격리 후 분리 수 있습니다. 따라서, 평형 젤 여과⁴,⁵, 모 세관 전기 이동 법 및 펄스 베이스⁶, 같은 복잡 한 방법을 수용 체 바인딩 ligand를 계량 하 고 무료 ligand에서 그것을 분리 하는 데 필요한 있습니다.

이러한 바인딩 분석 실험, 달리 적정 실험에서는 바운드 및 무료 ligand의 정량적 분리가 필요 하지 않습니다. 이 위해, 일정 농도에서 수용 체 추가 ligand의 다른 농도와 적정 이다. 수용 체에 바인딩하여 바인딩된 ligand는 무료 ligand에서 그것을 구별 하 고, 예를 들어, 광도, fluorometry, 또는 항 체 검출에 의해 측정 되는 생물 속성이 있습니다. 따라서, S, 채도에 비례 하는 신호 Y를 항복 하 고 따라서 또한 수용 체 바인딩 ligand (Lb)의 농도를 감지 추가 ligand (Lt)의 총 농도의 기능으로. 매개 변수, 신호 S 및 추가 ligand의 총 농도 바운드 및 무료 ligand의 농도 보다 직접적이 고 쉽게 방식으로 측정할. 특히, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 수용 체 바인딩 ligand 감지 다 잘 결정 접시에 100 µ L 아래에 샘플 볼륨의 감소 뿐만 아니라 여러 ligand 농도의 병렬 측정 허용. ELISA 적정에서 수용 체 물리적으로 동일한 농도에서 결정 플레이트에 흡착 이며 수용 성 리간드로 적정. 수용 체는 움직일 수 플라스틱 표면에 본질적으로 소수 성 흡착에 의해. Langmuir´s 흡착 등온선⁷에 따라 가능성이 비선형 관계에 수용 체의 코팅 농도와 고정된 수용 체 상호의 표면 농도. 흡착된 수용 체 분자의 전체 숫자 이외에 그들의 활동 상태가 적정 분석에 대 한 또 다른 중요 한 매개 변수입니다. 만 움직일 수 수용 체 ligand 바인딩 활동 유지, 적정 분석 결과 대 한 관련 되 고 결국 직접 확인할 수 없는 적정 분석 결과의 활성 수용 체 Rt 의 총 농도에 기여.

플라스틱 표면에 고정된 수용 체에 포함 되지 않습니다이 사이트는 ligand 같은 다른 단백질을 흡착 하는 경향이 있다. 같은 플라스틱 표면 사이트 리간드의 물리적 흡착 수용 체 바인딩 ligand로 유사한 신호에서 아직 일반적인 방식으로 발생 합니다. 이 일반적인 신호는 단백질으로 코팅 하지 아직 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 차단 될 것입니다 결정 접시의 플라스틱 표면 사이트를 줄이기 위해. 그러나, 일부 수용 체 ligand 적정 분석에 대 한 일반적인 배경 신호를 관찰할 수 있습니다. 그런 다음, 다른 차단 에이전트 0.04% 또는 0.2% 젤라틴의 솔루션 등 트윈 20는 것이 좋습니다.

