نيوفاسكولاريزيشن آيريس المستحثة بثقب كنموذج الفأر من إيريديس روبيوسيس

Summary

نيوفاسكولاريزيشن آيريس، مضاعفة شائعة لترويه الشبكية، قد يؤدي إلى الزرق نيوفاسكولار تهدد البصر. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مورين لحمل neovascularization آيريس التجريبية التي يمكن استخدامها لتقييم موسع للأوعية تحوير المواد.

Abstract

يصف لنا نموذج نيوفاسكولاريزيشن التي يسببها ثقب القزحية كنموذج عام لتقييم موسع للأوعية. هذا النموذج أيضا ذات الصلة لاستهداف نيوفاسكولار الزرق، مضاعفات التي تهدد البصر لاعتلال الشبكية السكري. هذا الأسلوب يرتكز على استحثاث آيريس استجابة الأوعية الدموية بسلسلة من ثقوب uveal الختم الذاتي على الفئران بالب/ج، ويستفيد من نضوج المفرج العين الماوس بعد الولادة. ويخضع الجراء الماوس ثقوب uveal من يوم الولادة 12.5، عندما فتح الجراء عيونهم، حتى يوم الولادة 24.5 بطبيعة الحال. نظراً لشفافية القرنية، القزحية المفرج يمكن تحليلها بسهولة عبر الزمن بأساليب موسع في فيفو . علاوة على ذلك، يمكن أن يكون شبه شفاف قزحية بالب/ج الفئران فلاتمونتيد لتحليل إيمونوهيستولوجيك مفصلة مع تلوين الخلفية غير محددة الحد الأدنى. في هذا النموذج، تولد الأوعية هو أساسا مدفوعا التحريضية وتفعيل نظم البلاسمينوجين. نموذج المستحثة بثقب هو الأول من حمل neovascularization آيريس في القوارض الصغيرة، وفي الاستفادة من السماح المباشر موسع في فيفو تحليل عملية الأوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن ضم النموذج مع الأوعية تحوير المواد، الذي يسلط الضوء على إمكاناتها في دراسة الأوعية مع وجهة نظر في فيفو .

Introduction

وتضم قزحية العين، جنبا إلى جنب مع الجسم الهدبي والمشيميه، عنبية، الذي هو أكثر vascularized أنسجة العين. المفرج آيريس ضروري للحفاظ على التوازن في الغرفة الأمامية للعين. نتيجة لوفرة اتصالات أناستوموتيك بين الشرايين والاوردة، الأوعية الدموية آيريس توفير المواد الغذائية وإمدادات الأوكسجين إلى قزحية العين نفسها، بل في كامل الجزء الأمامي من العين¹.

تشكيل أوعية دموية جديدة، أو الأوعية من تلك القائمة من قبل، هو أمر أساسي في العمليات الفسيولوجية، مثل التنمية والجرح الشفاء². وتولد الأوعية ناعما ينظم العديد من العوامل المتعارف عليه، مثل عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) ومثبط منشط البلاسمينوجين (PAI)، فضلا عن عدة عوامل الالتهابات، واختلال هذه العوامل يمكن أن تؤدي إلى باثولوجي ³من الأوعية.

في العين، وهو نيوفاسكولاريزيشن سبب الأمراض التي تهدد البصر، مثل اعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR) والزرق نيوفاسكولار (نفج). في هذه أمراض العين، neovascularization التنسيق يقع عادة في أنسجة الشبكية، إلا أن عدم التوازن في الالتهابات والعوامل الأوعية في كلا الأمامي والخلفي العين دوائر العين ارتبط إيريديس روبيوسيس، مصطلح السريرية لايريس نيوانجيوجينيسيس المرضية⁴. وتبين هذه الأمراض قدرة القزحية الكبار الخضوع لتولد الأوعية. في الفئران، غير ناضجة المفرج العين بعد الولادة ويستمر نضج بعد الولادة. هو استغلال هذا خصوصية للتنمية في طراز الماوس الأوكسجين الناجم عن اعتلال الشبكية، نموذج الذي يحاكي عن كثب الحالة السريرية لاعتلال الشبكية الخداج⁵. وباﻹضافة إلى ذلك، تولد الأوعية والتهاب تلعب دوراً محوريا في الجرح الشفاء الآليات⁶، والجرح شفاء نفسها تم إقرانها مع الأوعية نماذج⁷.

