마우스 모델 Rubeosis Iridis의 아이리스 Neovascularization 펑크 유발

요약

아이리스 neovascularization, 허 혈 성 망막 질환의 일반적인 합병증은 신생 녹 내장 시력을 위협 하 될 수 있습니다. 여기, 우리는 신생 변조 물질의 비 침범 성 평가 위해 사용할 수 있는 실험 아이리스 neovascularization를 유도 하는 murine 프로토콜을 설명 합니다.

초록

우리 신생의 비 침범 성 평가 위한 일반적인 모델으로 찔린 유도 아이리스 neovascularization의 모델을 설명합니다. 이 모델은 또한 신생 녹 내장, 당뇨병 성 망막 증의 시력을 위협 하는 합병증을 타겟팅에 대 한 관련. 이 메서드와 BALB/c 마우스에 자체 봉인 포도 구멍의 시리즈에 의해 아이리스 혈관 반응의 유도에 따라 마우스 눈 맥 관 구조의 산 후 성숙의 활용. 마우스 강아지 포도 자국에서 출생 후 하루 12.5, 새끼 자연스럽 게 열 때 그들의 눈, 산 후 날 24.5까지 받을. 때문에 각 막의 투명도, 아이리스 맥 관 구조 분석할 수 있습니다 쉽게 시간을 통해 비 침 투 적인 비보에 방법으로. 또한, BALB/c 마우스의 반투명 아이리스 최소한의 일반적인 배경 얼룩과 자세한 immunohistologic 분석에 대 한 flatmounted 수 있습니다. 이 모델에서 신생 주로 염증에 의해 구동 됩니다 하 고 플라스 미노 겐 활성화 시스템. 펑크 유발 모델 작은 설치류에 아이리스 neovascularization를 유도 하기 위해 처음 이며 직접 비 침범 성 비보에 신생 과정의 분석을 허용의 이점이 있다. 또한, 모델 신생 vivo에서 관점의 연구의 가능성을 강조는 신생 변조 물질과 결합할 수 있습니다.

서문

홍 채, 모양 체 및 맥락 막, 눈의 가장 vascularized 조직 uvea 구성 되어 있습니다. 홍 채 맥 관 구조는 눈의 앞쪽 챔버에 항상성 유지에 필수적 이다. 동맥과 정 맥 사이의 풍부한 anastomotic 연결, 결과로 아이리스 혈관 영양소 뿐만 아니라 자체, 아이리스 하지만¹눈 앞쪽 전체 세그먼트에 산소의 공급을 제공합니다.

새로운 혈관, 또는 기존의 것 들에서 신생 혈관의 형성은 개발 및 상처 치유²등 생리 적 과정에 기본적 이다. 신생은 가늘게 정식 요인, 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 (파이), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 등 여러 염증 성 요인의 군중에 의해 통제 되 고 이러한 요소의 불균형에 pathologic 이어질 수 있습니다. 신생³.

눈, neovascularization 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR) 등 신생 녹 내장 (NVG) 시력을 위협 하는 질병의 원인입니다. 이러한 눈 질환에 초점 neovascularization는 일반적으로 망막 조직에 염증 성 불균형에 있으며 모두 후부와 앞쪽 눈 실에서 눈의 신생 요인 rubeosis iridis와 연결 되어 있는 홍 채 병 적인 neoangiogenesis⁴임상 용어. 이러한 병 리 신생을 성인 아이리스의 기능을 나타냅니다. 마우스에서 눈 맥 관 구조 성숙 출생 후 이며 성숙 산 후 계속. 개발의이 특성은 산소에 유도 된 망막, 밀접 하 게 조산⁵의 망막 질환의 임상 상태를 모방 하는 모델의 마우스 모델에 악용 됩니다. 또한, 신생 염증과 재생 메커니즘⁶, 치유 하는 상처에 중추적인 역할 그리고 상처 자체 치유 신생 모델⁷과 연결 되었습니다.