수용 체에 바인딩을, 후 무료 ligand 두 세척 단계에 의해 제거 됩니다. 바운드 ligand 수용 체, 결정 잘의 플라스틱 표면에 움직일 이며 선택적으로 화학 기정에 의해 강화 된 남아 있습니다. 후속 공유 교차 결합의 바인딩된 ligand와도 함께 고정된 수용 체에 대 한 버퍼 물질 트리 ligand 바인딩에 어떤 변화 없이 HEPES에 대 한 대체 됩니다. HEPES, 트리 스, 달리도 비활성화 하지 않습니다. 도와 공유 교차 결합 그것의 수용 체 바인딩된 ligand 해결 이후 세척 및 인큐베이션 단계 동안 그것의 분리를 방지 한다. 따라서, 수용 체 ligand 상호 작용 화학적으로 고정 하 고 영장 적정 곡선을 세척 및 외피의 후속 단계에 의해 영향을 받지 않습니다. 그러나, 글 고정은 ligand와 같은 방식으로 그들의 상호 작용의 감소 또는 폐지는 수용 체에 화학적으로 수정할 수 있습니다. 또한,는 리간드 내에서 epitopes의 단일 클론 항 체 바인딩된 ligand 척도를 사용 하는 경우에 특히 탐지 항 체 바인딩 선호도 변경할 수 있습니다. 비록 어느 쪽도 정착의 이러한 부작용의 발생이 적정 ELISA에서에서,도로 시험의 감도 적정 실험 전에 모든 수용 체 ligand 상호 작용에 대 한 테스트 되어야 한다. 고정, 후 초과 트리 스 포함 된 버퍼와 3 개의 세척 단계에서 제거 됩니다. 트리 스 nonspecifically 후속 단계에서 항 체를 검출 반응 수 있는 나머지 알데하이드 그룹은.

바인딩된 ligand의 양 광도 ELISA 신호 미를 제공 하는 효소 연결 된 항 체와 계량 이 추가 총 ligand 농도 Lt 대 플롯은 각 잘 하. 쉽게 인수에 불구 하 고 적정 곡선 쌍곡선 함수 바인딩 곡선 달리 아니다. 또한, 그것 되었습니다 분명 적정 곡선에서 분리 상수 K를 계산 하는 방법. 시선 인수 적정 곡선을 선형화 하는 알고리즘을 독립적으로 보고 되었습니다 하지 Stockell⁸ 및⁹에 있는 Heyn와 Weischet 의해, 하지만 그들은 최대 신호 추정의 불확실성으로 인해 미흡 값은 채도 수익률 추가 ligand의 높은 농도에 접근 한다.

여기, ELISA 적정 및 비 선형 회귀 알고리즘 기술 적정 곡선에서 수용 체 ligand 상호 작용에 대 한 분리 상수 K를 파생 된다. 이 프로토콜은 뱀 독 파생 억제제와 integrin α2β1의 콜라겐 바인딩 A 도메인의 상호 작용에 대 한 궁 행. Integrins는 세포 접착 분자, 주변 기질 또는 기본 지하실 멤브레인^10,11셀의 앵커리지 중재. 또한, integrins 모집 추가 신호 분자 및 새로운 휴대 organelles, 세포-매트릭스 상호 작용^12,13, 에 adhesomes를 형성 하 여 세포와 세포 외 매트릭스 사이 중요 한 신호 전달 ¹⁴. 콜라겐, α2β1 integrin의 ligand의 가장 풍부한 단백질 이며 결합 조직¹⁵의 중요 한 비 계 구성 요소. Α2β1 integrin과 콜라겐 사이 상호 작용은 integrin α2 소 단위의 A 도메인에 의해 중재 됩니다. Integrin α2A-도메인 포함 divalent 양이온, 콜라겐 바인딩 필요 하 고 그것의 구조를 안정화 합니다. 야생-타입 폼으로 있는 것과 같은 표면 노출 찌 꺼 기 Y216는 글리신에 대 한 대체 했다 α2A 도메인의 돌연변이 세균 식 시스템에서 recombinantly 생산를 수 통해 그들의 올리고-그의-태그는 NiNTA와 절연 TRIS 버퍼 염 분 (TBS, 50 m m TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) 포함 2 m MgCl₂m¹⁶에 대 한 후속 투와 superflow 열. 그들의 농도 bicinchoninic 산 분석 결과 (BCA)로 결정 했다 그리고 그들의 순도 기존의 SDS 페이지 테스트 Coomassie 화려한 블루 R250 스테인드.

