Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

Resumen

Neovascularization del diafragma, una complicación común de la enfermedad de retina isquémica, puede llevar a glaucoma neovascular avistar-que amenaza. Aquí, describimos un protocolo murino para inducir neovascularización de iris experimental que puede utilizarse para la evaluación no invasiva de las sustancias de modulación de angiogénesis.

Resumen

Describimos un modelo del neovascularization del diafragma inducida por la punción como un modelo general para la evaluación no invasiva de la angiogénesis. El modelo también es relevante para dirigidos a glaucoma neovascular, una complicación peligrosa para la vista de la retinopatía diabética. Este método se basa en la inducción de la respuesta vascular del iris por una serie de pinchazos uveales autoadhesivos en ratones BALB/c y se aprovecha de la maduración postparto de vasculatura ocular de ratón. Crías de ratón son sometidos a pinchazos uveales de día postnatal 12.5, cuando los cachorros abran los ojos, naturalmente hasta día postnatal 24.5. Debido a la transparencia de la córnea, vasculatura iris puede analizarse fácilmente a través del tiempo por métodos no invasivos en vivo . Además, el diafragma semitransparente de ratones BALB/c puede ser flatmounted para el análisis detallado immunohistologic con tinción de fondo inespecífica mínimo. En este modelo, la angiogénesis es impulsada principalmente por las inflamatorias y sistemas de activación del plasminógeno. El modelo inducida por punción es el primero en inducir neovascularización de iris en pequeños roedores y tiene la ventaja de permitir la directa no invasiva en vivo análisis del proceso angiogénico. Por otra parte, el modelo puede combinarse con sustancias modulación angiogenic, que destaca su potencial en el estudio de la angiogénesis con perspectiva en vivo .

Introducción

El iris, junto con el cuerpo ciliar y la coroides, compone de la úvea, que es el tejido más vascularizado del ojo. Vasculatura del diafragma es esencial para mantener la homeostasis en la cámara anterior del ojo. Como resultado de abundantes conexiones anastomóticas entre arterias y venas, los vasos sanguíneos de iris proporcionan nutrientes y suministro de oxígeno no sólo el diafragma sí mismo, sino a todo segmento anterior del ojo¹.

La formación de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis de las ya existentes, es fundamental en los procesos fisiológicos, tales como desarrollo y²de cicatrización. Angiogénesis está finamente reglamentada por multitud de factores canónicos, como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI), así como múltiples factores inflamatorios, y un desequilibrio de estos factores puede llevar a patológica ³de la angiogénesis.

En el ojo, la neovascularización es la causa de enfermedades peligrosas para la vista, como la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y el glaucoma neovascular (GNV). En estas enfermedades oculares, la neovascularización focal se encuentra comúnmente en los tejidos de la retinales, sin embargo, el desequilibrio en inflamatorias y factores angiogénicos en ambas las posteriores y anteriores oculares cámaras del ojo se ha asociado con rubeosis iridiana, la término clínico para iris neoangiogenesis patológica⁴. Estas patologías indican la capacidad del diafragma adulto a angiogénesis. En ratones, vasculatura ocular es inmaduro después del nacimiento y maduración postparto. Esta peculiaridad del desarrollo se explota en el modelo de ratón de la retinopatía inducida por el oxígeno, un modelo que imita muy de cerca la condición clínica de retinopatía de la prematuridad⁵. Además, Angiogénesis e inflamación juegan un papel fundamental en los mecanismos⁶de heridas y cicatrización se ha asociado con angiogénesis modelos⁷.

En este estudio, describimos un modelo del neovascularization del diafragma inducida por la punción. Uveales punciones se realizan cerca del límite exterior del limbus, que inducen neovascularización del iris mediante la activación del sistema de cicatrización. Debido a la transparencia de la córnea, vasculatura del iris puede ser analizado fácilmente en vivo por métodos no invasivos. Pinchado los ojos presentan un aumento del lecho vascular en el iris, que se ha asociado con un aumento de la activación de plasminógeno y marcadores inflamatorios⁸. El modelo presentado tiene un gran potencial como una nueva herramienta para estudiar la angiogenesis y angiogénicos compuestos de detección y permite la visualización directa en vivo de los procesos angiogénicos.

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Protocolo

Crías de ratón BALB/c de ambos sexos fueron utilizados con arreglo a la declaración para el uso de animales en oftalmológica y la investigación de visión, y los protocolos fueron aprobados por la Comisión de Estocolmo para la investigación Animal ético. Ratones fueron alojados en literas, junto con la madre de la enfermería, con un ciclo de día/noche 12 h, libre acceso al alimento y agua y supervisados diariamente.