이 연구에서 우리는 펑크 유발 아이리스 neovascularization의 모델을 설명합니다. 포도 자국 limbus의 외부 한계 근처는 상처 치유 시스템을 실행 하 여 홍 채 neovascularization를 유도 수행 됩니다. 때문에 각 막의 투명도, 아이리스 맥 관 구조 될 수 있습니다 쉽게 비보 비 침 투 적인 방법으로 분석. 구멍이 눈 플라스 미노 겐 활성화 및 염증 성 마커⁸의 증가와 관련 있다 홍 채, 혈관 침대의 증가 제시. 제시 모델 신생 신생 화합물, 상영을 공부 하 고 새로운 도구로 큰 잠재력을가지고 고 직접 vivo에서 신생 프로세스의 시각화를 있습니다.

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프로토콜

BALB/c 마우스 새끼 어느 섹스의 Ophthalmologic 및 비전 연구, 동물의 사용에 대 한 진술에 따라 사용 되었다 그리고 프로토콜 윤리적인 동물 연구에 대 한 스톡홀름의 위원회에 의해 승인 했다. 쥐 새끼, 12 h 주/야 주기, 음식 및 물, 간호 어머니 함께 되었고 매일 모니터링.

참고: 수술 절차에 대 한 마우스와 휘발성 isoflurane 마 취 유지 했다. 눈 연 고는 치료와 사용 되는 물질을 방해할 수도 눈 절차 동안 낙 심. 필요한 경우, 드라이 눈을 방지 하기 위해 살 균 정상적인 염 분 솔루션의 드롭 적용할 수 있습니다. 포도 구멍은 자가 치유, 치료 수술 도구와 무 균을 보장 하기 위해 포도 구멍 동안 찍은. 수술 후 치료는 피하, 정상적인 염 분 솔루션 수 분을 포함 그리고 tetracaine 염 산 염의 눈 국 소 관리와 진통. 새끼는 생리대에 sternal recumbency 간호 어머니의 깨끗 한 감 금 소에 게 반환 하기 전에 복구 허용 되었다. 새끼는 스트레스를 피하기 위해 같은 간호 어머니와 함께 유지 했다.

1입니다. 마 취

1. 마 취 유도 챔버 하 isoflurane 마 취 관리도 결합 하는 작은 마우스 마스크를 준비 합니다.
   참고: 모든 적용 가능한 윤리 허가와 모든 동물 실험을 수행 합니다.
2. 대기 공기에 3-4% 휘발성 isoflurane와 유도 챔버를 프리 필.
   참고: 다른 마 취 물질 isoflurane 보다 다른 사용할 수 있습니다, 윤리 허가 따라. 휘발성 마 취 절차 통풍이 벤치 또는 연기 후드에서 수행 되어야 합니다.
3. 산 후 (P) 12.5-하루-옛 BALB/c 마우스 강아지 유도 챔버에 배치 합니다. 마 취 장치 isoflurane 유도 약 실에 제공할 준비가 되는지 확인 합니다.
   참고: 마우스 강아지는 허약 하 고 최고의 아저씨에 의해 처리. 담가 또는 스트레스를 피하기 위해 간호 어머니와 새끼를 함께 유지.
4. 완벽 하 게 취 수를 강아지를 수 있습니다.
5. 부드럽게, 아저씨에 의해 마우스 강아지를 선택 합니다.
   참고: 계속 유도 약 실 폐쇄에 항상 안전 하 고 안정적인 유도.
6. 설치류 마스크를 마우스를 전송 합니다. 마우스를 이동할 때 마스크 유도 실에서 마 취 흐름 전환 되었는지 확인 합니다.
7. 마 취를 확인 하는 발가락 핀치를 수행 합니다.