Α2β1 integrin과 콜라겐 사이 상호 작용은 뱀 독 구성 요소, 말레이 모사 (Calloselasma rhodostoma)^16,17에서 rhodocetin의 바인딩에 의해 차단 됩니다. 이 적정 ELISA에에서 수용 성 리간드로 사용, rhodocetin 원유에서 정제는 앞에서 설명한¹⁶독. HEPES 버퍼링 염 분 (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl)에 용 해 하 고-20 ° c.에 냉동 저장 그것의 농도 BCA에 의해 결정 되었다 고 그 순도 SDS 페이지에 의해 입증 되었다. 길 항 제로 rhodocetin 뿐만 아니라 콜라겐은 integrin에 바인딩 차단 α2β1 A-도메인, 하지만 또한 그로 인하여 어떤 세포 또는 혈소판¹⁸로 콜라겐에서 신호 방지 integrin의 비활성 형태를 안정 시킨다. 그것은 그것의 수용 체 표적으로 rhodocetin의 분리 상수를 결정 하 고 따라서 그것의 분자 메커니즘 및 제약 잠재적인 예를 들어, 지원을 에이전트로 해명에 생물 의학 중요성의. 이 위해, 그것의 평가 포함 하 여 설명 하는 ELISA 적정을 1:1 상호 작용 산출할와 거의 모든 수용 체 ligand 상호 작용에 적용 됩니다.

프로토콜

1. 재고 솔루션

1. 10 x TBS의 100 mL pH 7.4 솔루션을 준비 하려면 분해 트리 스와 이온을 제거 된 물 90 mL에 NaCl의 8.77 g 6.06 g, 7.4 37 %HCl 솔루션에 pH를 조정, 볼륨 100 mL을 이온을 제거 된 물,를 필터링 솔루션.
2. 1의 100 mL를 준비 하 M HEPES/NaOH, pH 7.4 솔루션 23.83 g HEPES의 이온을 제거 된 물 90 mL에 녹, 1.5 M NaOH와 7.4 pH 조정, 볼륨 100 mL을 이온된 수로를 필터링 솔루션.
3. 5 M NaCl 용액 100 mL를 준비 하려면 29.2 g NaCl의 이온을 제거 된 물 90 mL에 용 해. 이온을 제거 된 물 100 mL에 볼륨을 필터링 솔루션.
4. 100 mL의 1 M MgCl₂ 솔루션을 준비, 해산 20.33 g MgCl₂ · 6 H₂O의 이온을 제거 된 물 90 ml. 이온을 제거 된 물 100 mL에 볼륨을 필터링 솔루션.
5. 준비 물에 5% 열 비활성화 BSA, 50 mL 튜브에 BSA (분수 V, pH 7.0)의 2.5 g 무게 하 고 이온을 제거 된 물 45 mL에 용 해. 이온된 수, 50 ml 솔루션 작성 및 45 분 얼음 목욕에서 그것을 냉각 하 고-20 ° c.에 그것을 저장할 68 ° C에서 물 욕조에 솔루션을 열
6. 25%도 용액을 준비 합니다.
   주의:도 유해한 경우에 삼 켜, 흡입에 의해 독성 이며 화상의 원인. 장갑, 보호복을 착용 하 고 눈/얼굴 보호.
7. 앞에서 설명한¹⁹로 토끼 원으로를 올립니다. 원으로 titer²⁰표준 프로토콜 따라 결정 되었다.
8. 염소 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 활용에서 안티 토끼 면역 글로불린 항 체를 준비 합니다.
9. 100 mL의 0.1 M 글리신 솔루션을 준비, 글리신 이온 물 90 ml에서의 0.75 g을 분해. 1.5 M NaOH 솔루션 10.4 pH를 조정 하 고 이온된 수 100 mL에 볼륨을 채워 필터링 솔루션.
10. 0.5 M Zn (II) 100 mL를 준비-아세테이트 솔루션, 10.98 g Zn (II)의 해산-아세테이트 · 2 H₂O의 이온을 제거 된 물 90 ml. 이온을 제거 된 물 100 mL에 볼륨을 필터링 솔루션.
11. 1.5 M NaOH 솔루션의 100 mL를 준비 하려면 6.0 g NaOH의 이온을 제거 된 물 90 mL에 용 해. 이온을 제거 된 물 100 mL에 볼륨을 필터링 솔루션.