في هذه الدراسة، يصف لنا نموذج نيوفاسكولاريزيشن التي يسببها ثقب القزحية. وتجري ثقوب uveal قرب الحد الخارجي ليمبوس، الذي حمل neovascularization آيريس بأحداث الجرح الشفاء النظام. يمكن أن يكون سبب شفافية القرنية، القزحية المفرج تحليلها بسهولة في فيفو بأساليب موسع. عيون ثقب الحالي أي بزيادة قدرها سرير الأوعية الدموية في القزحية، التي ارتبطت بزيادة تنشيط البلاسمينوجين وعلامات التهابات⁸. نموذج عرض إمكانات كبيرة كأداة جديدة لدراسة الأوعية وفحص المركبات الأوعية، ويسمح مباشرة في فيفو التصور عمليات الأوعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

استخدمت الماوس بالب/ج الجراء من أي من الجنسين وفقا للبيان "استخدام الحيوانات" في أوفثالمولوجيك والبحوث الرؤية، والبروتوكولات كانت وافقت عليها اللجنة في ستوكهولم "بحوث الحيوان الأخلاقية". كانت الفئران في ليتر، جنبا إلى جنب مع الأم المرضعة، مع دورة اليوم/الليل ح 12، وحرية الوصول إلى الغذاء والماء، وترصد يوميا.

ملاحظة: لإجراء العمليات الجراحية، أبقيت الفئران تحت التخدير مع isoflurane متقلبة. يتم تثبيط المراهم العينية خلال إجراءات العين، كما أنها قد تتداخل مع العلاجات والمواد المستخدمة. إذا لزم الأمر، لمنع العين الجاف، يمكن تطبيق قطره المحلول الملحي العادي العقيمة. على الرغم من ثقوب uveal الشفاء الذاتي، تم الحرص خلال ثقوب uveal ضمان العقم مع الأدوات الجراحية. العلاج بعد الجراحة وشملت الماء مع المحلول الملحي العادي تحت الجلد، والتسكين مع الإدارة الموضعية العين هيدروكلوريد جهاز. الجراء سمح باسترداد إلى ريكومبينسي القصية على وسادة تدفئة قبل إعادتهم إلى الأم المرضعة، في قفص نظيف. وأبقى ليتر مع نفس الأم المرضعة لتجنب الإجهاد.

1-التخدير

1. إعداد قاعة تحريض التخدير، إدارة isoflurane مخدر، وضمان أن قناع الفأرة صغيرة ويقترن أيضا.
   ملاحظة: إجراء التجارب على الحيوانات كل الاتفاق مع جميع التصاريح الأخلاقية الواجبة التطبيق.
2. بريفيل قاعة توجيهي مع 3-4% isoflurane المتطايرة في الهواء الجوي.
   ملاحظة: مواد مخدر مختلفة أخرى من إيسوفلوراني يمكن، وفقا لتصاريح الأخلاقية. وينبغي أن يتم إجراءات مخدر المتقلبة على غطاء مقاعد البدلاء أو الأبخرة التهوية.
3. مكان الولادة (ف) عمرها 12.5 يوما بالب/ج ماوس جرو في قاعة التعريفي. التأكد من أن جهاز تخدير، مستعدة لتقديم إيسوفلوراني إلى الدائرة التعريفي.
   ملاحظة: يتم الجراء الماوس الهشة ومعالجة أفضل من القفا. الحفاظ الجراء معا كالقمامة أو مع الأم المرضعة لتجنب الإجهاد.
4. تسمح ألجرو تكون تخديره تماما.
5. بلطف، تلتقط ألجرو الماوس قبل القفا.
   ملاحظة: الاحتفاظ التعريفي الدائرة المغلقة في جميع الأوقات لتحريض آمنة ومستقرة.
6. نقل الماوس إلى قناع القوارض. تأكد من التبديل تدفق مخدر من قاعة التعريفي للقناع عند تحريك الماوس.
7. إجراء رشة إصبع القدم للتأكد من التخدير.