2. 펑크 외과 Stereoscope 아래 절차

1. 측면 recumbency 위치에 마우스를 놓습니다. 마스크는 물론 마우스 눈은는 stereoscope의 보기의 필드에 위치를 확인 합니다.
2. 그래서 눈은 stereoscope 쪽으로 향하도록 부드럽게 마우스 머리를 회전 합니다.
   참고: 눈의 명확한 포커스는 stereoscope 아래 달성 되어야. 포지셔닝에 대 한 16 X의 확대는 권장, 40 X 수술 절차를 수행 하려면 사용 해야 합니다. 윤리적 허가 허용, 수염의 끝을 트리밍 눈의 시각화 용이 하 게 수 있습니다.
3. 등 쪽과 복 부 눈에 눈 꺼 풀에 하향 압력을 적용 하 여 강아지의 눈을 내 다 신중 하 게 작은 연결 집게를 사용 하 여.
4. 작은 집게로 강아지의 눈 뚜껑의 부드러운 하지만 회사 보류를 유지.
   참고:이 좋습니다 눈 돌출을 수행 하 여 비 지배적인 손을 가진 잡고 뚜껑으로 지배적인 손에 빵 꾸 절차를 수행 해야 합니다.
5. stereoscope를 사용 하 여 각 막 limbus를 찾습니다. 흰둥이 BALB/c limbus 원형 혈관 총 각 막에 후부에 의해 쉽게 식별할 수 있습니다.
6. 0.25 m m 직경 (30 G) 경사진된 바늘으로는 uvea의 후부 limbal 제한 근처 작은 포도 펑크를 수행 합니다. 만, 바늘의 팁을 사용 하 고 더 이상 절반 경사 (0.5 m m에 해당), 펑크는 uvea. 제대로 실행 하는 경우 포도 구멍 자체 씰링, 아직 연구 물질의 안 구내 주사 같은 찔린 상처를 통해 관리 될 수 있습니다.
   참고: 마우스 안구 해부학과 경험, 포도 빵 꾸 ciliary 바디와 ora 참나무 사이의 실행 됩니다. 해야 합니다 주의 포도 빵 꾸를 수행 하는 동안 렌즈 파열을 피하기 위해.
7. 첫 번째 펑크 사이트에서 눈의 반대 사이트에 두 번째 포도 빵 꾸를 수행 합니다. 거리와 자국;의 위치를 최적화 가능한 지 되 고 12 시와 6 시 자국, 12 고려 합니다.
8. 포도 빵 꾸 절차 P24.5까지 4 일 마다 반복 합니다. 모든 연속 포도 펑크 전에 포도 빵 꾸, 또는 명백한 저하 눈 압력 동안 렌즈의 손상으로 인해 외상 성 백 내장의 존재에 특히 주의 지불 하는 동물 상태를 모니터링 합니다. 최적의 효과 대 한 이전 구멍으로 동일한 위치에서 반복 구멍을 실행에 대 한 목표.

3. 비 침 투 적인 Vivo에서 모니터링

1. 펑크 또는 각 실험 날 주사 전에 위에서 수행 마우스를 anesthetize.
2. 측면 recumbency 위치에 마우스와 함께 부드럽게 눈을 내 다.
3. 수술 stereoscope 아이리스 맥 관 구조에 초점.
4. 수술 stereoscope 장착 카메라와 함께 아이리스 맥 관 구조의 사진을 찍을.
   참고: 필요 하지 않은 감수 분열을 유도 수 있지만 동물 당 홍 채 영역을 정상화 하는 데 도움이. 감수 분열 유도 에이전트를 선택할 때 윤리적인 허가 고려 하십시오. 아이리스 맥 관 구조의 주의 집중은 더 정량 분석을 촉진 한다. 40 X의 것이 좋습니다.

4. 수술 치료

1. 설치류 마스크에서 BALB/c 강아지를 제거 하 고 부드럽게 외과 매트와 겹쳐 난방 패드에 전송.
2. 구멍이 눈에 1 %tetracaine 솔루션의 한 방울을 적용 합니다.
   참고: 다른 진통 솔루션 사용할 수 있습니다, 윤리 허가 따라.
3. 메 마른 정상적인 염 분 해결책의 200 µ L의 피하 주입으로 동물을 하이드 레이트.
4. 깨끗 한 마우스에 간호 어머니에 게 강아지를 반환 합니다.
5. 복구 프로세스를 모니터링 합니다. 강아지를 deambulate 담가 하 수 있어야 합니다.