2. 준비 버퍼 솔루션 작업

1. 5 10 x TBS pH 7.4의 45 mL와 함께 이온된 물 희석 고 1 M MgCl₂ 재고 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 실내 온도에 그것을 유지. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 솔루션 결정 접시를 세척 하 고 수용 체의 동원 정지입니다.
2. 물에 열 비활성화 BSA의 5% 및 10 x TBS의 5 mL 50 mL에 이온된 수와 pH 7.4의 10 mL를 희석. 1 M MgCl₂ 재고 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 솔루션을 잘 섞는다. 얼음에 그것을 유지 하 고-20 ° c.에 추가 실험을 위해 그것을 저장합니다 참고 1% BSA TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 에서 그 2.5 mL는 각 적정 곡선 필요 합니다.
3. 1의 2.5 mL를 희석 M HEPES/NaOH, 이온 물 50 mL에 pH 7.4와 1.5 mL 5 M NaCl 해결책 100 µ L 1 M MgCl₂ 솔루션을 추가 하 고 철저 하 게 준비 하는 HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH의 50 mL 솔루션 혼합 150 mM NaCl.
4. 1 M MgCl₂ 재고 솔루션의 5 µ L를 더하고 2 µ L 0.5 M Zn (II)-5 mL 0.1 M 글리신 솔루션, pH 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼 (0.1 m M 글리신 솔루션, pH 10.4, 1 mM MgCl₂, 0.2 m Zn(II)-acetate) m를 준비 하는 10.4 아세테이트 재고 솔루션.

3. 결정 플레이트 (Integrin α2A-도메인) 수용 체의 동원 정지

1. Integrin α2A-TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 5 µ g/mL의 최종 농도 대 한 도메인의 재고 솔루션을 희석.
   참고: 볼륨 코팅 솔루션의 절반 지역 결정 플레이트의 12 음 행으로 구성 된 한 적정 곡선에 대 한 650 µ L입니다.
2. 50 µ L/잘 integrin α2A 도메인 (야생-타입 또는 돌연변이)의 5 µ g/mL 코팅 솔루션의 절반 지역 결정 접시에 행의 모든 잘 채워. 중복에 적어도 모든 적정 행 수행 (쌍둥이;이 예제에서 그림1에서 결정 판의 레이아웃 참조).
3. 호 일 접시를 밀봉 하거나 뚜껑을 닫습니다. 밤새 4 ° C에서 접시를 남겨 주세요.

4. 세척 코팅 웰 스는 접시 두 번 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 와

1. 수용 성 수용 체를 제거 하려면 하지 플라스틱 표면에 물리적 흡착에 의해 움직일 되어 코팅 솔루션을 제거 하 고 각 채우기 분자 잘 TBS, pH 7.4, 2mm의 50 µ L와 MgCl₂.
2. 세척 솔루션을 제거 합니다. 우물 건조가 되지 않습니다 확인 하십시오. 따라서, 잔여 액체를 제거 하려면 조직 옷감에 결정 플레이트를 누릅니다 하지 않습니다. 다단계 피 펫 또는 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 신속 하 게 우물을 채우기 위해.
3. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.

5. 일반적인 바인딩 사이트 차단

1. TBS, pH 7.4, 각 음을 2 m m MgCl₂ 에 1 %BSA 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
2. 호 일 우물을 다시 봉인 또는 뚜껑을 닫습니다.
3. 실 온에서 1 h에 대 한 웰 스를 품 어.
   참고:이 프로토콜의 인큐베이션 단계 락 또는 떨고 플랫폼에서 수행할 수 있습니다. 그러나,이 필요 하지 않습니다 하 고 실험의 결과 변경 하지 않습니다.