2-الثقب الداخلي تحت ستيريوسكوبي الجراحية

1. وضع مؤشر الماوس في الموضع الأفقي ريكومبينسي. تأكيد القناع في وضع جيد حتى في مجال الرؤية ستيريوسكوبي العين الماوس.
2. بلطف تدوير رأس الماوس حتى العين هو مواجهة تجاه ستيريوسكوبي.
   ملاحظة: يجب أن يتحقق التركيز الواضح للعين تحت ستيريوسكوبي. لتحديد المواقع، وينصح بير 16 س، بينما 40 س ينبغي أن تستخدم لإجراء العملية الجراحية. إذا الأخلاقية تصاريح تسمح بذلك، التشذيب غيض شعيرات يمكن تسهيل تصور العين.
3. استخدام الملقط التلازم الصغيرة، بعناية نتا العين ألجرو بتطبيق الضغط النزولي على الجفون الظهرية والبطني للعين.
4. الاحتفاظ بعقد لطيف ولكن الثابت من غطاء العين ألجرو، مع ملقط صغير.
   ملاحظة: من المستحسن إجراء نتوء العين وغطاء عقد مع الجهة غير المهيمنة، كما اليد المهيمنة يجب إجراء ثقب.
5. استخدام ستيريوسكوبي تحديد موقع ليمبوس القرنية. يمكن بسهولة تحديد ألبينو بالب/ج ليمبوس الضفيرة الوعائية الدائري الخلفي للقرنية.
6. بإبرة مشطوف الحواف قطرها (30 غ) 0.25 مم، تنفيذ ثقب uveal صغير، قرب حدود حوفي الخلفي عنبية. استخدام سوى غيض الإبرة، ولا يزيد عن نصف المجسم مشطوف الحواف (أي ما يعادل 0.5 مم)، ثقب في عنبية. إذا نفذت بشكل صحيح، ثقوب uveal الختم الذاتي، بعد الحقن داخل مقلة العين لمواد الدراسة يمكن أن تدار من خلال ثقب الجرح نفسه.
   ملاحظة: إذا واجهت مع الماوس تشريح العين، ينفذ الثقب uveal بين الجسم الهدبي وسيراتا أورا. ويجب الحرص أثناء أداء ثقب uveal لتجنب تمزيق العدسة.
7. إجراء ثقب uveal الثاني في الموقع المعاكس للعين من أول موقع الثقب. تحسين المسافة والموقف من ثقوب؛ تنظر 12 ثقوب 06:00 ص, 12:00 م ويجري الظهرية قدر الإمكان.
8. كرر الإجراء ثقوب uveal كل أربعة أيام حتى P24.5. قبل كل ثقب uveal المتعاقبة، رصد حالة الحيوان مع إيلاء اهتمام خاص لوجود الساد الصدمة بسبب تلف العدسة خلال ثقب uveal أو ضغط العين تناقص واضح. تهدف لتنفيذ تكرار ثقوب في نفس المواقف ثقوب السابقة للآثار المثلى.

3-موسع في فيفو الرصد

1. قبل ثقب أو حقن كل يوم التجريبية، تخدير الماوس كما يؤديها أعلاه.
2. باستخدام الماوس في الموضع الأفقي ريكومبينسي، بلطف نتا العين.
3. التركيز على المفرج قزحية مع ستيريوسكوبي الجراحية.
4. التقاط صورة للمفرج قزحية العين بكاميرا مزودة ستيريوسكوبي الجراحية.
   ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري، الذي يحفز الانقسام يمكن مفيدة لتطبيع المنطقة آيريس للحيوان الواحد. تنظر تصاريح الأخلاقية عند اختيار عامل يحفز الانقسام الاختزالي. تركيز دقيق للمفرج آيريس سيسهل مواصلة التحليل الكمي. ويوصي بقوته 40 س.

4-بعد العمليات الجراحية الرعاية

1. إزالة ألجرو بالب/ج من القناع القوارض، وأنه نقل بلطف إلى تدفئة لوحة الطبقات مع حصيرة جراحية.
2. تطبيق قطره واحدة من حل جهاز 1% لعيون ثقب.
   ملاحظة: حلول مسكن أخرى يمكن، وفقا لتصاريح الأخلاقية.
3. هيدرات الحيوان بحقنه تحت الجلد من 200 ميليلتر من المحلول الملحي العادي العقيمة.
4. العودة ألجرو إلى الأم المرضعة في قفص ماوس نظيفة.
5. رصد عملية الاسترداد. ألجرو وينبغي أن تكون قادرة على ديمبولاتي والعودة إلى القمامة.