5. 눈 Enucleation

1. 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사. 절차의 더 나은 시각화를 위한 enucleation 및 해 부 한 stereoscope 아래를 수행 합니다.
   참고: 다른 안락사 절차는 사용할 수 있습니다. 윤리적 허가 엄격 하 게 준수 하는 것이 좋습니다.
2. 당겨 떨어져 눈에 노출을 개선 하기 위해 눈 꺼 풀.
3. 곡선 본 눈이 위 눈 뚜껑의 법 근처 작은 컷 (약 0.5 c m)를 확인 합니다.
4. 노출된 periocular 공간을 사용 하 여 궤도에서 (아래) 세계 뒤에 마이크로 연결 집게를 삽입.
5. 조직을 둘러싼 눈을 살짝 위로 당겨. 주변 조직 가까이 눈 소켓을 사용 하 여, 안구에 보관 하지 마십시오.
6. 궤도 있는 곡선된 본 눈이 위 눈 지구에 뒤에 삽입 합니다.
7. 잘라 주위 조직을 통해 눈 소켓에서 뺍니다.
   참고:이 해 부 기술은 눈 해부학을 유지 하 고 후속 분석을 혜택.
8. 눈에서 외부 조직의 제거를 진행 합니다. 선호 하는 경우, 수정 후 외부 조직의 제거를 수행할 수 있습니다.
   참고: BALB/c 마우스는 멜 라 닌 결핍, 따라서 증가 대비, 어두운 배경에 권장 해 부 절차를 촉진 하기 위하여.
9. 짧게 페 트리 접시에 전체 눈 씻어 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)으로 가득합니다.
10. 2 mL 튜브 4% 버퍼링 말린 솔루션의 1.5 mL를 포함 하는 눈을 전송 합니다.
11. 실 온에서 6 h에 대 한 눈을 수정.
    참고: 조직의 강성 수 여 하 고 홍 채의 절 개를 용이 하 게 해결. 시간을 수정 해야 테스트 되며 다른 응용 프로그램에 대 한 조정.

6. 아이리스 Stereoscope 아래 해 부 절차

1. 1.5 mL 플라스틱 파스퇴르 피 펫 (또는 유사한), 튜브에서 통 솔루션을 제거 하 고 세 번 신선한 PBS로 눈을 씻어.
2. 위쪽으로 향하게 하는 앞쪽 챔버와 고정된 눈 부드러운 마른 표면 (해 부 대)에 배치 합니다.
3. 경사진 30g 바늘 후부는 limbus 진입점을 수행 합니다.
4. 작은 연결 집게와 이전 세그먼트를 잡고, 이전에 만든 오프닝으로 Clayman 욕실이 직선 위의 한 끝을 삽입 합니다.
   참고: 그것은 비 지배적인 손 가진 집게와 지배적인 시저를 제어 하 고 좋습니다.
5. 회전 하는 동안 연결 집게와 눈 주위에 눈의 뒤 세그먼트를 제거 하려면 limbus 잘라.
   참고: 조직에 크게 계속가 위 내 면 끝 과정을 용이 하 게 허용할 것 이다 부분 컷을 수행.
6. 아래쪽으로 직면 하 고, 노출은 렌즈 앞쪽 세그먼트를 놓습니다.
7. 신중 하 게 작은 집게로 잡아와 위쪽으로 당기는 렌즈를 제거 합니다.
   참고: beveled 바늘 찔린 고 렌즈를 사용할 수 있습니다.
8. 각 막 면이 아래로와 보기의 필드에 수직인 컷 앞쪽 세그먼트를 놓습니다.
9. 부드럽게 작은 연결 집게와 조직 ciliary 시체에 후부를 잡아.
10. Clayman 욕실이 바로 위, 배수 채널을 제거 하 여 홍 채 격리 모양 몸 앞쪽 단지 트림을 진행 합니다. 확인 하는 배수 채널 제거 됩니다; 홍 채는 각 막 내에서 이동 해야 합니다.
11. 신중 하 게 각 막, PBS의 200 µ L을 포함 하는 96 잘 접시를 들고 작은 연결 집게와 앞쪽 아이피를 전송 합니다.
12. 각 막에 잘 들고 계속 하 고 홍 채는 피 펫으로 PBS를 가진 홍 조에 의해 해 부.
    참고: 현재, 그리고 30 G 바늘의 경사 각 막, 일부 배수 채널에 아이리스 남아 점착 있을 경우 전치 홍 채 도움을 사용할 수 있습니다.
13. 작은 연결 집게와 96-우물에서 각 막 제거 하 고 추가 분석에 대 한 잘 격리 된 아이리스를 유지.
14. 4 ° c.에 부동성 아이리스 샘플 저장
    참고: 고정 되 고에 불구 하 고 아이리스 부동성 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.