Nota: Para el procedimiento quirúrgico, los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano volátil. Ungüentos oculares son recomendables durante los procedimientos oculares, ya que podrían interferir con los tratamientos y sustancias utilizadas. Si es necesario, para evitar el ojo seco, una gota de solución salina normal estéril puede ser aplicada. Aunque los pinchazos uveales son auto-sanación, fue procurar durante punciones uveales esterilidad con instrumentos quirúrgicos. Tratamiento post quirúrgico incluye la hidratación con solución salina normal por vía subcutánea y analgesia con la administración ocular tópica de clorhidrato de tetracaína. Los cachorros se les permitiera recuperar a recumbency esternal en un cojín de calefacción antes de ser devuelto a la madre de la enfermería, en una jaula limpia. Camadas se mantuvieron con la misma madre de la enfermería para evitar el estrés.

1. anestesia

1. Preparar la cámara de inducción de anestesia, para administrar anestésico isoflurano y garantizar que también se acopla una máscara de ratón pequeño.
   Nota: Realizar experimentos de todo animales de acuerdo con todos los permisos éticos aplicables.
2. Rellenar previamente la cámara de inducción con 3-4% de isoflurano volátiles en aire atmosférico.
   Nota: Diferentes sustancias anestésicas que isoflurano pueden utilizarse, según permisos de éticas. Procedimientos anestésicos volátiles deben llevarse en una campana ventilada de banco o humo.
3. Lugar un postnatal (P) 12.5 días de edad BALB/c ratón cachorro en la cámara de inducción. Confirmar que el aparato de anestesia está listo para entregar isoflurano a la cámara de inducción.
   Nota: Crías de ratón son frágiles y mejor manejada por el pescuezo. Mantener los cachorros juntos como una basura o con la madre para evitar el estrés.
4. Deje que el cachorro ser completamente anestesiada.
5. Suavemente, levante el cachorro de ratón por el pescuezo.
   Nota: Mantenga la cámara de inducción, cerrada en todo momento para la inducción segura y estable.
6. Transferir el ratón a la máscara de roedor. Asegúrese de cambiar el flujo anestésico de la cámara de inducción a la máscara al mover el ratón.
7. Realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar la anestesia.

2. Perfore el procedimiento bajo estereoscopio quirúrgica

1. Coloque el ratón en la posición lateral recumbency. Confirmar que la máscara está bien posicionada por lo que es el ojo de ratón en el campo de visión del estereoscopio.
2. Suavemente gire la cabeza del ratón por lo que el ojo es hacia arriba hacia el estereoscopio.
   Nota: Enfoque claro del ojo debe lograrse bajo el estereoscopio. Para la colocación, se recomienda un aumento de 16 X, mientras que 40 X debe ser utilizado para realizar el procedimiento quirúrgico. Si lo permiten permisos éticos, recorte la punta de los bigotes puede facilitar la visualización del ojo.
3. Cuidadosamente usando pinzas atar pequeñas, sobresalen ojo del cachorro aplicando presión hacia abajo a los párpados dorsales y ventrales al ojo.
4. Mantenga una mano suave pero firme de párpado del cachorro, con pinzas pequeñas.
   Nota: Se recomienda para realizar la protrusión ocular y tapa sujetando con la mano no dominante, como la mano dominante debe realizar el procedimiento de punción.
5. Usa el Estereoscopio para situar el limbo corneal. Limbo de albinos BALB/c puede identificarse fácilmente por el plexo vascular circular posterior a la córnea.
6. Con una aguja biselada de 0.25 mm diámetro (30 G), realizar una pequeña punción uveal, cerca del límite limbal posterior de la uvea. Utilice sólo la punta de la aguja, y no más de la mitad del bisel (equivalente a 0.5 mm), perfore la úvea. Si se ejecuta correctamente, las punciones uveales son autosellantes, pero la inyección intraocular de sustancias de estudio puede ser administrada a través de la misma herida de punción.
   Nota: Si experimenta con anatomía ocular de ratón, la puntura uveal se ejecuta entre el cuerpo ciliar y la ora serrata. Debe tener cuidado al realizar la punción uveal para evitar la ruptura de la lente.
7. Realizar la segunda punción uveal en el sitio opuesto del ojo desde el primer sitio de la punción. Optimizar la distancia y la posición de las perforaciones; considerar 12 y 6:00 pinchazos, con 12:00 siendo como dorsal como sea posible.
8. Repita el procedimiento de úvea pinchazos cada cuatro días hasta P24.5. Antes de cada punción uveal sucesiva, monitorear estado animal prestando especial atención a la presencia de catarata traumática debido a daño de la lente durante la punción uveal, o evidente presión ocular disminuida. Objetivo para la realización de punciones repetidas en la misma posición como punciones anteriores para efectos óptimos.