6. 리간드, Rhodocetin의 직렬 희석 행 준비

1. Rhodocetin의 시작 농도 직렬 희석, ligand 농도의 적절 한 범위를 및 최소 및 최대 신호 전체 적정 곡선 기록의 희석 요인이 다. 이 실험에서 243 nM rhodocetin의 시작 농도 및 2.3의 희석 비율을 사용 합니다. 직렬 희석 행의 가장 높은 ligand 농도에 rhodocetin 재고 솔루션을 희석. 2.3 희석 요소와 각 적정 곡선, 1%에서 243 nM (즉, 15,2 µ g/mL) rhodocetin 솔루션의 115 µ L를 준비 BSA/TBS, pH 7.4, 테스트 튜브 # 1에서에서 2 mM MgCl₂ .
2. TBS, pH 7.4, #2 #11-표시 10 시험관에서 2 mM MgCl₂ 에 1 %BSA 솔루션의 65 µ L을 입력 합니다.
3. 테스트 튜브 # 1에서에서 rhodocetin 희석의 50 µ L를 전송 테스트 튜브 #2, 혼합 두 솔루션 (전체 용량: 115 µ L, 희석 비율: 1:2. 3) 분쇄, 그리고 테스트 튜브 #3, 등 이 혼합물에서 전송 50 µ L
4. 테스트 튜브 # 11까지 직렬이 희석을 계속 합니다.
   참고: 단계 6.1 6.4에서에서 주어진 볼륨 한 적정 곡선에 대 한 충분 한 있습니다. 이러한 볼륨 복제의 수에 곱하십시오. 이 경우 8 적정 곡선 (2 개의 α2A 도메인 형태의 쌍둥이)를 수행 하 고 다음 볼륨 준비: 테스트 튜브 #1;에 높은 농도에서 rhodocetin 솔루션의 920 µ L TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ #2 ~ #11; 테스트 튜브의 각 입력에서 1 %BSA 520 µ L 그리고 중 하나에 1 개의 관에서 전송 볼륨의 400 µ L.

7. 바인딩 Ligand (Rhodocetin)를 서로 다른 농도에서 수용 체 (Integrin α2A-도메인) 움직일

1. 진공 라인에 의해 결정 판 우물에서 차단 솔루션을 제거 합니다.
2. 즉시 추가 1 %rhodocetin에서 솔루션의 50 µ L BSA/TBS, 테스트 튜브 #1 열 1, 열 2, TBS, pH 7.4에에서 1 %BSA등 추가 50 µ L의 우물을 테스트 튜브 # 2의 솔루션의 우물으로 pH 7.4/MgCl₂ 솔루션 2 m m MgCl₂ (차단 및 희석 버퍼) ligand 무료 컨트롤로 열 12 (레이아웃 결정 판, 그림 1참조)의 우물을.
3. 호 일 우물을 다시 봉인 또는 뚜껑을 닫습니다.
4. 상 온 (약 20-22 ° C)에서 1.5 h에 대 한 웰 스를 품 어.

8. 세척 우물의 플레이트 두 번 HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 와

1. 비 바운드 ligand 분자를 제거 하려면 바인딩 솔루션을 제거 하 고 각 채우기 HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂의 50 µ L로 잘. 그런 다음 세척 솔루션을 제거 합니다.
2. 돌 우물 건조가 되지 않습니다. 따라서, 잔여 액체를 제거 하려면 조직 옷감에 결정 플레이트를 누릅니다 하지 않습니다. 다단계 피 펫 또는 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 신속 하 게 우물을 채우기 위해.
3. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.