7. 가능한 실험적인 지요

1. 해 부의 홍 채에 혈관을 시각화 하려면 부동성 전체 마운트 immunohistochemistry 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM)-1 등 표식 방법 얼룩 또는 isolectin B4. 또는, 높은 분자량 형광 표시 된 dextrans 같은 혈관 얼룩과 전신 관류를 사용 합니다.
2. 비보에 비 침 투 적인 이미지를 사용 하 여 실리콘에 플랫-마운트를 수행 하 고 전체 아이리스 맥 관 구조 적절 한 이미징 소프트웨어 계량.
   참고: 맥 관 구조를 측정할 수 있습니다, vivo에서 그리고 생체 외에서densitometry를 사용 하 여 또는 맥 관 구조 분석 소프트웨어⁹.
3. 핵 산 및 단백질 추출, PCR 또는 immunoblotting 방법, 구멍이 눈의 분자 분석을 수행 하 여 다음에 대 한 전체 안구를 처리 합니다.
   참고: 조직의 분자 분석은 최고의 고정 되지 않은 조직으로 수행 하지만 고정 되지 않은 홍 채의 절 개는 매우 도전, 그리고 전체 눈의 사용 이전의 연구⁸에서 통계적으로 유의 한 결과 렌더링은.

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결과

P12.5에서 흰둥이 BALB/c 마우스 새끼 4 매일 반복 하는 포도 자국을 복종 되었다 (실험적인 하루 0, 4, 8, 12), P24.5까지. P27.5, 마우스 했다 안락사 고 홍 신중 하 게 해 부 (실험 하루 15). 사진 마우스 눈의 홍 채 혈관 반응의 비 침범 성 평가 평가 모든 펑크 시리즈 각 실험 하루에서 전에 수술 stereoscope에 연결 된 카메라와 함께 촬영 했다. 포도 자국 상처 치유 시스템 (

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토론

현재 프로토콜에서 포도 펑크에 의해 아이리스 혈관 반응의 유도 대 한 새로운 방법을 제공 됩니다. 찔린 상처 치유 메커니즘을 트리거합니다 하 고 아이리스^10,11혈관 응답을 촉진 합니다. 이것은 PDR, NVG, 눈의 뒤 세그먼트에서 망막에서 악화 신생 응답 rubeosis iridis, 홍 채^{12의 증가 vascularization의 임상 상태에서 완결 등 눈 병 리와 ,<...}

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn eye scissors	Bausch & Lomb	23060
Clayman-Vannas curved scissors	Bausch & Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas straight scissors	Bausch & Lomb	E3383 S
Objective adapter for camera	Handcrafted	N/A	Or any system that allows adapting a camera to the microscope
Heating Pad 100-110 watts	Non Applicable	N/A	Available in pet/veterinarian stores
Hypodermic 30g beveled needle	KDM GmBH germany	911914
Iphone 4S	Apple	Non Applicable	Or other high resolution image acquistion device
Isoflurane	Baxter	KDG 9623
McPherson tying forceps	Bausch & Lomb	E1815 S
Micro tying forceps	Bausch & Lomb	63140
Minims tetracaine hydrochloride	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) Eye Drops
Neutral-buffered formalin	Bioreagens	0018-40
Normal saline solution	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl in injectable water
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010023	Balanced and buffered PBS pH 7.4
Petri dish 10 cm	Starstedt	83.3902
Petri dish 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal Tube 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	Or any eppendorf style tubes
TC plate 96-well	Starstedt	83.3924
Transfer pipette 3.5 mL	Starstedt	86.1171	Or any other Pasteur pipette style
Univentor 400 anesthesia unit	Univentor Limited	N/A	Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia
Wild M650 surgical microscope	Wild Heerbrugg	N/A	Or other surgical or magnifying stereoscope