3. no invasiva in Vivo monitoreo

1. Antes de la punción o inyecciones cada día experimental, anestesiar el ratón como se realizó anteriormente.
2. Con el ratón en la posición lateral recumbency, sobresalen suavemente el ojo.
3. Centrarse en la vasculatura del iris con el estereoscopio quirúrgico.
4. Tomar una foto de la vascularización del iris con una cámara para el estereoscopio quirúrgico.
   Nota: Aunque no es necesario, inductora de la meiosis puede ser útil para normalizar la zona de iris por animal. Considerar éticos permisos al seleccionar a un agente de inducción de la meiosis. Atención cuidadosa de la vascularización del iris más facilitará análisis cuantitativo. Se recomienda una magnitud de 40 X.

4. postoperatorio cuidado

1. Quitar la cría de ratones BALB/c de la máscara de roedor y suavemente la transferencia a una almohadilla de calefacción con una estera quirúrgica.
2. Aplicar una gota de solución de tetracaína 1% en ojos pinchados.
   Nota: Otras soluciones analgésicas pueden utilizarse, según permisos de éticas.
3. Hidratar el animal con una inyección subcutánea de 200 μL de solución salina normal estéril.
4. Regresar el cachorro a la madre en una jaula del ratón limpio.
5. Supervisar el proceso de recuperación. El cachorro debe poder deambulate y volver a la camada.

5. ojo enucleación

1. Eutanasia a los animales por dislocación cervical. Realizar enucleación y disección bajo un estereoscopio para mejor visualización del procedimiento.
   Nota: Pueden utilizar procedimientos diferentes de la eutanasia. Se recomienda apegarse estrictamente a la ética permite.
2. Separe los párpados para mejorar la exposición a la vista.
3. Hacer una pequeña incisión (aproximadamente 0,5 cm) cerca del canto de las tapas del ojo con curva tijeras de ojo de Bonn.
4. Utilizar el espacio expuesto periocular para insertar micro pinzas ATA detrás (bajo) el globo en la órbita.
5. Agarra el tejido que rodea el ojo y tire suavemente hacia arriba. Evitar la explotación en el globo ocular, utilizar más los tejidos circundantes a la cuenca del ojo.
6. Inserte las tijeras de ojo Bonn curva detrás del globo ocular en la órbita.
7. Corte a través de los tejidos circundantes hasta que el ojo se libera de la toma.
   Nota: Esta técnica de disección mantiene la anatomía del ojo y beneficia el análisis subsecuente.
8. Proceder a la remoción de tejido extraño del ojo. La eliminación de tejido extraño puede realizarse después de la fijación, si se prefiere.
   Nota: Ratones BALB/c son melanina deficiente, por lo tanto, para aumentar el contraste, un fondo oscuro se recomienda para facilitar el procedimiento de disección.
9. Brevemente enjuague el ojo todo en una placa Petri se llena con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
10. Transferir el ojo a un tubo de 2 mL que contiene 1,5 mL de solución tamponada de formalina al 4%.
11. Fijar los ojos durante 6 h a temperatura ambiente.
    Nota: La fijación confiere la rigidez de los tejidos y facilita la disección del iris. Tiempo de fijación debe ser probada y ajustada para diferentes aplicaciones.

6. Iris procedimiento de disección bajo estereoscopio

1. Retire la solución de fijación del tubo con una pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (o similar) y enjuague el ojo tres veces con PBS fresco.
2. Coloque el ojo fijo en una superficie lisa (soporte de disección) con la cámara anterior hacia arriba.
3. Con una aguja de 30 G biselado, realizar un punto de entrada posterior al limbus.
4. Sostiene el segmento anterior con pequeñas pinzas para atar, inserte una punta de tijeras rectas Clayman Vannas la apertura previamente creada.
   Nota: Se recomienda controlar el fórceps con la mano no dominante y la tijera con el dominante.
5. Mientras gira el ojo con las pinzas para atar, cortar alrededor del limbus para quitar el segmento posterior del ojo.
   Nota: Realizar cortes parciales permitirá el interior punta de las tijeras para seguir en el tejido y en gran manera facilita el proceso.
6. La posición del segmento anterior hacia abajo, exponiendo la lente.
7. Retire con cuidado el lente agarrando con pinzas pequeñas y tirando hacia arriba.
   Nota: Puede utilizarse una aguja biselada para pinchar y tire de la lente.
8. Posición del segmento anterior con la córnea hacia abajo y el corte perpendicular al campo de visión.
9. Agarra suavemente el tejido posterior al cuerpo ciliar con las pinzas pequeñas de atar.
10. Con unas tijeras rectas Clayman Gill-Vannas, proceder a recortar justo anterior del cuerpo ciliar para quitar la malla trabecular y aislar el iris. Confirmar que se ha quitado la malla trabecular; el diafragma debe moverse dentro de la córnea.
11. Transferir cuidadosamente el ocular anterior con las pinzas pequeñas de atar, sosteniendo la córnea a una placa de 96 pocillos que contienen 200 μL de PBS.
12. Continúe sosteniendo la córnea en el pozo y diseccionar el iris mediante lavado con PBS con una pipeta.
    Nota: Si el iris sigue siendo adherente a la córnea, algunas red trabecular puede ser presente y el bisel de una aguja de 30 G se puede utilizar para ayudar a desplazar el diafragma.
13. Saque la córnea 96-bien con las pinzas pequeñas de atar y mantener el iris aislado en el pozo para su posterior análisis.
14. Conservar muestras de diafragma flotante a 4 ° C.
    Nota: A pesar de ser fijos, no se recomienda almacenamiento a largo plazo de las muestras de diafragma flotante.