9. 2.5% 수용 체 바인딩 Ligand 수정 HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 에

1. 25%도 솔루션의 1 부분과 HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂의 9 부분을 혼합 하 여 신선한 2.5%도 솔루션을 준비 합니다.
2. HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂에서 2.5%도 솔루션의 50 µ L로 결정 판 모든 우물을 채우십시오. 실 온에서 10 분을 위한 결정 플레이트를 품 어.

10. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ 의 50 µ L/잘 접시 세 번의 워시 우물

1. 제거 하 고 초과 비활성화, 고정 솔루션을 제거 하 고 각 채우기 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂의 50 µ L로 잘. 세척 솔루션을 제거 합니다.
   참고: 결정 판에서 글에 포함 된 고정 솔루션 그릇에 부 어 하 고 TBS, pH 7.4의 동일한 볼륨에 의해 비활성화 된 후 고정 솔루션을 삭제.
2. 돌 우물 건조가 되지 않습니다. 따라서, 잔여 액체를 제거 하려면 조직 옷감에 결정 플레이트를 누릅니다 하지 않습니다. 다단계 피 펫 또는 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 신속 하 게 우물을 채우기 위해.
3. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.

11. 일 라에 의해 수용 체 바인딩 Ligand의 정량화

1. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂에 1 %BSA 50 µ L/우물의 1 차적인 항 체 솔루션을 추가 합니다. 1 차적인 항 체 솔루션은 토끼 원으로 rhodocetin¹⁹에 대 한 발생, TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂에 1 %BSA 1:2,000 희석.
2. 실 온에서 75-90 분 동안 접시를 품 어. 세 번와 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂의 50 µ L/잘 접시의 모든 우물을 씻어. 3 단계 세척, 조직에 결정 플레이트의 도청 중 천으로 필요 하지 않습니다.
3. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂에 1 %BSA 50 µ L/잘 이차 항 체 솔루션을 추가 합니다. 이 위해, 이차 항 체, 토끼 면역 글로불린을 대상으로 염소 항 체 알칼리 성 인산 가수분해 효소, TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂에 1 %BSA 1:2,000 함께 활용 된 희석. 실 온에서 75-90 분 동안 접시를 품 어.
4. 4-nitrophenyl 인산 disodium 염 hexahydrate (인산 가수분해 효소 기질) AP 버퍼 (0.1 m M 글리신 솔루션, pH 10.4, 포함 하는 1 m m MgCl₂ 와 0.2 m m Zn(II)-acetate)의 5 ml에서를 포함 하는 5 mg 태블릿을 용 해 하 여 AP 검색 솔루션을 준비.
5. 세 번의 TBS, pH 7.4, 다음 단계를 수행 하기 전에 즉시 2 m m MgCl₂, 50 µ L/잘 사용 판 모든 우물을 씻어. 액체의 모든 흔적을 제거 하는 마지막 세척 단계 후 조직 옷감에 결정 플레이트를 누릅니다.
6. 50 µ L/AP 검색 솔루션의 잘 결정 접시의 우물을 추가 합니다. 가능한 동시에 효소 변환 하려면 모든 우물에 AP 검색 솔루션을 신속 하 게 추가 합니다. 따라서, 다중 채널 피 펫을 사용 합니다.
7. Ligand 밀집 된 우물에서 솔루션 노란색 차례 때까지 실 온에서 접시를 품 어.
   참고: 5 분 및 신호 강도 따라 1 시간 사이 부 화 시간이 달라질 수 있습니다.
8. 50 µ L/잘 1.5 M NaOH 솔루션을 추가 하 여 인산 가수분해 효소 기판의 변환을 중지 합니다. 두 솔루션의 혼합 연속 무료 되도록 몇 분 동안 접시 서를 둡니다. 모든 우물에 동일한 잠복기를 보증, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여를 단계 11.8에서에서 AP 탐지 기판의 우물에 추가 된 동일한 순서로 1.5 M NaOH를 추가 합니다.
9. 405에서 광학 밀도 (OD)를 측정 각 잘 ELISA 리더의 nm.