5-العين انوكلييشن

1. Euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم. أداء انوكلييشن والتشريح تحت ستيريوسكوبي لرؤية أفضل لهذا الإجراء.
   ملاحظة: يمكن استخدام إجراءات مختلفة القتل الرحيم. من المستحسن أن تلتزم التصاريح الأخلاقية.
2. سحب بعيداً في الجفون لتحسين التعرض للعين.
3. جعل قطع صغيرة (حوالي 0.5 سم) قرب كانتوس الجفن العين مع منحنى مقص العين في بون.
4. استخدام المساحة بيريوكولار المكشوفة لإدراج الملقط التلازم الصغير خلف (إطار) من أنحاء العالم في المدار.
5. انتزاع الأنسجة المحيطة بالعين واجذب إلى أعلى. تجنب التمسك مقلة العين، واستخدام الأنسجة المحيطة بها أقرب إلى محجر العين.
6. إدراج منحنى المقص العين بون وراء العالم العين في المدار.
7. قطع طريق الأنسجة المحيطة بها حتى يتم الإفراج عن العين من مأخذ التوصيل.
   ملاحظة: هذا الأسلوب تشريح يحافظ تشريح العين ويفيد التحليل اللاحق.
8. الشروع في إزالة أنسجة دخيلة من العين. وتتم إزالة أنسجة غريبة بعد إصلاح، إذا فضلت.
   ملاحظة: بالب/ج الفئران هي الميلانين ضعيفة، بالتالي، لزيادة التباين، يوصي خلفية داكنة لتيسير إجراء تشريح.
9. بإيجاز مليئة شطف الجامع-العين في طبق بتري معقم مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
10. نقل العين إلى أنبوب 2 مل تحتوي على 1.5 مل من محلول الفورمالين مخزنة 4%.
11. إصلاح العين ح 6 في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تحديد يضفي صلابة الأنسجة وتسهل تشريح لقزحية العين. وينبغي اختبار تحديد الوقت وتعديلها لتطبيقات مختلفة.

6-آيريس التشريح الداخلي تحت ستيريوسكوبي

1. إزالة الحل مثبت من الأنبوب مع ماصة باستور بلاستيك 1.5 مل (أو ما شابه)، وشطف العين ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد.
2. ضع العين الثابتة في سطح أملس جافة (تشريح الوقوف) مع الغرفة الأمامية التي تواجه صعودا.
3. مع مشطوف الحواف ز 30 إبرة، أداء نقطة إدخال اللاحق ليمبوس.
4. عقد الجزء الأمامي مع الملقط التلازم الصغيرة، إدراج تلميح واحد مقص مستقيم كليمان فانس في الفتحة التي تم إنشاؤها مسبقاً.
   ملاحظة: من المستحسن للتحكم الملقط باليد غير المهيمنة ومقص مع المهيمنة.
5. بينما تناوب العين مع الملقط التلازم، قص حول ليمبوس لإزالة الجزء الخلفي من العين.
   ملاحظة: إجراء تخفيضات جزئية سيسمح الحافة الداخلية مقص الاستمرار في الأنسجة، وإلى حد كبير يسهل العملية.
6. ضع الجزء الأمامي تواجه إلى الأسفل، وفضح العدسة.
7. قم بإزالة العدسة بعناية قبل الاستيلاء عليه مع ملقط صغير وسحب صعودا.
   ملاحظة: يمكن استخدام إبرة مشطوف الحواف للثقب وسحب العدسة.
8. ضع الجزء الأمامي مع القرنية إلى الأسفل وقطع عمودي على مجال الرؤية.
9. بلطف انتزاع الأنسجة الخلفي للجسم الهدبي بالملقط التلازم الصغيرة.
10. مع كليمان Vannas مقص مستقيم، نشرع في تقليم فقط عرفت الجسم الهدبي لإزالة ميشوورك ترابيكولار، وعزل قزحية العين. التأكد من أن تتم إزالة ميشوورك ترابيكولار؛ وينبغي نقل القزحية داخل القرنية.
11. نقل فنجان العين الأمامي بعناية مع الملقط التلازم الصغيرة، عقد القرنية، لوح 96-كذلك تحتوي على 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
12. الاستمرار بالضغط القرنية في البئر وتشريح القزحية بالتنظيف مع برنامج تلفزيوني مع ماصة.
    ملاحظة: إذا كانت ملتصقة تظل قزحية العين للقرنية، بعض ميشوورك ترابيكولار قد تكون حاضرة، والمجسم مشطوف الحواف ز 30 إبرة يمكن للمساعدة مما أدى إلى تشريد قزحية العين.
13. إزالة القرنية من 96-جيدا مع الملقط التلازم الصغيرة، وتبقى القزحية معزولة في البئر لمزيد من التحليل.
14. تخزين العينات آيريس التعويم الحر في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: على الرغم من يجري إصلاحها، التخزين على المدى الطويل من عينات آيريس التعويم الحر لا ينصح.