7. posibles lecturas experimentales

1. Para visualizar los vasos sanguíneos en el iris disecadas, utilizar immunohistochemistry de montaje conjunto flotante coloración métodos para marcadores como molécula de adhesión de células endoteliales plaquetas (PECAM) -1 o proteína B4. Como alternativa, utilizar perfusión de cuerpo entero con manchas vasculares, tales como dextranos marcados con fluorescente de alto peso molecular.
2. Utilizar en vivo imágenes no invasivas para realizar en silico plana-montaje y cuantificar vasculatura iris completo con software de imagen apropiado.
   Nota: Puede cuantificarse vasculatura, tanto en vivo como en vitro, utilizando densitometría o con vasculatura análisis software⁹.
3. Proceso del globo ocular entero para ácidos nucleicos y extracción de proteínas, seguida por métodos de PCR o inmunotransferencia, para llevar a cabo el análisis molecular de los ojos pinchados.
   Nota: El análisis Molecular de los tejidos se realiza mejor con el tejido no fijado, pero disección de iris no fijos es extremadamente difícil, y el uso del ojo entero ha rendido resultados estadísticamente significativos en anteriores estudios⁸.

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Resultados

Crías de ratón BALB/c de Albino en P12.5 fueron sometidos a pinchazos uveales, repetidos cada cuarto día (día experimental 0, 4, 8, 12), hasta P24.5. En P27.5, ratones fueron sacrificados e iris cuidadosamente disecado (experimental día 15). Fotos de ojos de ratón fueron tomadas con una cámara adherida a un estereoscopio quirúrgico antes de cada serie de punción cada día experimental para evaluar la evaluación no invasiva de la respuesta vascular del iris. Uveales pinchazos ind...

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Discusión

En el presente Protocolo, se presenta un método novedoso para la inducción de la respuesta vascular del iris por punción uveal. La punción desencadena mecanismos curativos de la herida y promueve las respuestas vasculares en el iris^10,11. Esto está de acuerdo con las patologías oculares, como el PDR y NVG, donde culminan angiogénicos exacerbado las respuestas de la retina en el segmento posterior del ojo en la condición clínica de rubeosis iridiana, una ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn eye scissors	Bausch & Lomb	23060
Clayman-Vannas curved scissors	Bausch & Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas straight scissors	Bausch & Lomb	E3383 S
Objective adapter for camera	Handcrafted	N/A	Or any system that allows adapting a camera to the microscope
Heating Pad 100-110 watts	Non Applicable	N/A	Available in pet/veterinarian stores
Hypodermic 30g beveled needle	KDM GmBH germany	911914
Iphone 4S	Apple	Non Applicable	Or other high resolution image acquistion device
Isoflurane	Baxter	KDG 9623
McPherson tying forceps	Bausch & Lomb	E1815 S
Micro tying forceps	Bausch & Lomb	63140
Minims tetracaine hydrochloride	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) Eye Drops
Neutral-buffered formalin	Bioreagens	0018-40
Normal saline solution	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl in injectable water
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010023	Balanced and buffered PBS pH 7.4
Petri dish 10 cm	Starstedt	83.3902
Petri dish 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal Tube 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	Or any eppendorf style tubes
TC plate 96-well	Starstedt	83.3924
Transfer pipette 3.5 mL	Starstedt	86.1171	Or any other Pasteur pipette style
Univentor 400 anesthesia unit	Univentor Limited	N/A	Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia
Wild M650 surgical microscope	Wild Heerbrugg	N/A	Or other surgical or magnifying stereoscope