12입니다. 적정 신호 평가

1. Excel과 원시 데이터, OD_405nm 값의 테이블을 엽니다. 적정 곡선의 신호 값이 행에서 읽고는, 열을 다른 열에 추가 된 ligand의 농도와 레이블 값을 조 변경할.
2. Graphpad Prism을 5 (버전 5.0)을 엽니다. 주 메뉴에서 새 프로젝트 파일을 엽니다. 새 데이터 및 그래프에서 XY 형식을 선택 합니다. Y 축에 대 한 Enter 및 플롯 각 값에 대 한 단일 지점 옵션을 선택 합니다.
3. 두 개의 열, 추가 ligand의 농도 복사 하 고 값 (OD_405nm 값)는 excel에서 파일을로 GraphPad Prism의 데이터 시트에 붙여넣을 신호 X 및 Y 값, 각각.
4. GraphPad Prism 5 분석 하위 프로그램 열고 비 선형 회귀 XY 분석아래 옵션을 선택 합니다. 사용자 정의 방정식 을 선택 하 고 새로운 방정식을 만들기 새로운 버튼 을 누릅니다.
5. 적정 곡선 방정식 형태로 입력: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + y 신호 값 S, 추가 리간드 L의 농도가 되 고 X 되 고 새롭게 문이 연된 템플릿 시트 B * X R의 농도 되 움직일 수용 체, 되 고 분리 상수 K와 B 배경 되 고 경사. 정의 적절 한 제약 조건, K > 0와 R > 0.
   참고:이 방정식은 다른 형태의 방정식 9의 동일한 방정식.
6. 새로 작성 된 사용자 정의 방정식을 선택 하 여 데이터 시트의 값을 분석 합니다. 계산 된 근사치 값으로 테이블을 열고 (K, Rt,최대S, S분, 그리고 B)는 소프트웨어 스크린의 왼쪽에 있는 결과 섹션 아래에 표시 됩니다.
   참고: 소프트웨어는 적정 곡선 적어도 5 데이터 포인트의 구성 하는 경우에 비-선형 회귀의 반복 피팅 여 5 매개 변수를 결정 합니다.
7. 매개 변수 K, Rt,최대S, S분및 B 적정 곡선의 모든 그룹에 대 한 통계, 평가 하 고 (돌연변이 또는 화학 수정 ligand 또는 수용 체) 그룹의 특정 기능 매개 변수를 연관.

결과

후에 ELISA 개발 되었습니다, 변환 된 알칼리 성 인산 가수분해 효소 기질, 파라-nitrophenolate의 노란 색, 바인딩된 rhodocetin ligand의 금액에서 추가 된 rhodocetin의 농도 감소와 감소 열 1 ~ 11 (그림 1). 무색 열 12에에서 rhodocetin 무료 우물 우물 낮은 배경 신호를 표시합니다.

405에서 광도 정량화 nm 제공 분석 ...

토론

ELISA 적정 수용 체 ligand 상호 작용의 분리를 결정 하는 다양 한 테스트 시스템입니다. 적정으로 ELISA circumvents 자유롭고 바운드 ligands를 효과적으로 분리 하 고 양적, 그들의 농도 분석을 실질적으로 더 많은 연구 필요성 및 간행물 바인딩 곡선을 기록 하는 대신 적정 ELISAs 고용 . 또한, 적정 ELISAs 수행 수용 체 그리고 ligand의 합리적으로 낮은 금액을 필요로 하는. 분리 상수의 정확한 분석에 대 한 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant		isolated in author's lab
NiNTA superflow column	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit	Fisher Scientific	23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V	Applichem	A1391
25 % solution of glutaraldehyde	Merck	354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Zn(II)-acetate	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar half-area microtiter plate	Thermo Scientific	Corning 3690
micro reaction tubes	Eppendorf	30120086
Microplate ELISA reader	BioTek	Synergy HT