7-إمكانية Read-Outs التجريبية

1. تصور الأوعية الدموية في قزحيات تشريح، استخدام التعويم الحر الجامع-جبل immunohistochemistry تلطيخ أساليب لعلامات مثل الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء (بيكم)-1 أو إيسوليكتين B4. بدلاً من ذلك، استخدم نضح الجسم كله مع تلطيخ الأوعية الدموية، مثل ديكسترانس المسمى الفلورية العالية الوزن الجزيئي.
2. استخدام في فيفو الصور موسع لتنفيذ في السيليكون مسطحة تركيب وقياس المفرج القزحية التام مع برامج التصوير المناسبة.
   ملاحظة: يمكن تحديده كمياً المفرج، سواء في فيفو و في المختبر، باستخدام قياس كثافة أو مع المفرج تحليل البرنامج⁹.
3. عملية مقلة العين كاملة للأحماض النووية واستخراج البروتين، متبوعاً بطرق PCR أو إيمونوبلوتينج، لإجراء التحليل الجزيئي لعيون ثقب.
   ملاحظة: أفضل يتم إجراء التحليل الجزيئي للأنسجة مع أنسجة غير ثابت، ولكن تشريح آيريس غير ثابت صعبة للغاية، واستخدام العين كله أصدرت نتائج يعتد بها إحصائيا في الدراسات السابقة⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ألبينو بالب/ج الماوس الجراء في P12.5 تعرضوا لثقوب uveal، يتكرر كل يوم الرابع (تجريبي اليوم 0، 4، 8، 12)، حتى P24.5. في P27.5، كانت euthanized الفئران وقزحيات بعناية تشريح (15 يوم تجريبي). تم التقاط الصور لعيون الماوس مع كاميرا تعلق على ستيريوسكوبي جراحية قبل كل سلسلة الثقب في كل يوم تجريبية لت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويرد في هذا البروتوكول، طريقة جديدة لتحريض آيريس استجابة الأوعية الدموية بثقب uveal. يقوم بتشغيل آليات شفاء الجرح الثقب ويعزز استجابات الأوعية الدموية في^10،آيريس¹¹. وهذا ما يتفق مع أمراض العين، مثل الديمقراطية الشعبية ونفج، حيث تتوج استجابات الأوعية تفاقم من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn eye scissors	Bausch & Lomb	23060
Clayman-Vannas curved scissors	Bausch & Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas straight scissors	Bausch & Lomb	E3383 S
Objective adapter for camera	Handcrafted	N/A	Or any system that allows adapting a camera to the microscope
Heating Pad 100-110 watts	Non Applicable	N/A	Available in pet/veterinarian stores
Hypodermic 30g beveled needle	KDM GmBH germany	911914
Iphone 4S	Apple	Non Applicable	Or other high resolution image acquistion device
Isoflurane	Baxter	KDG 9623
McPherson tying forceps	Bausch & Lomb	E1815 S
Micro tying forceps	Bausch & Lomb	63140
Minims tetracaine hydrochloride	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) Eye Drops
Neutral-buffered formalin	Bioreagens	0018-40
Normal saline solution	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl in injectable water
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010023	Balanced and buffered PBS pH 7.4
Petri dish 10 cm	Starstedt	83.3902
Petri dish 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal Tube 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	Or any eppendorf style tubes
TC plate 96-well	Starstedt	83.3924
Transfer pipette 3.5 mL	Starstedt	86.1171	Or any other Pasteur pipette style
Univentor 400 anesthesia unit	Univentor Limited	N/A	Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia
Wild M650 surgical microscope	Wild Heerbrugg	N/A	Or other surgical or magnifying stereoscope